一種黑果枸杞堿提多糖及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及黑果枸杞堿提多糖及其制備方法，以及這種黑果枸杞堿提多糖在制備免疫調節藥物或保健品中的應用。黑果枸杞果實經熱水完全提取，剩余殘渣用堿液浸泡提取，提取液分別經乙醇沉淀，除蛋白，脫色，超濾，冷凍干燥后得黑果枸杞堿提多糖，鼠李糖含量為4.2%，阿拉伯糖為35.8%，木糖為14.1%，甘露糖為4.6%，葡萄糖為28.9%，半乳糖為12.4%。動物實驗顯示，黑果枸杞堿提多糖可以提高免疫抑制小鼠的非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫功能，有效拮抗環磷酰胺對小鼠免疫功能的抑制作用，可用于制備免疫調節藥物和保健品。
【專利說明】一種黑果枸杞堿提多糖及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種黑果枸杞堿提多糖及其制備方法，以及這種黑果枸杞堿提多糖在制備免疫調節藥物或保健品中的應用，屬于食品保健和醫藥領域。
【背景技術】
[0002]黑果枸杞(Lyciumruthenicum Murr)系爺科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.),是我國西北荒漠地區一種特有的的野生植物，分布于寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏等省。黑果枸杞果實味甜多汁，含豐富的維生素、有機酸及糖類；黑果枸杞也具有醫療保健功能，藏醫用于治療心熱病、心臟病、月經不調、停經等病癥。多糖廣泛存在于中藥材中，現代藥理學研究證明，多糖是中草藥發揮獨特療效的重要物質基礎。多糖可通過激活免疫細胞，促進細胞因子生成及表達，對免疫系統發揮多方面的免疫調節作用。近年來國內外對于黑果枸杞多糖的研究多集中在水提多糖上，發現黑果枸杞水提多糖具有降血糖和抗疲勞的活性功能，但水提取后的剩余物一般作廢棄處理。實際上藥用植物含有不同類型的多糖，用一種提取方法很難將其完全抽提出來，因此有必要分步用不同的溶劑進行浸提，這樣既可使多糖獲得初步分級，又能提高多糖得率。本發明以黑果枸杞水提后的殘渣為材料，首次制備出黑果枸杞堿提多糖，動物實驗證實其具有良好的免疫調節功效，可用于制備免疫調節保健品及藥品。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于針對現有技術提取的黑果枸杞多糖得率低、多糖功效不明確，提供一種具有藥用價值的黑果枸杞堿提多糖，簡稱ALRP (Alkaline extraction Lyciumruthenicum polysaccharide),并提供了提取上述物質的制備方法，適用于工業化生產，進一步提供了以黑 果枸杞堿提多糖為活性成分在制備免疫調節藥物或保健品中的應用，為臨床提供適合免疫功能低下患者及亞健康人群服用的藥品或保健品。
[0004]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0005]本發明涉及一種從黑果枸杞果實水提后的殘渣中制備黑果枸杞多糖的方法，包括以下步驟:
[0006](I)堿液提取:將黑果枸杞水提取后的殘渣烘干，加入5^15倍體積的0.5^3.0mol/L NaOH溶液，溫度25~50°C，提取l~8h，將提取液過濾，收集濾液。
[0007](2)醇沉:提取液40°C真空濃縮后，加乙醇調濃度至75~85%，靜置12h后過濾得多糖沉淀。
[0008](3)脫蛋白:將多糖沉淀加水溶解后，加三氯乙酸至濃度2~6%，攪拌15飛Omin后離心，保留上清糖液。
[0009](4)脫色:將脫蛋白后的多糖液用氨水調pH值至8~9，3(T60°C、時間15~60min、H202用量為2%~10%。
