專利名稱：一株柵藻及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域,尤其涉及一種柵藻ENN32 (Scenedesmus sp.)及其應用。
技術背景
隨著世界化石燃料儲備量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不斷增加以及全球氣候的日益趨暖，人類的生存和發展狀況已經面臨前所未有的挑戰。因此，世界各國都在積極尋找能夠替代石油產品的可再生能源，其中，生物柴油就是一種重要的生物能源，然而，常見的油料作物例如玉米和大豆等培育周期較長，占用農田較多，會產生“與人爭糧，與糧爭地” 問題，從而導致“解決了能源危機，卻出現糧食危機”的尷尬結果。
微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛，營養豐富，生長周期短，光合利用度高的以光合自養產生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最廣、種類和數量最大的生物質資源。在一定條件下許多微藻能夠在細胞中大量積累儲藏性三酰甘油(微藻油)(類似于植物油)，其最高含量可達到細胞干重的50%以上。與高等陸生油料作物相比，微藻的單位面積油產量是油料植物油產量的數十倍，經過生物冶煉可以生產生物柴油等多種生物燃料， 被認為是最有可能最有潛力成為石油替代品的生物質資源。
除了油產量非常高之外，微藻還富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、各種氨基酸、維生素、抗生素、高不飽和脂肪酸以及其它多種生物活性物質，因此，在保健食品、醫藥和飼料等領域也同樣具有很好的開發前景，例如，用于食料和醫藥業(人和動物的營養補充物維生素、蛋白質、脂肪酸、多糖等)；提取化工產業如化妝品、精細化工產品等；作為能源產生沼氣、燃料；用于餌料和飼料業(魚蝦、甲殼動物等水產動物的餌料(CN1742570)、家禽飼料等)；農業上作為土壤調節劑、肥料等。
此外，微藻的環境適應能力非常強，對營養的要求也很簡單，可在各種嚴苛環境下生長。例如,微藻可通過光合作用吸收污水中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、磷酸鹽等無機鹽的氮磷合成氨基酸、蛋白質、磷脂等有機物，形成微藻細胞，從而降低水體中的氮磷含量，因此微藻可用于去除污水中的氮磷。微藻還可利用工業廢氣中的CO2，減少CO2的排放。因此微藻在無論是工業環境保護方面還是城市環境保護方面也都有很好的應用前景。還有一些微藻可以生長在高鹽、高堿環境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙漠等不適宜進行耕種的土地進行大規模培養，也可利用海水、鹽堿水、工業廢水等非農用水進行培養，被譽為可循環的“綠色油田”，因此發展微藻培養及其相關工業也非常適合土地尤其是耕地資源相對緊缺的我國。
目前國內外都積極開展了對于微藻的開發尤其是其在生物能源應用方面的開發， 這其中以對小球藻的研究居多。CN101460609公開了一種新的小球藻屬(CHL0RELLA)物種及其應用CN101565675公開了一種小球藻及其培養方法和它在生物柴油生產中的應用； CN101824386公開了一株小球藻，及其在生產微藻油脂和固定CO2中的應用；CN102093955 公開了一株小球藻及其在利用污水培養與生物柴油轉化體系中的應用；CN102229889公開了一株小球藻及其培養方法和在CO2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質、色素、淀粉、多糖、核酸等生物質的生產應用。此外，對于微藻應用的相關研究也在進行當中，CN101767893公開了一種利用微藻深度處理污水耦合生產生物油的裝置及方法。可以說微藻在能源以及環境領域中的大規模應用已經指日可待。
