一種復合載藥脂質體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種復合載藥脂質體及其制備方法和應用。該復合載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環脂質體為脂質體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇；該復合載藥脂質體的制備方法包括利用薄膜-超聲法將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復合載藥脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇。本發明的復合載藥脂質體除了對藥物敏感腫瘤的發展具有抑制活性外，還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發展，且產生的副作用較小，因此，具有極大的臨床應用價值。
【專利說明】一種復合載藥脂質體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種復合載藥脂質體及其制備方法和應用，更確切地涉及一種克服腫瘤耐藥性的復合載藥脂質體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]1、腫瘤耐藥性
[0003]目前，在許多腫瘤的治療中，常規化療效果差和預后不良是困擾臨床的重要難題，而腫瘤多藥耐藥性(MDR)則是腫瘤化療失敗的關鍵因素。經治療后.殘存的腫瘤干細胞耐藥性形成，常導致對某些藥物治療敏感性降低，并引起腫瘤復發甚至轉移。人惡性腫瘤對化療的耐藥性可分為先天性耐藥(nature resistance)和獲得性耐藥(acquired resistance)；根據耐藥譜又分為 原藥耐藥(primary drug resistance, F1DR)和多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)0 PDR只對誘導的原藥產生耐藥，面對其它藥物不產生交叉耐藥；MDR是由一種藥物誘發，但同時又對其它多種結構和作用機制迥異的抗癌藥物產生交叉耐藥。
[0004]耐藥性產生的機制有多種，如:
[0005]DNA修復能力的增強:化療藥致使DNA損傷，當二氫葉酸還原酶(DHFR)和DNA損傷修復相關酶活性增強(MGMT)可增加其對化療藥的耐藥程度。
[0006]P-糖蛋白表達:P-糖蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵，可以與一些抗腫瘤藥物結合，也有ATP結合位點。P-糖蛋白一旦與抗腫瘤藥物結合，通過ATP提供能量，就可將藥物從細胞內泵出細胞外，使藥物在細胞內濃度不斷下降，并使其細胞毒作用減弱直至散失，出現耐藥現象。P-糖蛋白在正常膽管、腎、小腸、腎上腺、造血干細胞等均有表達，負責激素運輸及排泌毒物等生理功能。P-糖蛋白高表達的腫瘤病人常伴預后不良，如低緩解率、高復發率、生存期短，可作為預后評價指標。
[0007]谷胱甘肽S-轉移酶:谷胱甘肽是一種含半胱氨酸的三肽，為細胞內主要的非蛋白巰基。谷胱甘肽S-轉移酶能夠催化機體內親電性化合物與GSH結合，使有毒化合物增加水溶性、減少毒性，最終排出細胞外。
[0008]2、蒽環類抗生素
[0009]蒽環類抗生素特別是阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病,對急性白血病(淋巴細胞性和粒細胞性)、惡性淋巴瘤、乳腺癌、支氣管肺癌(未分化小細胞性和非小細胞性)、卵巢癌等惡性腫瘤，一般作為第二線藥物，即在首選藥物耐藥時可考慮應用此藥。但是隨著腫瘤化療藥物在臨床治療中的廣泛應用，腫瘤的耐藥性問題越來越突出，已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一。而聯合用藥是目前克服腫瘤耐藥性的重要方法之一，也有很多相關研究。比如將阿霉素與維拉帕米聯合應用來逆轉耐藥性，參見文獻《阿霉素與維拉帕米聯合用藥與單一用藥的藥動學及組織分布比較》(安杰等，中國煤炭工業醫學雜志，2002.5 (6):600-601)、《新型阿霉素抗耐藥性隱形脂質體的體外細胞毒和體內毒性研究》(王堅成等，藥學學報，2005，40(5):475-480)。雖然這種聯合用藥有逆轉耐藥性的效果，但是所使用的逆轉劑維拉帕米是一種常用的鈣離子通道阻斷劑，具有引起心率增快，心力衰竭，低血壓等副作用，使此類聯合用藥的應用受到限制。