[0010](5)超濾:將多糖液經過f 3萬分子量的膜，冷凍干燥得黑果枸杞堿提多糖(ALRP)0
[0011]所得的黑果枸杞堿提多糖具有如下特征:
[0012](1)物理性狀:白色粉末，易溶于水，不溶于有機溶劑。
[0013](2)組成分析:糖含量為91.2%，蛋白含量為8.8%。經酸水解后，乙?；幚?，進行氣相色譜分析，其單糖組成為鼠李糖(4.2%)，阿拉伯糖(35.8%)，木糖(14.1%)，甘露糖(4.6%)，葡萄糖(28.9%)，半乳糖(12.4%)。
[0014](3)結構特征:紫外光譜證明本提取物為糖蛋白復合物，糖肽鍵為O連接類型，紅外光譜具有多糖的特征吸收峰，存在β-D-型葡萄吡喃糖和β-D-型半乳吡喃糖，阿拉伯糖以呋喃型糖環存在。
[0015]所述黑果枸杞堿提多糖可提高免疫抑制小鼠的非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫等功能。
[0016]所述黑果枸杞堿提多糖與藥物學上可接受的藥物/保健品輔料混合形成各種形式的散劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑或注射劑。在使用時可采取口吸取、皮下、靜脈注射或肛腸給藥；注射液的使用可以任意選用生理鹽水、葡萄糖、穩定劑、懸浮劑或乳化劑等。
[0017]本發明具有如下優點:
[0018]I本發明采用的提取的溫度較低，可以避免多糖結構的破壞，完好的保存了多糖分子上的糖鏈部分。
[0019]2提取方法中三氯乙酸法脫蛋白操作簡單，工藝步驟少，多糖損失小。采用過氧化氫法脫色法可使色素完全去除，并通過膜分離技術首次制備出黑果枸杞堿提多糖。
[0020]3本發明表明黑果枸杞堿提多糖具有免疫調節活性，純天然，無副作用，可開發成免疫調節保健品和藥品。
[0021]4根據實施例4:實驗證明黑果枸杞多糖可明顯提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指數、提高免疫抑制小鼠淋巴細胞水平；增強免疫抑制小鼠的細胞免疫功能如提高遲發超敏反應能力；增強免疫抑制小鼠的體液免疫功能如提高抗體分泌水平。因此，黑果枸杞多糖具有較強的免疫調節活性，有望為臨床提供一種非常適合免疫功能低下人群服用的藥品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為黑果枸杞堿提多糖的糖醇乙酸酯衍生物的的氣相色譜圖。
[0023]圖2為黑果枸杞堿提多糖的紫外吸收光譜。
[0024]圖3為黑果枸杞堿提多糖的紅外光譜。
【具體實施方式】
[0025]黑果枸杞熱水完全提取過程為:黑果枸杞果實加4倍體積的水用組織搗碎機打碎至均勻狀態，加熱超聲法(提取條件--溫度70°C，超聲波頻率40ΚΗζ，功率50W)提取2h，將提取液離心(6000r/min，lOmin)，殘渣用2倍體積的水再次加熱超聲提取lh，離心后，上清液為黑果枸杞果實熱水完全提取液，得到的剩余殘渣用于堿提取多糖。
[0026]實施例1 一種黑果枸杞堿提多糖的制備方法，包括以下步驟:
[0027](I)堿液提取:將水提后的黑果枸杞殘渣于50°C烘干，稱取100g烘干后的黑果枸杞殘渣于室溫下用1000mL lmol/L NaOH溶液室溫浸提2h，過濾后的殘渣再次用500mLlmol/L NaOH室溫提取2小時，過濾，合并兩次提取的濾液，離心去雜質后收集上清提取液。
[0028](2)醇沉:提取液40°C真空濃縮后，加乙醇調濃度至80%，靜置12h后過濾得多糖沉淀。
[0029](3)脫蛋白:將沉淀加入質量濃度3%的三氯乙酸溶液中，攪拌30min后離心，保留上清糖液；三氯乙酸溶液用量為1:50(g:mL)，保留上清糖液。
[0030](4)脫色:將脫蛋白后的多糖液用氨水調pH值至9、45°C、時間30min、H202用量為
5% .