柵藻是淡水中常見的浮游微藻，極喜在營養豐富的靜水中繁殖。許多種類對有機污染物具有較強的耐性，在水質評價中可作為指示生物，并且在水體自凈和污水凈化中有一定作用，是有機污水氧化塘生物相中的優勢種類。它可與細菌同時附著在水中有機物碎片和其他水生植物體上，形成膠質層，吸附有機物。柵藻進行光合作用時，一方面產生氧氣供細菌分解有機質的需要，另一方面還可直接利用有機質作為碳源和氮源，使水中有機物迅速降解，從而凈化水體。柵藻細胞內含有豐富的蛋白質和維生素，是魚類很好的飼料，如利用有機污水氧化塘養魚，可獲高產。大量繁殖的藻體也可作家禽的飼料。目前國內外對于柵藻的開發還不是很多，CN101565674公開了一株低營養柵藻及其在污水深度處理中的應用，該柵藻藻株可在低營養環境中生長，因此可將二級出水中的氮磷去除到很低水平； CN102083957公開了一種具有高效去除二氧化碳特征性的凸頭狀柵藻原變種微藻及其用途，尤其是二氧化碳固定率高的凸頭狀柵藻原變種微藻及其用途；CN102250773公開了一株柵藻及其培養方法和在CO2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質、色素、淀粉、多糖、核酸等生物質的生產等領域中的應用；季祥、王金榮等人(一株斜生柵藻的篩選及生長條件的優化[J]。水產科技情報，2010:37 ￠))獲得了一株含油相對較高、長勢較好的藻種柵藻藻株。
盡管微藻具有非常良好的能源、環境保護甚至醫藥等開發前景，并且相關的研究工作也已經逐漸展開，但是目前已知的微藻，尤其是柵藻，含油量通常在40%以下、對CO2的處理能力、極端環境耐受等方面的性能上還普遍偏低。因此需要性能更好，更適于工業應用的柵藻。發明內容
本發明的目的在于提供一種對環境適應能力強，油脂含量高，對CO2的處理能力強的更加適于工業應用的柵藻。
為達此目的，本發明采用以下技術方案
在第一方面,本發明提供了一種柵藻ENN32 (Scenedesmus sp.),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年07月13日，保藏號為 CGMCC No. 6346。
本發明提供的柵藻ENN32中脂肪酸在藻粉中的含量可以大于40%干重，優選地大于50%干重，更優選地為51% 60%干重。
本發明提供的柵藻ENN32的耐受溫度可以為_10°C至44°C，優選地(TC至40°C，更優選地10°C至35°C，還更優選地20°C至30°C，最優選地25°C。
本發明提供的柵藻ENN32可以在(rC、ΓC、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、 10 0C > 110C >12 0C > 13 0C、14 °C、15 °C、16 °C、17 °C、18 °C、19 °C、20 °C、21 °C >22 °C >23 °C >24 °C、 25°C、26°C、27t、28t、29t、3(rC、3rC、32t、33t、34t、35t、36t、37t、38t、39t或 40°C下生長。
在第二方面，本發明提供了如第一方面所述的柵藻ENN32的培養方法，所述方法包括將柵藻藻株ENN32綠色細胞接種在BGll培養基中，其中光照強度50-500 μ mol/m2. s,優選 100-450 μ mol/m2. S、更優選 150-400 μ mol/m2. S、還更優選 200-350 μ mol/m2. S、最優選 250-300 μ mol/m2· s，pH 值 6-10、優選 7_9，更優選 7. 5-8. 5，最優選 8，溫度 10_40°C，優選 15-35°C、更優選 20-30°C、最優選 25°C。
在本發明的柵藻ENN32的培養方法中，光照強度可以為50 μ mol/m2· s、80 μ mol/ m2. s> 100 μ mol/m2. s> 120 μ mol/m2. s> 150 μ mol/m2. s、180 μ mol/m2· s>200 μ mol/m2. s、 220 μ mol/m2. s、250 μ mol/m2. s、280 μ mol/m2. s、300 μ mol/m2. s、320 μ mol/m2. s、350 μ mol/ m2. s、380 μ mol/m2. s、400 μ mol/m2. s、420 μ mol/m2. s、450 μ mol/m2. s、480 μ mol/m2. s 或 500 μ mol/m2. s ;pH值可以為 6、6· 5、7、7· 2、7· 5、7· 8、8、8. 2、8· 5、8· 8、9、9· 5 或 10 ;溫度可以為 10Ul>12U3U4U5oC>16oC>17oC>18oC>19oC>20oC>2rC>22oC>23oC>24oC>25oC>26°C> 27。。、28。。、29。。、30。。、31。。、32。。、33。。、34。。或 35。。。
在第三方面，本發明提供的柵藻ENN32含有蝦青素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和角黃素。