[0010]3、白藜蘆醇
[0011]20世紀80年代，世界衛生組織調查發現，盡管法國人偏愛奶酪等高脂肪食物，但冠心病發病率和死亡率低于其他西方國家，其原因可能是與法國人常飲含白藜蘆醇的葡萄酒有關。此后，白藜蘆醇備受關注。到目前為止至少已在21科、31屬的72種植物中發現了白藜蘆醇。白藜蘆醇主要來源于寥科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.etZucc.)的莖和根，葡萄科植物葡萄(Vitis vinifera)果實的皮和籽，豆科植物花生(Arachishypogaea)的種子等。 [0012]白藜蘆醇是一種天然無毒的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結和血管舒張，保持血液暢通，可預防癌癥的發生及發展，具有抗動脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用。此外，白藜蘆醇還具有保護心血管、抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌等作用，而且還有很多的臨床使用實例。

【發明內容】

[0013]本發明的目的是克服現有技術中蒽環類抗生素以及與其他抗癌藥聯合使用的蒽環類抗生素藥物對耐藥性腫瘤療效都較差的缺陷，提供一種對耐藥性腫瘤療效較好且產生的副作用較小的復合載藥脂質體及其制備方法和應用。
[0014]為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種復合載藥脂質體，其特征在于，該復合載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環脂質體為脂質體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000)修飾的脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇。
[0015]另一方面，本發明提供一種復合載藥脂質體的制備方法及由該方法制得的復合載藥脂質體，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復合載藥脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇。
[0016]再一方面，本發明還提供上述復合載藥脂質體在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0017]本發明的復合載藥脂質體含有蒽環類抗生素和白藜蘆醇，除了對藥物敏感腫瘤的發展具有抑制活性外，還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發展，且產生的副作用較小，因此，具有極大的臨床應用價值。
[0018]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中:
[0020]圖1a是本發明一種實施方式的復合載藥脂質體的透射電鏡圖，圖1b是本發明一種實施方式的復合載藥脂質體的粒徑分析結果圖；
[0021]圖2a顯示出本發明一種實施方式的復合載藥脂質體處理A549敏感細胞24小時后的結果，圖2b顯示出該復合載藥脂質體處理A549抗性細胞24小時后的結果；
[0022]圖3a顯示出本發明一種實施方式的復合載藥脂質體處理A549敏感細胞48小時后的結果，圖3b顯示出該復合載藥脂質體處理A549抗性細胞48小時后的結果；
[0023]圖4a顯示出本發明一種實施方式的復合載藥脂質體處理A549敏感細胞72小時后的結果，圖4b顯示出該復合載藥脂質體處理A549抗性細胞72小時后的結果；
[0024]圖5a顯示出本發明一種實施方式的載藥脂質體處理藥物敏感性肺腺癌荷瘤裸鼠后腫瘤的變化結果，圖5b顯示出本發明一種實施方式的載藥脂質體處理耐藥性肺腺癌荷瘤裸鼠后腫瘤的變化結果。
【具體實施方式】
[0025]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0026]本發明提供一種復合載藥脂質體，其特征在于，該復合載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環脂質體為脂質體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇。
