凍干海藻糖磷酸鈣bmp-2緩釋材料及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料及其制備方法，將骨誘導因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面，先置于-80°C冰箱中，預凍3小時后放入凍干機中進一步凍干24小時即可。通過添加海藻糖提高磷酸鈣BMP-2緩釋材料中骨誘導因子的生物活性以及優化骨誘導因子的緩釋速度，延長骨誘導因子的保存時間，提高磷酸鈣生物支架材料構建組織工程化骨的成骨效率。
【專利說明】凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織工程技術，具體地說，涉及一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料及其制備以及在骨組織再生中的應用。
【背景技術】 [0002]骨組織缺損的修復與重建仍然是生物學和臨床醫學面臨的重大難題，利用組織工程技術構建骨組織為骨缺損的修復提供了新的思路。磷酸鈣(CPC)類支架材料是組織工程技術中常用的支架材料，具有良好的生物相容性和骨傳導性，但缺乏骨誘導性。近年來，有學者通過凍干法將成骨誘導因子與磷酸鈣材料復合以增加材料的骨誘導性。這種方法雖然可以在一定程度上達到提高磷酸鈣類材料骨誘導性的效果，但是在凍干過程中所產生的冷凍和干燥壓力會破壞骨誘導因子的生物活性，并且在骨誘導因子和磷酸鈣材料之間產生較大的結合力使其很難從材料表面釋放而發揮促進成骨的作用；同時在存放過程中骨誘導因子也易因溫度、PH值的變化和(或)酶的作用而發生進一步的變性。為了能夠保護骨誘導因子的生物活性在凍干過程中不受影響，優化骨誘導因子的釋放速度，并有效保存骨誘導因子的生物學活性，我們選擇對蛋白質分子有保護作用的海藻糖為保護劑，嘗試通過凍干的方法將骨誘導因子(骨形態發生蛋白2，BMP-2)與磷酸鈣材料復合，并將這種方法制備的磷酸鈣緩釋材料與未添加海藻糖的磷酸鈣緩釋材料相對照，分析添加海藻糖后對骨誘導因子生物活性，緩釋速度以及成骨效果的影響，探索以海藻糖為保護劑通過凍干法在制備磷酸鈣骨誘導因子緩釋材料中的可行性。
[0003]為了優化磷酸鈣BMP-2緩釋材料的緩釋效果，有研究先將白蛋白溶液預處理磷酸鈣材料，然后在復合BMP-2以減小BMP-2與磷酸鈣材料之間的結合力，從而促進BMP-2的緩釋；也有研究將殼聚糖或者凝膠包裹BMP-2蛋白形成微球結構，然后與磷酸鈣材料復合。雖然這些方法可以改善磷酸鈣BMP-2緩釋材料的緩釋效果，但是效果有限，且目前的研究都未曾對復合后以及釋放后的BMP-2的生物活性進行明確的闡述，所制備的磷酸鈣BMP-2緩釋材料是否可以保存及保存有效期限亦未曾報道。本研究所采用的海藻糖(Trehalose)是生物組織的非特異性天然保護劑，屬于非滲透性低溫保護劑，可使生物體及生物大分子的活性在冷凍、高溫、脫水、高滲透壓及有毒試劑等環境中仍然能夠得以保持。目前其已廣泛應用于醫學及生物學領域，有學者將其用于保存血小板、細胞、組織、器官、疫苗、蛋白質等，并取得了顯著的成果，但未曾應用于緩釋材料的制備。發明人前期已經將磷酸鈣材料用于骨組織缺損的修復，表現出良好的生物相容性和骨傳導性。通過此項研究，我們可以進一步改善磷酸鈣類生物支架材料的骨誘導性，延長骨誘導因子的保存時間，優化骨誘導因子的緩釋速度，提高磷酸鈣生物支架材料構建組織工程化骨的成骨效率。

【發明內容】

[0004]本發明的第一個目的是，提供一種具有優良骨誘導性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料。
[0005]本發明的第二個目的是，提供一種具有優良骨誘導性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法。
[0006]本發明的第三個目的是，提供一種具有優良骨誘導性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的應用。
[0007]本發明的第四個目的是，提供海藻糖在促進磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導性中的應用。
[0008]為了實現上述第一個發明目的，本發明提供了一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料，其特征在于，磷酸鈣BMP-2緩釋材料添加海藻糖。
[0009]為了實現上述第二個發明目的，本發明提供了凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將骨誘導因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面，先置于-80° C冰箱中，預凍3小時后放入凍干機中進一步凍干24小時即可。
[0010]作為一個優選方案，所述骨誘導因子BMP-2的濃度是I mg/ml，所述海藻糖溶液的濃度是0.3 mol/1 ο
[0011]為了實現上述第三個發明目的，本發明提供了的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料在骨組織再生中的應用。
[0012]為了實現上述第四個發明發明，本發明提供了海藻糖在促進磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導性中的應用。