本發明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ32在脂肪酸生產中的應用，優選地，所述脂肪酸是豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、 α -亞麻酸、Y -亞麻酸、花生酸和/或山崳酸。
在第四方面，本發明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ32在生物燃料生產中的應用，優選地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
在第五方面，本發明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ32在環境保護中的應用， 優選地所述環境保護為污水處理或CO2減排，所述污水處理包括污水的脫氮、除磷、有機物降解和/或重金屬離子吸附。
在第六方面，本發明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ32在豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、花生酸、 山崳酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和/或角黃素的藥物的制備中的用途。
在第七方面，本發明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ32在包含豆蘧酸、棕櫚酸、 棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、花生酸、山崳酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和/或角黃素的食品、保健品、飼料和/或水產品餌料生產中的用途。
在第八方面，本發明提供了如第一方面所述的柵藻ΕΝΝ32在包含豆蘧酸、棕櫚酸、 棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、花生酸、山崳酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和/或角黃素的化妝品或色素生產中的應用。
在本發明中，BGll培養基為本領域中最常用的藻類培養基，其具體組分見下文。
本發明的有益技術效果為
I、本藻種生長速度快，CO2利用率高，且細胞沉降性好，便于收集，適宜于高密度養殖，適合產業化推廣
2、本藻種油脂積累快，含油量高，適合用來生產生物柴油
3、本藻種能有效去除水中的氮，適宜用于廢水處理
4、本藻種本藻種溫度耐受范圍廣泛，適合全年養殖。


圖I是本發明的柵藻ENN32在顯微鏡下的鏡檢圖片。圖2顯示本發明的柵藻ENN32的ITS部分序列及5. 8S序列在GenBank數據庫中比對的結果。
進行BLAST
圖3是采用鄰位相連(Neighbor-joining)算法構建的柵藻ENN32的系統發育進
化樹。
圖4是本發明的柵藻ENN32的室內培養生長曲線
圖5是本發明的柵藻ENN32在高溫條件下的生長曲線。圖6是本發明的柵藻ENN32在低溫條件下的生長曲線
圖7是本發明的柵藻ENN32中所含色素的色譜圖。圖8是表示本發明的柵藻ENN32中各色素的含量的柱形圖。
具體實施方式
下面結合附圖并通過具體實施方式
來進一步說明本發明的技術方案。
實施例I篩選柵藻藻株
取無菌水稀釋后的從內蒙古烏蘭察布地區取的土樣，加入BGll培養基進行富集培養，在400倍顯微鏡觀察后，大約細胞濃度為800—1200個/ml，用毛細管取大約Iul的藻液，接種于48孔裝有BGll培養基的培養板中，在25°C、光照強度為50umol/m2. s情況下進行培養，當達到一定細胞濃度時，顯微鏡觀察，選擇只有單藻株的孔，稀釋至細胞濃度為 1000-3000個/ml后鋪平板，得到單藻株。
實施例2鑒定藻種及其在進化樹上的分類
藻株鑒定采取形態鑒定和分子鑒定相結合的方法。
I.形狀鑒定(見圖I):對上述分離出來的藻株ENN32在1000倍顯微鏡進行觀察，藻體為單細胞形態存在，細胞壁平滑，單細胞呈橢圓形。細胞長徑8-10 μ m,短徑 6-8 μ m0色素體周生，片狀，具蛋白核一枚，無性繁殖產生似親孢子。檢索《中國淡水藻類一系統、分類及生態》，發現此藻在形態上分類相同的為綠藻門(ChlOTophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目(Chlorococcales)、棚藻科(Scenedesmaceae)、棚藻屬 (Scenedesmus)。
2.分子鑒定
A，從分離的ENN32擴增其ITS及18S部分核苷酸序列