[0027]根據本發明，所述藥物活性組分中，蒽環類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比可以在較寬的范圍內變化，例如，所述蒽環類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比可以為1:0.01-100 ;本發明的發明人發現，在一定濃度范圍內，隨著白藜蘆醇量的增加，其與蒽環類抗生素的協同作用也越來越顯著，優選地，所述蒽環類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:1-80，進一步優選為1:3-40，綜合考慮白藜蘆醇的協同作用和蒽環類抗生素的細胞毒性，最優選為1:5-20。本發明的發明人發現，使用上述優選比例范圍內的蒽環類抗生素和白藜蘆醇能夠獲得具有更高治療效果的復合載藥脂質體。
[0028] 根據本發明，所述蒽環類抗生素可以為本領域常用的各種蒽環類抗生素。由于蒽環類抗生素都具有7，8，9，10-四氫-5，12-四并苯醌的結構骨架，因此蒽環類抗生素能夠通過嵌入DNA雙鏈的堿基之間，形成穩定復合物，抑制DNA復制與RNA合成，從而阻礙快速生長的癌細胞的分裂，或者，抑制拓撲異構酶II，影響DNA超螺旋轉化成為松弛狀態，從而阻礙DNA復制與轉錄。優選情況下，所述蒽環類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。本發明的發明人發現，當使用阿霉素或鹽酸阿霉素作為本發明復合載藥脂質體的藥物活性組分之一時，能夠獲得更好的抗腫瘤活性。
[0029]本發明中，所述長循環脂質體與藥物活性組分的摩爾比可以與現有技術中脂質體載體與藥物活性組分的比例相同，優選地，所述長循環脂質體與藥物活性組分的摩爾比為I:0.001-0.5，進一步優選為 I:0.01-0.3，最優選為 I:0.02-0.1。
[0030]根據本發明，所述長循環脂質體可以與現有技術中的常規的長循環脂質體相同，其中，脂質體與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比可以在很寬的范圍內變化，例如可以為1:0.01-1，優選為1:0.02-0.2，進一步優選為1:0.05-0.1。
[0031]本發明提供一種復合載藥脂質體的制備方法，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復合載藥脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇。[0032]根據本發明的方法，所述藥物活性組分中，蒽環類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比可以根據需要進行調節，優選地，所述蒽環類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:0.01-100，進一步優選為1: 1-80，再優選為1: 3-40，最優選為1:5-20。
[0033]本發明中，所述蒽環類抗生素可以為本領域常用的各種蒽環類抗生素。由于蒽環類抗生素都具有7，8，9，10-四氫-5，12-四并苯醌的結構骨架，因此蒽環類抗生素能夠通過嵌入DNA雙鏈的堿基之間，形成穩定復合物，抑制DNA復制與RNA合成，從而阻礙快速生長的癌細胞的分裂，或者，抑制拓撲異構酶II，影響DNA超螺旋轉化成為松弛狀態，從而阻礙DNA復制與轉錄。優選情況下，所述蒽環類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。本發明的發明人發現，當使用阿霉素或鹽酸阿霉素作為本發明復合載藥脂質體的藥物活性組分之一時，能夠獲得更好的抗腫瘤活性。
[0034]本發明中，所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為可以為常規的脂質體載體與藥物活性組分的比例，優選地，所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為 I:0.01-1:0.001-0.5，進一步優選為 I:0.02-0.2:0.01-0.3，最優選為 I:0.05-0.1:
0.02—0.1
[0035]本發明中，所述脂質體源可以為本領域任何常規的能夠制得脂質體載體的物質，包括但不限于大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂中的至少一種，優選為大豆卵磷脂。本領域技術人員公知的是，所述脂質體源還可以包括一定量的膽固醇，上述磷脂與所述膽固醇的摩爾比可以在較寬范圍內選擇，例如，可以為2-10:1。