[0013]本發明的優點在于，通過對凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料與未添加海藻糖的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的生物學特性體內外比較，探索凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料中骨誘導因子的生物活性和緩釋規律及其在再生醫學中的價值。研究結果表明凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料有如下的特點:(1) BMP-2可以從磷酸鈣材料表面持續釋放。(2)凍干過程沒有對BMP-2的生物活性產生影響。(3)緩釋材料能夠較好的促進骨髓基質細胞的成骨分化。(4)添加海藻糖能夠延長BMP-2的保存時間。(5)與骨髓基質細胞復合具有較好的促進大鼠臨界大小顱骨缺損修復的能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.磷酸鈣緩釋生物支架材料的掃描電鏡觀察。分別為凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(A)、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(B)、單純磷酸鈣支架材料(C)(標尺為5μ m)。
[0015]圖2.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2) BMP-2緩釋曲線圖。
[0016]圖3.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)所釋放BMP-2的生物活性分析。
[0017]圖4.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)對骨髓基質細胞成骨分化相關基因的影響，分別為Runx2 (A)、OPN (B)、0CN (C),BSP (D) (*表示與Lyo-BMP-2材料組和單純CPC組相比有統計學差異，Ρ〈0.05)。
[0018]圖5.凍干海藻糖磷酸鈣ΒΜΡ-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)對骨髓基質細胞增殖的影響(*表示與單純細胞組(Blank組)相比有統計學差異，P〈0.05)。
[0019]圖6.不同存貯時間和溫度對凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP-2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre_BMP-2) BMP-2生物活性的影響(圖A:存貯2周，圖B:存貯5周；*表示與Lyo-Tre-BMP-2組相比有統計學差異，P〈0.05)。
[0020]圖7.4組細胞材料復合體植入大鼠顱骨缺損5周后的非脫鈣組織切片，分別為凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細胞組(A: Lyo-Tre-BMP-2)、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細胞組(B: Lyo-BMP-2)、磷酸鈣材料+細胞組(C: bMSC/CPC)、單純磷酸鈣材料組(D:CPC) (200X)。(E)表示四組植入體成骨面積分析(*表示兩組間有統計學差異，P〈0.05)。
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]實施例1.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備及生物學特性 步驟一、海藻糖BMP-2溶液的配制
以無菌雙蒸水ddH20為溶劑,在超凈臺中按lmg/ml BMP-2, 0.3mol/l (113.5mg/ml)海藻糖的濃度配制海藻糖BMP-2的混合溶液，同時配制lmg/ml的BMP-2溶液。 [0023]步驟二、凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備和掃描電鏡觀察
(I)材料的制備:磷酸鈣(CPC)生物支架材料(直徑5mm，厚度2mm，孔隙率75%)高溫消毒備用，與海藻糖BMP-2溶液復合前24小時與無菌ddH20中浸泡以充分排出孔隙中的氣泡。用消毒濾紙吸出孔隙中的液體后滴加30 μ I海藻糖ΒΜΡ-2溶液,30min后待溶液完全吸入支架材料內，將材料放入-80° C冰箱中預凍3小時，然后再置于冷凍干燥機中，繼續凍干24小時，即完成凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備。按同樣方法制備凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料。
[0024](2)材料掃描電鏡觀察:將制備的緩釋材料迅速置入戊二醛液中固定2小時，漂洗樣品3次，用餓酸固定樣品1.5-2小時，漂洗樣品3次，乙醇系列脫水，然后置于醋酸異戊酯中過渡，用臨界點干燥儀進行干燥。最后，用離子真空噴度儀噴金，將噴金樣品置于掃描電鏡樣品室內，抽真空后Philips SEM XL-30掃描電子顯微鏡進行觀察。
[0025]步驟三、凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的生物學特性檢測
(I)材料BMP-2緩釋檢測:將制備好的緩釋材料置于離心管中，加入Iml PBS溶液，于加入？85后的1小時、1、3、7、10、14、21、28天分別從離心管中吸取10(^1溶液，并置換為新的PBS溶液Iml。吸取的BMP-2溶液用BMP-2酶聯免疫ELISA試劑盒檢測BMP-2的濃度，并根據初始BMP-2濃度計算不同時間點BMP-2的釋放百分比。