用CTAB法提取培養4天的ENN32藻基因組DNA。取一定量的細胞，研磨處理后加入適量CTAB緩沖液，勻漿，加入等體積的酚氯仿抽提，等體積異丙醇沉淀，75 %乙醇洗滌后溶于一定體積滅菌雙蒸水中，紫外分光光度計檢測其濃度和純度。
ITS序列擴增采用真核生物ITS擴增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。
引物I 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’ (SEQ ID NO: I)
引物2 5，GCATATCAATAAGCGGAGGA 3，(SEQ ID NO:2)
取I μ I總DNA為模板。擴增條件如下94°C變性5min，然后94°C 40s, 56°C 40s， 72°C 2min 30個循環，最后72°C IOmin0 I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增產物，PCR擴6增獲得約750bp片斷。序列如下(下劃線部分為引物序列)
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGGTTTTCCCCCCGCTTATTGATATGCTTAA
GTTCAGCGGGTAGCCTTGCCTGAGCTCAGGTCGAAAGTTTAGACATACCAT
AGGTATGTTCCTGCTTGGCTCCTAGCAAGATCCACAAGCAACAACTTCGTG
TAGTCGGCAGAAGCCGGTGCTACCTATCCAGTTGAAGCCCATACGGGTCC
TTGCTTAAGCCTCTGCACTTCAGCCAACCCAATCCGCAGTAAAGCAGATTG
GGGAAGCCAGATCCACCCCAATGGCCAGCTAGAGAAGCCGACACACCCA
ACAAGTTGGGAGGGGTGAGGGTGTAAACCGACGCTGAGGCAGACATGCT
CTTGCCCGAAGGCTCGAGCGCAATATGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCACG
GAATTCTGCAATTCACACTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGTTG
CGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTGTCTTTGGTTAAGATTGCCAG
TTACTAGCAATCACAACTTCAGAGTTTAGTTTTAACAGTGGTTAGCACTGG
TGTATAGTCATGCCAAGGCGCCACTGAGCAGGCAGCAATGCCCACCCAGC
TGTGAGATGCGAGCGGGTTTTAAGCCGAACGCCCCACTGGCAAGCCAAGG
CACGGAACGTTGAGGTTCACATTGTGGTTTTAATAATTCAATGATCCCTCCG
CAGGTTCACCTACGGAGACCTTGTTTACGACTTTTACTTTCCATTCCTCCGC
TTATTGATATGC(SEQ ID NO:3)。
B，所克隆的核苷酸序列同源性搜索
將獲得的ENN32的ITS部分序列及5. 8S序列登錄GenBank數據庫進行BLAST比對，結果顯示與 ACCESSION 號為 DQ417571. I 的 Scenedesmus sp. Isolate pic 6/16T-1W 的 18S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2sequence 具有較高的相似性達91%，覆蓋率92% (圖2)。
C，根據上述序列作出進化樹，見圖3。
利用NCBI數據庫中的BLAST工具對藻株ENN32的ITS部分序列進行序列相似性分析。選取部分同源序列和該藻株的ITS部分序列利用ClustaLx軟件包進行序列同源進化比對，形成一個多重序列匹配排列矩陣。然后，運用Mega4. O軟件，采用鄰位相連 (Neighbor-joining)算法，自展數據集bootstraps值為1000構建系統發育進化樹(見圖 3)。
根據形態和ITS blast的結果，限定ENN32為柵藻屬(Scenedesmus)。發明人已將所述藻株于2012年7月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，簡稱CGMCC)，其保藏號為CGMCC No. 6346。
實施例3ENN32柵藻的室內養殖及油脂積累