[0036]本發明中，所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、蒽環類抗生素和白藜蘆醇均可以通過商購獲得。
[0037]本發明中，所述薄膜-超聲法的具體步驟為本領域技術人員公知，即，將各種原料溶解后去除溶劑制成薄膜，然后通過超聲破碎制得顆粒。
[0038]優選地，所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括:頻率為100-800W，優選為200-400W ;超聲時間為5-30S，優選為10-20S ;間隔時間為2-20S，優選為5-10S ;循環次數為5-30次，優選為10-20次。其中，超聲時間指的是每次超聲持續的時間，即超聲時間不包括間隔時間。
[0039]具體地，所述薄膜-超聲法可以包括以下步驟，
[0040](I)將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、蒽環類抗生素、白藜蘆醇和第一有機溶劑混合，得到第一混合溶液；或者將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、白藜蘆醇和第一有機溶劑混合，得到第一混合溶液，
[0041](2)蒸發去除第一混合溶液中的第一有機溶劑，形成薄膜，
[0042](3)將所述薄膜與純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液，超聲得到所述復合載藥脂質體；或者將所述薄膜與溶有蒽環類抗生素的純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液，超聲得到所述復合載藥脂質體。
[0043]其中，所述第一有機溶劑可以為能夠溶解各種原料的溶劑，優選為無水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一種，最優選為無水乙醇。
[0044]所述蒸發的方法為本領域常規的方法，只要能夠將其中的第一有機溶劑去除即可，例如可以在旋轉蒸發儀中進行。[0045]所述第一有機溶劑的加入量可以為本領域的常規選擇，優選地，在第一混合溶液中，所述蒽環類抗生素的濃度為I X 10-4mOl/L-10mOl/L。
[0046]所述純水或生理鹽水的加入量也可以為本領域的常規選擇，優選地，在第二混合溶液中，所述蒽環類抗生素的濃度為lX10_5mOl/L-10mOl/L，進一步優選為lX10_3mol/L-lmol/L,最優選為 5X10 2mol/L_0.5mol/L。
[0047]本發明對于所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、蒽環類抗生素、白藜蘆醇和第一有機溶劑的混合方式沒有特別的限定，優選地，先將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有機溶劑混合，再加入白藜蘆醇，制備成第一混合溶液，揮發成薄膜后加入溶有蒽環類抗生素的第二溶液。其中，對于脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有機溶劑三者的加入順序沒有特別的限定。本發明的發明人發現，通過上述優選的方法，能夠得到治療效果更好的復合載藥脂質體。 [0048]本發明提供了由上述方法制得的復合載藥脂質體。
[0049]本發明還提供上述復合載藥脂質體在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明的所述復合載藥脂質體不僅適合于制備抗藥物敏感性腫瘤的藥物，還特別適合于制備抗耐藥性腫瘤的藥物。
[0050]所述腫瘤和耐藥性腫瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞癌、頭頸癌、食管癌、精原細胞瘤、肝癌、肺腺細胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤，以及它們的耐藥性腫瘤中的至少一種。
[0051]以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