[0026](2)骨髓基質細胞的培養:無菌狀態下,取6周齡雄性Fischer 344大鼠胚骨和股骨，切除兩端干骺端，顯露骨髓腔，用含有肝素(200U/ml)、10%FBS的DMEM培養液沖洗骨髓腔，所得細胞懸液1200rpm離心5分鐘，吸去上清液和漂浮于液面的脂肪。加DMEM培養液，均勻吹散至10ml，接種于直徑為IOcm的培養皿中，置于培養條件為37° C，100%飽和濕度的培養箱中培養。待細胞生長增殖成單層細胞后，吸去培養液，PBS輕搖洗兩次后用0.25%胰蛋白酶液消化，收集細胞于無菌離心管。離心去上清液并加入培養液，接種于培養皿中。同樣的方法進行二次傳代，取第三代細胞進行以下實驗。
[0027](3)緩釋液BMP-2生物活性檢測
收集前7天的BMP-2緩釋液用于BMP-2生物活性檢測。將第三代骨髓基質細胞以
2.0 X IO4每孔的密度接種于48孔板，24小時后，培養液換為含5%FBS的DMEM培養液，同時加入100ng/ml的BMP-2緩釋液，以相同濃度的新鮮BMP-2為陽性對照；培養3、7、14天后用Triton X-100分別裂解細胞，用ALP定量試劑盒檢測經BMP-2緩釋液誘導后ALP蛋白的表達，同時用BCA法檢測細胞總蛋白的表達，計算ALP在總蛋白中的百分比以確定BMP-2的生物活性。
[0028](4)材料對骨髓基質細胞成骨相關基因表達的影響
將第三代骨髓基質細胞以lX105cell/ml的密度接種于6孔的Transwell培養系統(上層為材料，下層為細胞)，加入DMEM培養液(完全覆蓋材料)，培養3、7、14天后提取細胞總RNA并逆轉cDNA，進行realtime-PCR反應(ABI 7300實時熒光定量PCR 儀)。各基因及引物設計如下:Runx2 S: 5 ’ -GCTTCTCCAACCCACGAATG-3，，Runx2A: 5’ -GAACTGATAGGACGCTGACGA-3’ ; OPN S: 5’ -GACGGCCGAGGTGATAGCTT-3’ ， OPNA: 5’ -CATGGCTGGTCTTCCCGTTGC-3’，OCN S: 5’ -AAAGCCCAGCGACTCT-3’，OCN A:5’ -CTAAACGGTGGTGCCATAGAT-3’ ; BSP S: 5’ -GATAGTTCGGAGGAGGAGGG-3’ ， BSP A:5’ -CTAACTCCAACTTTCCAGCGT-3’ ; GAPDH S: 5’ -CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’ ， GAPDH A:5’ -GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’，退火溫度 58。C，預計產物大小分別是 212bp、208bp、232bp、172bp、140bp。基因表達變化以未放置任何材料的單純細胞為對照。
[0029](5)材料對骨髓基質細胞增殖的影響
將第三代骨髓基質細胞以5X 104cell/ml的密度接種于6孔的Transwell培養系統(上層為材料，下層為細胞)，加入DMEM培養液(完全覆蓋材料)，培養1、3、7、14天后用細胞增殖試劑盒檢測細胞中DNA含量的變化以確定細胞增殖情況，以未放置任何材料的單純細胞為對照。
[0030](6)存貯時間和溫度對BMP-2生物活性的影響
緩釋材料密封在離心管中分別放置于-20° C、4° C、25° C的環境溫度下，2周和5周后分別取出置于PBS溶液中一周，取100ng/ml BMP-2緩釋液檢測其生物學活性，方法同步驟三(3)，以相同濃度的新鮮BMP-2為陽性對照，計算材料組ALP含量與新鮮BMP-2組ALP
含量百分比。
[0031]實施例2.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料復合骨髓基質細胞修復大鼠臨界大小顱骨缺損的實驗
步驟一、材料與細胞復合
將如前所述的第三代大鼠骨髓基質細胞制成細胞密度為20X 106/ml的細胞懸液，緩慢滴加到材料表面至飽和狀態，復合后的細胞支架材料復合物即刻植入。
[0032]步驟二、大鼠顱骨缺損修復
取上述所構建的組織工程復合體植入大鼠顱骨臨界大小骨缺損，實驗按照隨機原則分為:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細胞組(η = 12)，凍干磷酸鈣ΒΜΡ-2緩釋材料+細胞組(η = 12)，磷酸鈣材料+細胞組(η = 12)，單純磷酸鈣材料組(η = 12)。觀察時間為5周。取12周齡雄性Fischer 344大鼠,全麻下頡頂骨部皮膚備皮,消毒后沿矢狀向切開皮膚黏膜，在左右顱頂骨分別制備直徑為5mm的全層缺損，分別將各組復合體植入缺損部位，分層縫合，術后青霉素30萬單位肌注3天，預防感染。術后5周取材。
[0033]步驟三、組織病理學觀察
標本處理過程如下:①固定:10%甲醛溶液固定3d，自來水沖洗過夜梯度酒精脫水:75%，85%，90%, 95%，100% 5個梯度對標本行脫水處理。每個梯度2d 透明化:棄酒精，將標本放在甲苯中浸泡4h ;④包埋:將標本放入單體中，單體應高于標本頂部1-1.5cm，加入固化單體(最為催化劑)，在干燥器內抽氣處理(防止產生氣泡)，4° C放置一周，室溫下放置至單體變粘稠，轉入37° C烘箱內至單體硬化。⑤硬組織切片:MMA完全硬化后，采用LeicaSP1600硬組織切片機切片，切片厚度為150 μ m,打磨至50 μ m,封片，拋光。苦味酸-品紅(Van Geison)染色:①超聲洗片2min 將切片放置在0.1 %甲酸溶液中3min，水沖洗切片2min。③將切片放置20%甲醇溶液中，2h，擦干。④60° C Stevenol藍染色5_15min，流水沖洗切片2 mirio⑤Van Geison—苦味酸品紅染色3_8min, 100%乙醇清洗；蒸懼水洗，晾干。切片在40X下整體統計新骨形成面積百分比。
