一種高油脂含量的四尾柵藻及其構建方法
【專利摘要】一種高油脂含量的四尾柵藻及其構建方法。它涉及一種高油脂含量的微藻及其構建方法。它解決了現有四尾柵藻含油量低，影響生物柴油產量的問題。高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。構建方法：一、構建質粒pMD-DGAT1；二、獲得重組質粒pBI121-DGAT1；三、電擊轉化；四、黑暗環境培養。本發明可用于水處理和生物柴油生產領域。
【專利說明】一種高油脂含量的四尾柵藻及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高油脂含量的微藻及其構建方法。
【背景技術】
[0002]生物柴油具有能量高、燃燒充分、潤滑性好、含硫量低等優良性能，還具有儲運安全、抗爆性能好、易生物降解等特點，可作為優質的化石能源替代品然而傳統的生物柴油以大豆、玉米、棕櫚樹、麻風樹等農作物為原料，由于原料成本占到生產生物柴油總成本的70%~85%這不僅導致糧食價格上漲也大大增加了生產成本。[0003]我國大慶地區地熱水資源較為豐富，地熱水是從地表滲透或地下抽取上來，可直接地用于溫泉沐浴、采暖、理療等方面。使用后的地熱廢水，大多不經處理而直接排入附近的溝渠之中。大慶地區地熱水中的含鹽量比較高，而且還含有氟、砷、汞等有害的化學成分，尤其是氟，其含量最高達6mg/L左右。地熱廢水若不經過適當處理而隨意排放，廢水中較高含鹽量會造成土壤鹽堿化加重，并且其中的氟及其它有害成分就會因為滲透、遷移、富集作用而造成土壤侵蝕、地下水污染等許多環境問題，甚至進入食物鏈直接危害人體健康。
[0004]微藻環境適應能力強、種類繁多、生長周期短、光合效率高，可以利用地熱廢水培養微藻生產生物柴油，即可實現廢水凈化，又能生產生物柴油，可謂是一舉兩得。
[0005]四尾柵藻學名Scenedesmus quadricauda,柵藻科,柵藻屬，是淡水中常見的浮游藻類，分布極廣，極喜在營養豐富的靜水中繁殖，夏秋可大量繁殖，繁殖速度快；對有機污染物具有較強的耐性，是乙型中污帶的指示種，能耐受高氟、砷、汞等有害的化學成分。因此四尾柵藻是利用大慶地區地熱水資源制備生物柴油的合適微藻。但是四尾柵藻本身含油量低，所以導致利用四尾柵藻生產生物柴油的產量一直受到影響。

【發明內容】

[0006]本發明是為了解決現有四尾柵藻含油量低，影響生物柴油產量的問題，而提供的一種高油脂含量的四尾柵藻及其構建方法。
[0007]本發明高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGATl基因，人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]上述高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構建:
[0009]一、用質粒pMD19-T載體和人工DGATl基因構建質粒pMD-DGATl ；
[0010]二、提取質粒pMD-DGATl和質粒pBI121分別用Xba I和BamH I進行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI121，獲得重組質粒 pBI 121-DGATI ；
[0011]三、取培養至對數中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細胞并用預冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細胞密度達到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質粒pBI121_DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續時間為2ms的脈沖電擊；
[0012]四、將步驟三電擊轉化的四尾柵藻細胞用微藻培養液清洗兩次，再置于微藻培養液中于22~25°C黑暗環境中培養24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；
[0013]其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]本發明高油脂含量的四尾柵藻的油脂含量達細胞干重的11.8%，是未基因重組的四尾柵藻的油脂含量的近2倍，可顯著提高用四尾柵藻的生物柴油產量，為工業化生物柴油生產奠定了基礎。而且，本發明高油脂含量的四尾柵藻對地熱廢水中的污染物具有良好的耐受性和去除率，特別是是對氟的去除率更是達到了 81%。
【具體實施方式】
[0015]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。[0016]【具體實施方式】一:本實施方式高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGATl基因，人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0017]本實施方式對天然紫蘇的DGATl基因進行了人為的改造，與天然紫蘇DGATl基因的同源性為97%。
[0018]【具體實施方式】二:本實施方式高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構建:
[0019]一、用質粒pMD19-T載體和人工DGATl基因構建質粒pMD-DGATl ；
[0020]二、提取質粒pMD-DGATl和質粒pBI121分別用Xba I和BamH I進行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI121，獲得重組質粒 pBI 121-DGATI ；