[0052]以下通過實施例對本發明進行更詳細的說明。本發明的實施例中，所用大豆卵磷脂購自上海滬宇生化試劑有限公司，商品號為LE030A，CAS號為8002-43-5 ;所用蛋黃卵磷脂購自上海滬宇生化試劑有限公司，商品號為P0051 ;所用膽固醇購自湖北康寶泰精細化工有限公司，CAS號為57-88-5。所用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000購自genzyme公司，商品號為LP-R4-039, CAS號為147867-65-0 ;所用蒽環類抗生素為鹽酸阿霉素(ADR)，購自北京華奉聯博科技有限公司，CAS號為25316-40-9 ;所用白藜蘆醇(Res)購自湖北興銀河化工有限公司，CAS號為501-36-0。
[0053]實施例1
[0054]本實施例用于制備復合載藥脂質體:ADR+Res脂質體_1。
[0055](I)將4X 10_2mol大豆卵磷脂、10_2mol膽固醇、2X 10_3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與150ml的無水乙醇混合，溶解后加入1.2X 10_3mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0056](2)蒸發去除第一混合溶液中的無水乙醇，形成薄膜，
[0057](3)將3X 10_4mol蒽環類抗生素與5ml生理鹽水混合，加入所述薄膜中超聲得到復合載藥脂質體，即ADR+Res脂質體-1。
[0058]所述超聲的條件包括:頻率為350W，超聲18s，間隔8s，超聲15次。
[0059]實施例2[0060]本實施例用于制備復合載藥脂質體:ADR+Res脂質體_2。
[0061](I)將4X 10_2mol大豆卵磷脂、10_2mol膽固醇、2X 10_3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與200ml的無水乙醇混合，溶解后加入3.6X 10_3mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0062](2)蒸發去除第一混合溶液中的無水乙醇，形成薄膜，
[0063](3)將3X 10_4mol蒽環類抗生素與4ml生理鹽水混合，加入所述薄膜中超聲得到復合載藥脂質體，即ADR+Res脂質體_2。
[0064]所述超聲的條件包括:頻率為400W，超聲15s，間隔5s，超聲10次。
[0065]對比例I
[0066]根據實施例2的方法制備蒽環類抗生素載藥脂質體(ADR脂質體)，不同的是，不加入白藜蘆醇。
[0067]對比例2
[0068]根據實施例2的方法制備白藜蘆醇載藥脂質體(Res脂質體)，不同的是，不加入蒽環類抗生素。
[0069]對比例3
[0070]根據實施例2的方法，將4X l(T2mol大豆卵磷脂、l(T2mol膽固醇和2X l(T3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基`聚乙二醇2000與200ml的無水乙醇混合，制得長循環脂質體。
[0071]實施例3
[0072]本實施例用于制備復合載藥脂質體:ADR+Res脂質體_3。
[0073](I)將8X l(T2mol的大豆卵磷脂、2X l(T2mol膽固醇、2X l(T3mol的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與100ml的氯仿混合，溶解后加入6X 10_3mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0074](2)蒸發去除第一混合溶液中的氯仿，形成薄膜，
[0075](3)將3X 10_4mol蒽環類抗生素與3ml純水混合，加入所述薄膜中超聲得到復合載藥脂質體，即ADR+Res脂質體_3。
[0076]所述超聲的條件包括:頻率為300W，超聲20s，間隔10s，超聲20次。
[0077]實施例4
[0078]本實施例用于制備復合載藥脂質體:ADR+Res脂質體_4。
[0079](I)將0.4mol蛋黃卵磷脂、0.1mol膽固醇、2X 10_2mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與100ml的無水乙醇混合，溶解后加入1.2 X IO^mol白藜蘆醇，得到第一混合溶液，
[0080](2)蒸發去除第一混合溶液中的無水乙醇，形成薄膜，
[0081](3)將3X 10_4mol蒽環類抗生素與2ml生理鹽水混合，加入所述薄膜中超聲得到復合載藥脂質體，即ADR+Res脂質體_4。
[0082]所述超聲的條件包括:頻率為500W，超聲10s，間隔5s，超聲12次。