[0034]統計方法:組間差異采用ANOVA和SNK法進行統計分析，所有統計過程均在SAS
6.12統計分析軟件中進行。P〈0.05表示具有統計學意義。
[0035]實驗結果
材料電鏡觀察:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料表面可見玻璃態的海藻糖晶體和BMP-2顆粒(圖1A)，凍干磷酸`鈣BMP-2緩釋材料表面可見大量的BMP-2顆粒緊密粘附在磷酸鈣晶體表面(圖1B)，磷酸鈣材料的表面為成簇的片狀磷灰石晶體(圖1C)。
[0036]材料BMP-2緩釋曲線:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料能夠持續釋放BMP-2，未見明顯的平臺期，28天的累積釋放量超過50%;而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料的釋放速度較慢，10天后基本進入平臺期,28天累積釋放量不足30% (圖2)。
[0037]凍干對BMP-2生物活性的影響:BMP-2緩釋液與細胞培養后的3、7、14天，凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料所釋放的BMP-2與新鮮BMP-2的活性未見明顯差別(P>0.05)，而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料所釋放的BMP-2活性明顯低于其他兩組(P〈0.05)，說明凍干過程中添加海藻糖可以保護BMP-2，使其活性不受影響(圖3)。
[0038]材料對細胞成骨分化的影響:骨髓基質細胞與凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料共培養，細胞中Runx2、OPN mRNA的表達較凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料組在第3、7、14天時均明顯升高(P〈0.05)，0CN、BSP mRNA的表達在第14天時明顯升高(P〈0.05)，細胞與單純磷酸鈣材料共培養時成骨相關基因的表達均維持在較低水平(圖4)。
[0039]材料對細胞增殖的影響:骨髓基質細胞與材料共培養1、3天后，各組細胞增殖情況沒有明顯差異，共培養7、14天后凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料組、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料組、單純磷酸鈣材料組均明顯高于單純細胞組(P〈0.05),而三材料組之間無明顯差異(Ρ>0.05)(圖 5)。
[0040]存貯條件對BMP-2生物活性的影響:緩釋材料在-20° C、4° C、25° C的環境溫度下，經過2周和5周的存放后，其中凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料中BMP-2的生物活性都有明顯的下降(P〈0.05)，而凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料中BMP-2的活性得到了較好的保持(圖6)。
[0041]大鼠顱骨臨界大小骨缺損修復組織學觀察:根據5周取材后非脫鈣組織標本光鏡觀察新骨形成面積百分比情況，其中凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細胞組明顯高于凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細胞組、磷酸鈣材料+細胞組和單純材料組(P〈0.05)，而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細胞組高于磷酸鈣材料+細胞組和單純材料組(P〈0.05)，磷酸鈣材料+細胞組則高于單純材料組(P〈0.05)(圖7)。
[0042]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保 護范圍。
【權利要求】
1.一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料，其特征在于，磷酸鈣BMP-2緩釋材料添加海藻糖。
2.權利要求1所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將骨誘導因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面，先置于-80° C冰箱中，預凍3小時后放入凍干機中進一步凍干24小時即可。
3.根據權利要求2所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述骨誘導因子BMP-2的濃度是I mg/ml，所述海藻糖溶液的濃度是0.3 mol/1。
4.權利要求1所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料在骨組織再生中的應用。
5.海藻糖在促進磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導性中的應用。
【文檔編號】A61L27/28GK103768657SQ201210408022
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月24日 優先權日:2012年10月24日
【發明者】趙君, 沈剛, 張志愿, 蔣欣泉, 王紹義, 張秀麗 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院