將處在對數生長期的柵藻藻株ENN 32綠色游動細胞接種在配制好的BGll培養基(配方見表I)中，使細胞密度達到OD75tl為0. 2-0. 8之間。培養過程光照強度控制在 50-500umol/m2. s，在培養期內，通過向培養液中通入I. 5_2%的二氧化碳和空氣的混合氣體，將培養基的PH值調節在7-9之間，溫度調控在15-35°C范圍內。培養所使用的反應器為 40_內徑、長度600_的柱式反應器。培養過程中，定時取樣測定干重，結果見圖4。培養進行到第16天，藻液顏色變黃時，將藻液收集，通過離心或自然沉降的方法獲得藻泥，將藻泥在進行真空冷凍干燥。
表IBGll培養基配方
權利要求
1.一種柵藻ENN32 (Scenedesmus sp.),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2012年07月13日，保藏編號為CGMCC No. 6346。
2.根據權利要求I所述的柵藻ENN32，其特征在于，所述柵藻ENN32中脂肪酸的重量百分比含量為大于40%干重，優選地大于50%干重，更優選地為51% 60%干重。
3.根據權利要求I所述的柵藻ENN32，其特征在于，所述柵藻ENN32的耐受溫度為0°C至40°C，優選地10°C至35°C，更優選地20°C至30°C，最優選地25°C。
4.根據權利要求I所述的柵藻ENN32，其特征在于，所述柵藻ENN32含有蝦青素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和角黃素。
5.如權利要求I至4中任一項所述的柵藻ΕΝΝ32的培養方法，所述方法包括將柵藻藻株ΕΝΝ32綠色細胞接種在BGll培養基中，其中光照強度50-500 μ mol/m2. s,優選100-450 μ mol/m2. S、更優選 150-400 μ mol/m2. s、還更優選 200-350 μ mol/m2. S、最優選250-300 μ mol/m2. s，pH 值 7-9、優選 7. 5-8. 5，更優選 8，溫度 15-35°C、優選 20_30°C、更優選 25°C。
6.如權利要求I至4中任一項所述的柵藻ENN32在脂肪酸生產中的應用，優選地，所述脂肪酸是豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳ニ烯酸、十八碳四烯酸、α -亞麻酸、Y -亞麻酸、花生酸和/或山崳酸。
7.如權利要求I至4中任一項所述的柵藻ΕΝΝ32在生物燃料生產中的應用，優選地，所述生物燃料是生物柴油或生物こ醇。
8.如權利要求I至4中任一項所述的柵藻ΕΝΝ32在環境保護中的應用，優選地所述環境保護為污水處理或CO2減排，所述污水處理包括污水的脫氮、除磷、有機物降解和/或重金屬離子吸附。
9.如權利要求I至4中任一項所述的柵藻ΕΝΝ32在制備包含豆蓮酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳ニ烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、花生酸、山崳酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和/或角黃素的藥物中的應用。
10.如權利要求I至4中任一項所述的柵藻ΕΝΝ32在包含豆蓮酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳ニ烯酸、十八碳四烯酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、花生酸、山崳酸、蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和/或角黃素的食品、保健品、飼料、水產品餌料、化妝品和/或色素生產中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種柵藻(Scenedesmus sp.)及其應用，本發明的柵藻具有生長速度快、油脂積累快、含油量高、能夠有效去除水中的含氮化合物等優點，并且含有適合部分有益的色素，可用于生物柴油、食品、保健品、飼料、水產品餌料、藥物以及化妝品的生產。
文檔編號A61K36/05GK102978114SQ20121034208
公開日2013年3月20日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者羅少敬, 鄧平, 張曉楠, 吳洪, 王冰 申請人:新奧科技發展有限公司