[0083]測試例I
[0084]用透射電鏡(型號為Tecnai G2F20U-TWIN)對ADR+Res脂質體_3進行檢測，結果如圖1a所示，由圖1a可以看出，復合載藥脂質體形成了較為均一的直徑為50-80nm的顆粒。[0085]用納米粒度及Zeta電位分析儀(型號為Zetasizer Nano ZS)對液態ADR+Res脂質體-3粒徑進行進一步的檢測，結果如圖1b所示，由圖1b可以進一步看出，復合載藥脂質體形成了較為均一的顆粒。
[0086]測試例2
[0087]本測試例用于在細胞水平上檢測本發明的復合載藥脂質體的活性。
[0088]細胞實驗1:在96孔板中接種A549敏感細胞(人肺腺癌細胞)，接種量為5000個細胞/孔，細胞貼壁后加藥，根據藥物的不同分為5組，分別是:
[0089](I)生理鹽水組；
[0090](2)脂質體組(單獨加入對比例3制得的長循環脂質體)；
[0091](3)蒽環類抗生素脂質體組(加入對比例I制得的ADR脂質體)，其中，蒽環類抗生素在培養基中的終濃度為5 μ g/ml ；
[0092](4)白藜蘆醇脂質體組(加入對比例2制得的Res脂質體)，其中，白藜蘆醇在培養基中的終濃度為lSyg/ml ；
[0093](5)同時包裹蒽環類抗生素和白藜蘆醇的脂質體組(ADR+Res脂質體)，其中，包括4個小組，分別加入實施例1-4制得的ADR+Res脂質體-1、ADR+Res脂質體-2、ADR+Res脂質體-3和ADR+Res脂質體_4，其中，各組中蒽環類抗生素在培養基中的終濃度均為5 μ g/ml,而白藜蘆醇的終濃度分別是5,15, 25, 50 μ g/ml,每個濃度6個重復孔；
[0094]其中，(2)組中的脂質體加入量和(5)組中加入ADR+Res脂質體_2的脂質體加入量相同。在加藥24h，48h，72h后用MTS試劑盒檢測OD值。
[0095]細胞實驗2:根據與細胞實驗I相同的方法進行檢測，不同的是，接種A549蒽環類抗生素抗性細胞。
[0096]細胞實驗的結果如圖2a-2b、3a_3b和4a_4b所示。
[0097]圖2a和圖2b為處理24小時后的結果，其中，縱軸表示測得的OD值，其反映出存活細胞的數量，各組柱狀圖反映出生理鹽水組、脂質體組、蒽環類抗生素脂質體組、白藜蘆醇脂質體組，以及ADR+Res脂質體-1至ADR+Res脂質體_4中的一組的測試結果(橫軸表示白藜蘆醇在培養基中的終濃度，從左至右依次為ADR+Res脂質體-1至ADR+Res脂質體-4的測試結果)。圖2a為對A549敏感細胞的檢測結果，圖2b為對蒽環類抗生素耐藥性肺腺癌細胞(A549抗性細胞)的檢測結果。圖2a中，加入不同濃度的白藜蘆醇的ADR+Res脂質體-1至ADR+Res脂質體-4對肺腺癌細胞的抑制活性與單獨使用蒽環類抗生素的抑制活性接近，甚至在加入低濃度的白藜蘆醇時，ADR+Res脂質體-1至ADR+Res脂質體-4的抑制活性還差于單獨使用蒽環類抗生素的效果。但是從圖2b中可以看出，蒽環類抗生素脂質體對于蒽環類抗生素耐藥性腫瘤細胞幾乎不再具有抑制活性，而根據本發明的復合載藥脂質體ADR+Res脂質體-1至ADR+Res脂質體-4均具有明顯的癌細胞抑制活性。并且，隨著白藜蘆醇濃度的增加，其抑制活性越來越顯著。
[0098]圖3a和圖3b為處理48小時后的結果，其中，圖3a為對A549敏感細胞的檢測結果，圖3b為對A549抗性細胞的檢測結果。圖3a和圖3b與圖2a和圖2b的結果類似，加入不同濃度的白藜蘆醇的ADR+Res脂質體-1至ADR+Res脂質體-4對肺腺癌細胞的抑制活性與單獨使用蒽環類抗生素的抑制活性接近，但是，蒽環類抗生素脂質體對于蒽環類抗生素耐藥性腫瘤細胞幾乎不再具有抑制活性，而根據本發明的ADR+Res脂質體-1至ADR+Res脂質體-4均具有明顯的癌細胞抑制活性。[0099]圖4a和圖4b為處理72小時后的結果，其中，圖4a為對A549敏感細胞的檢測結果，圖4b為對A549抗性細胞的檢測結果。圖4a和圖4b與上述兩組圖的結果也類似，相比于圖3a和圖3b，圖4a和圖4b中的存活細胞的數目進一步下降。
[0100]由上述結果可以看出，本發明的復合載藥脂質體特別適合于抑制蒽環類抗生素抗性腫瘤細胞的發展和繁殖，并且具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性，在處理72小時后，仍有明顯的抗腫瘤活性，說明本發明的復合載藥脂質體的抗腫瘤活性持久。
[0101]測試例3
[0102]本測試例用于在動物水平上檢測本發明的載藥脂質體對蒽環類抗生素耐藥的肺腺癌的抑制活性。