[0031](5)超濾:將多糖液經過I萬分子量的膜，冷凍干燥得黑果枸杞堿提多糖(ALRP)。
[0032]實施例2黑果枸杞堿提多糖的單糖組成檢測
[0033]黑果枸杞堿提多糖(ALRP) 2mg，加入2mL 2mol/L TFA，密閉，充氮氣，121°C水解2h,減壓抽干。水解后的樣品加入ImL水溶解，加入100 μ L 0.5mol/L Na2CO3調pH至9左右，于30°C水浴保溫60min。加入0.5mL NaBH4溶液室溫還原2h。加入冰醋酸中和至無氣泡，過陽離子交換柱(H+型)，將洗脫液旋轉蒸發至干，加甲醇蒸干以除去硼酸鹽。85°C真空加熱2h,殘洛溶于ImL吡啶中，加入ImL正丙胺,密封,55°C加熱30min。旋轉蒸發抽干溶劑，加入吡啶和乙酸酐各2mL，振蕩后室溫過夜。減壓抽干后，用氯仿溶解并用水萃取3次，氯仿層進行氣相色譜分析。色譜柱為rtx-50柱(30.0mX0.25mmX0.25 μ m)。程序升溫條件為:18(TC (2min) - 6°C /min,210°C- 0.3°C /min,215°C- 6°C /min, 240°C (30min)。
[0034]經檢測如圖1所示，黑果枸杞堿提多糖的單糖組成為鼠李糖(4.2%)，阿拉伯糖(35.8%)，木糖(14.1%)，甘露糖(4.6%)，葡萄糖(28.9%)，半乳糖(12.4%)。
[0035]實施例3黑果枸杞堿提多糖的光譜分析
[0036]將樣品配制為1.0mg/mL的水溶液，于200nm至500nm波長范圍內進行紫外掃描。采用KBr壓片法進行紅外光譜的測定。
[0037]黑果枸杞堿提多糖的紫外吸收光譜圖如圖2所示。由于蛋白質在280nm處有特征吸收，糖類物質在200nm附近有特征吸收，因此可以通過紫外掃描可初步判定糖類和蛋白質的存在。紫外掃描顯示，在200nm左右有強烈吸收，而在280nm處有較弱吸收，說明黑果枸杞堿提多糖為糖蛋白復合物。
[0038]如圖3所示，紅外光譜中，有多糖特征吸收峰，3600~3200CHT1處的吸收峰為0_H的伸縮振動:2925(^1處有中強吸收，表示有糖類-CH2或-CH3的C-H伸縮振動$77(^1處有弱吸收，表明有β-D-型葡萄吡喃糖與β-D-型半乳吡喃糖存在；未顯示有羧基的存在，這與氣相色譜的結果一致。
[0039]實施例4動物實驗評價黑果枸杞堿提多糖的免疫活性
[0040](I)受試樣品:黑果枸杞堿提多糖，按照實驗施例I所述的方法制備。
[0041](2)實驗動物:雌性昆明小鼠，清潔級動物，6~8周齡，20±2g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，批準號為SCXK (遼)2008-0002，清潔級動物房飼養，溫度20±1°C，濕度40%~50%，光照12h，顆粒飼料喂養，自由飲水。
[0042](3)檢測項目:小鼠體重、脾臟和胸腺重；血象檢測；細胞免疫功能檢測，采用足趾腫法測定遲發型變態反應；體液免疫功能檢測，測定血清半數溶血值。
[0043](4)實驗方法:將小鼠隨機分為4組(空白對照組、免疫抑制模型組、多糖低劑量組、多糖高劑量組)，每組10只(n=10)，除對照組外，其余各組采取連續5d皮下注射環磷酰胺80mg/kg的方法制造免疫功能低下模型，模型制備成功后，多糖低劑量組(IOmg.kg-1.0-1)和多糖高劑量組(30mg.kg-1.cf1)采取腹腔注射的方式給藥,空白對照組和免疫抑制模型組用生理鹽水給藥，注射量按0.lmL/10g體重計，連續給藥10d。按照中華人民共和國衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》進行上述項目的檢測。
[0044]實驗各組小鼠給藥IOd后，采血抗凝后用血細胞計數儀檢測小鼠血象。末次給藥前12h，動物禁食，不禁水，停藥24h后各組動物處死后，取脾臟、胸腺，稱濕重并按公式計算脾和胸腺指數。
[0045]脾指數=脾重量(mg) /體重(g)胸腺指數=胸腺重量(mg) /體重(g)