[0021]三、取培養至對數中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細胞并用預冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細胞密度達到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質粒pBI121_DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續時間為2ms的脈沖電擊；
[0022]四、將步驟三電擊轉化的四尾柵藻細胞用微藻培養液清洗兩次，再置于微藻培養液中于22~25°C黑暗環境中培養24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；
[0023]其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0024]利用天然紫蘇的DGATl基因(紫蘇DGATl基因的cDNA序列如SEQ ID N0:2所示)介導轉化的四尾柵藻發生基因沉默，并沒有獲得油脂含量提高的四尾柵藻。當然轉基因微藻中的外源基因沉默是常見問題，也是主要難題，其原因可能是外源基因在受體細胞中出現轉錄、翻譯及修飾等多方面的問題，任何一步中出現差錯均可能導致外源基因沉默。而且即使是成功的將與微藻油脂合成主要限速酶轉化到微藻中也未必可以提高微藻的油脂含量，如Dunahay等人成功地將編碼乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因轉化到硅藻中，使得硅藻中ACCase的活性提高到對照組的2~3倍，然而微藻的油脂含量并沒有顯著增加。
[0025]本實施方式對天然紫蘇的DGATl基因進行了人為的改造，與天然紫蘇DGATl基因的同源性為97%。采用本實施方式構建的高油脂含量的四尾柵藻，可以明顯提高四尾柵藻的油脂含量，為工業化四尾柵藻生產生物柴油的實現奠定了基礎。
[0026]本實施方式中利用載體pBI 121構建的重組質粒PBI121-DGAT1中包含CaMV35S啟動子。
[0027]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】二的不同點是:步驟二用獲得的重組質粒PBI121-DGAT1轉化感受態細胞大腸桿菌DH5 α，然后進行藍白斑篩選，挑選白色菌落進行PCR驗證和酶切驗證。其它步驟及參數與實施方式二相同。
[0028]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】二或三的不同點是:步驟三中滲透液中甘油的體積濃度為10%、甘露醇的濃度為0.2mol/L、山梨醇的濃度為0.2mol/L。其它步驟及參數與實施方式二或三相同。
[0029]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】二、三或四的不同點是:步驟三中鮭精DNA的終濃度為25 μ g/mL。其它步驟及參數與實施方式二、三或四相同。
[0030]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】二至五之一的不同點是:步驟四中微藻培養液為BGll液體培養基。其它步驟及參數與實施方式二至五之一相同。
[0031]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】二至六之一的不同點是:步驟四中將獲得的高油脂含量的四尾柵藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BGll固體培養基平板上，未加重組質粒的四尾柵藻同樣處理作為對照；15天后挑取在卡那霉素固體培養基平板上長出的轉化子四尾 柵藻群落轉接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液體培養基中，繼續培養15天后轉接到沒有抗生素的固體培養基上，隔代在抗生素與無抗生素的培養基中進行交替培養，獲得性狀穩定的高油脂含量的四尾柵藻。其它步驟及參數與實施方式二至六之一相同。
[0032]實施例1
[0033]高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構建:
[0034]一、用質粒pMD19-T載體和人工DGATl基因構建質粒pMD-DGATl ；
[0035]二、提取質粒pMD-DGATl和質粒pBI121分別用Xba I和BamH I進行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI121，獲得重組質粒 pBI 121-DGATI ；
[0036]三、取培養至對數中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細胞并用預冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細胞密度達到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質粒pBI121_DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續時間為2ms的脈沖電擊；
[0037]四、將步驟三電擊轉化的四尾柵藻細胞用微藻培養液清洗兩次，再置于微藻培養液中于22~25°C黑暗環境中培養24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；
[0038]其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0039]步驟三中滲透液中甘油的體積濃度為10%、甘露醇的濃度為0.2mol/L、山梨醇的濃度為0.2mol/L ；
[0040]步驟三中鮭精DNA的終濃度為25 μ g/mL ；
[0041 ] 步驟四中微藻培養液為BGlI液體培養基；