[0103]動物實驗:通過皮下注射分別將A549藥物敏感及抗性細胞接種至16gBalb/c的裸鼠中，IO7個細胞/只，當腫瘤長至3mm時打藥，將藥物敏感瘤小鼠及抗性瘤小鼠分別隨機分為5組:
[0104](I)生理鹽水組，
[0105](2)脂質體組(注射對比例3制得的脂質體)，
[0106](3)蒽環類抗生素脂質體組(注射對比例I制得的ADR脂質體，注射量為8mg/kg體重)，
[0107](4)白藜蘆醇脂質體組(注射對比例2制得的Res脂質體，注射量為20mg/kg體重)，
[0108](5)同時包裹蒽環類抗生素和白藜蘆醇的脂質體組(注射實施例2制得的ADR+Res脂質體)，每天腹腔注射，蒽環類抗生素注射量為8mg/kg體重，白藜蘆醇注射量為20mg/kg體重。
[0109]其中，(2)組中的脂質體注射量與(5)組相同。注射2周后取出腫瘤照相，結果如圖5a，5b所示(每組三個平行實驗)。
[0110]由圖5a可以看出，與生理鹽水組相比，單獨使用白藜蘆醇脂質體對腫瘤無明顯抑制作用，使用本發明的ADR+Res脂質體-2與單獨使用蒽環類抗生素脂質體則都可以顯著抑制肺腺癌的增長，但是本發明的ADR+Res脂質體-2產生的抑制效果更加顯著。由圖5b可以看出，與生理鹽水組相比，單獨使用蒽環類抗生素脂質體和單獨使用白藜蘆醇脂質體雖然對蒽環類抗生素耐藥的肺腺癌細胞產生了一定的抑制作用，但是本發明的ADR+Res脂質體-2對蒽環類抗生素耐藥的肺腺腫瘤產生的抑制作用更加顯著。
[0111]動物實驗結果進一步證明了本發明的載藥脂質體對敏感性及耐藥性腫瘤均具有強的抑制活性。
【權利要求】
1.一種復合載藥脂質體，其特征在于，該復合載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分，所述長循環脂質體為脂質體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇。
2.根據權利要求1所述的復合載藥脂質體，其中，所述藥物活性組分中，蒽環類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:0.01-100，優選為1:1-80O
3.根據權利要求1或2所述的復合載藥脂質體，其中，所述蒽環類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。
4.根據權利要求1所述的復合載藥脂質體，其中，所述長循環脂質體與藥物活性組分的摩爾比為1:0.001-0.5。
5.根據權利要求1或4所述的復合載藥脂質體，其中，所述長循環脂質體中，脂質體與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比為1:0.01-1。
6.一種復合載藥脂質體的制備方法，其特征在于，該方法包括，利用薄膜-超聲法，將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述復合載藥脂質體，所述藥物活性組分為蒽環類抗生素和白藜蘆醇。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述藥物活性組分中，蒽環類抗生素和白藜蘆醇的摩爾比為1:0.01-100，優選為1:1-80O
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中，所述蒽環類抗生素為阿霉素或鹽酸阿霉素。
9.根據權利要求6所述的方法，其中，所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為1:0.01-1:0.001-0.5。`
10.根據權利要求6所述的方法，其中，所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括，頻率為100-800W，超聲時間為5-30S，間隔時間為2-20S，循環次數為5-30次。
11.由權利要求6-10中任意一項所述的方法制得的復合載藥脂質體。
12.權利要求1-5和11中任意一項所述的復合載藥脂質體在制備抗腫瘤藥物中的應用。
13.根據權利要求12所述的應用，其中，所述腫瘤為耐藥性腫瘤。
【文檔編號】A61K31/05GK103655474SQ201210335727
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月11日 優先權日:2012年9月11日
【發明者】孟潔, 楊先達, 王琛 申請人:國家納米科學中心