[0046]各組小鼠在給藥第3d，用2%綿羊紅細胞腹腔注射，每只小鼠注射0.2mL致敏，5d后測量右后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%綿羊紅細胞，每只小鼠20 μ L，24h后測量右后足跖部厚度，測量三次取平均值，計算足跖增加厚度(mm)，以足跖增加厚度表示DTH程度。
[0047]各組小鼠于給藥第3d，腹腔注射2%SRBC 0.2mL致敏。末次給藥后24h，處死動物，小鼠摘眼球取血，分離血清，用生理鹽水將血清稀釋200倍，將稀釋后的血清ImL置試管內，依次加入10%的綿羊紅細胞0.5mL，補體ImL (用生理鹽水按1:10稀釋)，另設不加血清的對照管(以生理鹽水代替)。置37°C恒溫水浴鍋中保溫15min，冰浴中終止反應，2000r/min離心10min。取上清夜lmL、生理鹽水3mL于試管內，同時取10%的SRBC0.25mL于另一支試管內，充分混勻，放置IOmin后，于540nm處分別測定各管的光密度值。
[0048]半數溶血值HC5tl=(樣品OD值/SRBC半數溶血時OD值)X稀釋倍數
[0049](5)結果:
[0050]黑果枸杞堿提多糖對小鼠免疫器官重量的影響:從表1看出，與模型組比較，多糖低劑量組和高劑量組均明顯提高免疫抑制小鼠的脾指數和胸腺指數。
[0051]表1黑果枸杞多糖對小鼠臟器指數的影響
[0052]
【權利要求】
1.一種黑果枸杞堿提多糖，其特征在于:鼠李糖含量為4.2%，阿拉伯糖為35.8%，木糖為14.1%，甘露糖為4.6%，葡萄糖為28.9%，半乳糖為12.4%。
2.—種權利要求1所述黑果枸杞堿提多糖的制備方法，其特征在于:黑果枸杞果實經熱水完全提取后，得到的剩余殘渣用氫氧化鈉溶液浸泡提取，離心去除固體物質后收集提取液，提取液分別經乙醇沉淀，收集的沉淀用三氯乙酸法除蛋白，離心后上清糖液過氧化氫法脫色，超濾，濾液干燥后得黑果枸杞堿提多糖(ALRP)。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于: 熱水完全提取過程為:黑果枸杞果實加4倍體積的水用組織搗碎機打碎至均勻狀態，加熱超聲法(提取條件:溫度70°C，超聲波頻率40KHz，功率50W)提取2h，將提取液離心(6000r/min, lOmin)，殘渣用2倍體積的水再次加熱超聲提取lh，離心后，上清液為黑果枸杞果實熱水完全提取液，得到的剩余殘渣用于堿提取多糖。
4.按照權利要求2所述的方法，其特征在于: 所述的浸泡提取工藝條件為:黑果枸杞水提后殘渣加5-15倍體積的氫氧化鈉溶液；氫氧化鈉溶液濃度0.5-3.0moI/L,提取溫度25_50°C，提取時間l_8h。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于: 醇沉過程于提取液加乙醇調體系中乙醇質量濃度至75-85%，靜置24h，離心得多糖沉淀。
6.按照權利要求2所述的方法，其特征在于: 所述的三氯乙酸法脫蛋白·條件為:將沉淀加入質量濃度2-6%的三氯乙酸溶液中，攪拌15-60min后離心，保留上清糖液；三氯乙酸溶液用量為1:50(g:mL)。
7.按照權利要求2所述的方法，其特征在于: 所述的過氧化氫法脫色條件為溫度30-60°C、時間15-60min、用氨水調體系pH 8_9后脫色、質量分數為30%的H2O2溶液的體積用量為上清糖液體積的2% -10%。
8.按照權利要求2所述的方法，其特征在于:將多糖液經過1-3萬截流分子量的膜超濾。
9.一種權利要求1所述的黑果枸杞堿提多糖在制備免疫調節藥物或保健品中的應用。
【文檔編號】A61P37/02GK103848921SQ201210516648
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月5日 優先權日:2012年12月5日
【發明者】杜昱光, 彭強, 許青松, 李曙光, 劉啟順 申請人:中國科學院大連化學物理研究所