[0042]步驟四中將獲得的高油脂含量的四尾柵藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BGll固體培養基平板上，未加重組質粒的四尾柵藻同樣處理作為對照；15天后挑取在卡那霉素固體培養基平板上長出的轉化子四尾柵藻群落轉接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液體培養基中，繼續培養15天后轉接到沒有抗生素的固體培養基上，隔代在抗生素與無抗生素的培養基中進行交替培養，獲得性狀穩定的高油脂含量的四尾柵藻。
[0043]取本實施例獲得的高油脂含量的四尾柵藻、未基因重組的四尾柵藻和電擊轉化天然紫蘇DGATl基因的四尾柵藻進行試驗。
[0044]按1.0g/L的量分別接入高油脂含量的四尾柵藻、未基因重組的四尾柵藻和電擊轉化天然紫蘇DGATl基因(cDNA序列如SEQ ID N0:2所示)的四尾柵藻于錐形瓶中對地熱廢水進行處理，以藻體干重為檢驗指標，對藻體生長、水體除污和生物柴油產量進行試驗。試驗在溫度為25°C、光照強度為55001x、通氣量為220L/h的條件下對地熱廢水處理11天。
[0045]本實施例中地熱廢水取自大慶市林甸縣四季青鎮溫室大棚保溫管道內排出的地熱廢水，PH值為7~9。本實施例中選用同一種四尾柵藻，購自于中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，藻種編號為FACHB-1476。
[0046]將處理11天之后的高油脂含量的四尾柵藻藻液在4000r/min條件下離心獲得藻泥并置于80°C烘箱中干燥兩小時，待重組四尾柵藻烘干后收集藻粉。取藻粉用研缽粉碎取粉碎后樣品5g將其用干凈濾紙包好并稱重，然后放入脂肪測定儀之中，用石油醚萃取抽提脂肪(分成多組取平均值)，每抽提6小時取出稱重，待差值穩定后即為微藻中油脂的粗重，并計算微藻的產油率。
[0047]高油脂含量的四尾柵藻的油脂含量達細胞干重的11.8% ;未基因重組的四尾柵藻的油脂含量達細胞干重的6.3% ;電擊轉化天然紫蘇DGATl基因的四尾柵藻的油脂含量達細胞干重的2.1%。
[0048]實驗結果表明本發明構建的高油脂含量的四尾柵藻具有實際應用價值，可明顯提高生物柴油的產量。
[0049]地熱廢水中C0D、總氮、總磷及氟含量的實驗數據如表1所示。
[0050]表1
[0051]
【權利要求】
1.一種高油脂含量的四尾柵藻，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGATl基因，人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.權利要求1所述高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構建: 一、用質粒PMD19-T載體和人工DGATl基因構建質粒pMD-DGATl； 二、提取質粒pMD-DGATl和質粒pBI121分別用XbaI和BamH I進行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI 121，獲得重組質粒 pBI121-DGATl ； 三、取培養至對數中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細胞并用預冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細胞密度達到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質粒pBI121-DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續時間為2ms的脈沖電擊； 四、將步驟三電 擊轉化的四尾柵藻細胞用微藻培養液清洗兩次，再置于微藻培養液中于22~25°C黑暗環境中培養24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻； 其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟二用獲得的重組質粒PBI121-DGAT1轉化感受態細胞大腸桿菌DH5 α，然后進行藍白斑篩選，挑選白色菌落進行PCR驗證和酶切驗證。
4.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟三中滲透液中甘油的體積濃度為10%、甘露醇的濃度為0.2mol/L、山梨醇的濃度為0.2mol/L。
5.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟三中鮭精DNA的終濃度為25 μ g/mL。
6.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟四中微藻培養液為BGll液體培養基。
7.根據權利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構建方法，其特征在于步驟四中將獲得的高油脂含量的四尾柵藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BGll固體培養基平板上，未加重組質粒的四尾柵藻同樣處理作為對照；15天后挑取在卡那霉素固體培養基平板上長出的轉化子四尾柵藻群落轉接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液體培養基中，繼續培養15天后轉接到沒有抗生素的固體培養基上，隔代在抗生素與無抗生素的培養基中進行交替培養，獲得性狀穩定的高油脂含量的四尾柵藻。
【文檔編號】C12R1/89GK103923838SQ201410180811
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】劉玉, 劉宇峰, 姬妍茹, 楊慶麗, 董艷, 石杰 申請人:黑龍江省科學院大慶分院