本發明涉及枸杞多糖提取技術領域，具體為一種生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖的方法。

背景技術：

枸杞多糖是一種生物活性物質，具有促進T、B、CTL、NK和巨噬細胞等免疫功能，促進IL-2、IL-3和TNFβ等細胞因子產生。增強荷瘤、化療與輻射損傷小鼠免疫功能及調節神經內分泌免疫調節(NIM)網絡的作用，淡黃色纖維狀固體，有調節免疫、延緩衰老多種功效，可制藥；

枸杞多糖的提取純化分為二步。一是枸杞粗多糖的提取，二是枸杞多糖的分級純化。粗多糖的提取工藝如下：稱取已烘干粉碎的枸杞子，以石油醚：丙酮(1：1)回流脫脂，濾出溶劑，殘渣風干后以80%乙醇脫單糖和低聚糖。將脫低聚糖等后的殘渣用水在90~100℃水溶提多糖，提取液減壓濃縮后用酒精沉淀多糖，再用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀，真空干燥得枸杞粗多糖。例如公告號為CN105367678A的一種枸杞多糖的提取方法，該方法講述了對枸杞多糖的提取方式。粗多糖的分級純化是將上述枸杞粗多糖通過DEAE纖維素柱，以不同濃度的NaCl梯度洗脫，將不同鹽濃度的洗脫液分別減壓濃縮后，用透析法脫鹽，冷凍干燥后得不同級分的枸杞糖蛋白。但是在實際工作中，往往因為會提取工藝選擇不當，導致制備的枸杞多糖活性大大降低；

生物表面活性劑只有少數糖脂類產品走向市場，借助其表面活性和無污染的特點，已應用到石油開采業并發展出“微生物三次采油技術”；借助其可乳化烴類和水的混合物，已用于降解石油化學工業泄露的原油中烴類物質，發展新型環境生物修復技術；借助其乳化和抑菌特性，已用于食品工業中作為乳化劑和生物防腐劑；借助糖脂類生物表面活性劑對皮膚的親和性，已用于醫療和化妝品工業；

目前，北歐國家在生物表面活性劑的制備和應用等方面，處于世界領先水平，我國在這一領域遠遠落后于行業內的先進國家，原因在于：Lipopeptide類生物表面活性劑處于實驗研究階段，還沒有進行大規模的工業化生產，一方面原因在于其生產成本較高，成本約為化學合成表面活性劑成本的3-10倍；另一方面，尚沒有發現高效制備Lipopeptide類生物表面活性劑的方法。而在先進國家，生物表面活性劑也只有少數糖脂類產品得到應用，但取得了較好的市場響應。本發明重點研究的脂肽（Lipopeptide）類生物表面活性劑和糖脂類生物表面活性劑相比較，具有成本低，應用領域廣闊等優勢，目前，在國內外大規模的工業化生產和應用報道較少。

技術實現要素：

（一）解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖的方法，解決了在實際工作中，因為提取工藝選擇不當，導致制備的枸杞多糖活性大大降低的問題。

（二）技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：

一種生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖的方法，包括以下步驟：

S1、通過單因素實驗先后采集溫度對枸杞多糖提取率的影響工藝參數、料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數和提取時間對枸杞多糖提取率的影響工藝參數，每個因素做三個平行。

S2、在單因素實驗的基礎上進行L9正交實驗，按照正交實現確定的最佳工藝進行驗證實驗，做出三個平行。

S3、通過觀察實驗記錄表，取得最佳工藝，并制定生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖產業化生產工藝流程。

優選的，S1中溫度對枸杞多糖提取率的影響工藝參數的采集方法為稱取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去離子水，配制料液比為1:50，分別于26℃、28℃、30℃、32℃空氣搖床內，180r/min，發酵48h后取出，離心取上清液，測定計算多糖提取率，每個因素做三個平行。

優選的，：S1中料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數的采集方法為稱取3.6g、4.5g、6g、9g干燥的枸杞粉末，分別加入180mL去離子水（即料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50），于28℃空氣搖床內，180r/min，發酵48h后取出，離心取上清，測定計算多糖提取率，每個因素做三個平行。

優選的，S1中料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數的采集方法為稱取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去離子水，配制料液比為1:40，于28℃空氣搖床內，180r/min，分別發酵36h、48h、60h、72h后取出，離心取上清，測定計算多糖提取率，每個因素做三個平行。

優選的，S3中生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖產業化生產工藝流程包括以下步驟：

A1、將枸杞干果放入60℃的烘干機內烘干至恒重，再將其粉碎，然后通過50目篩進行篩選，同時準備黃酒酵母菌種。

A2、將適量枸杞干果粉投入提取罐內，加入40倍原料量的去離子水和5%黃酒酵母菌種，加熱攪拌升溫至28℃，保溫攪拌提取36小時。

A3、對保溫攪拌后的液體進行過濾，以得到上清液。濾渣再次用5倍量的水與黃酒酵母分別提取兩次，方法相同。

A4、濾液用真空泵抽到單效濃縮器中（濾液以裝滿容器體積的2/3為宜），在溫度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽壓力0.2MPa條件下進行減壓濃縮，濃縮到至固形物為50-55%左右。

A5、加入4倍體積的無水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉兩次，再經過離心、乙醚洗滌、粉碎和噴霧干燥，最后通過80目篩，得枸杞多糖。

優選的，A1中黃酒酵母菌種的制作方法包括以下步驟：

A11、YPD培養基的配制。

A12、挑取黃酒酵母單菌落接菌于YPD培養基中，并將混入有黃酒酵母單菌的YPD培養基放入28℃的空氣搖床中，180r/min，培養48小時之后即得。

優選的，A11中YPD培養基的配制方法為稱取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析純葡萄糖，加水定容至1000mL，分裝置500mL的錐形瓶中各100 mL，121℃高溫高壓滅菌15min制得。

優選的，A3中的過濾采用板框進行，板框由濾板和濾框交替疊合構成，在板與框之間設置有壓濾布。

優選的，A1和A5中粉碎均采用型號為ZN-04B的小型粉碎機。

（三）有益效果

本發明提供了一種生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖的方法。具備的有益效果是：

1、該生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖的方法，以枸杞作為實驗材料，枸杞多糖的提取率作為考察目標，通過酵母產槐糖脂、表面活性素、甘露糖蛋白和熱水法提取枸杞多糖，選取影響枸杞多糖提取率的主要因素，通過單因素實驗和正交設計實驗確定表面活性劑法和熱水法提取枸杞多糖的最優工藝條件，對比表面活性劑法和熱水法提取枸杞多糖的提取率，評價利用酵母產表面劑提取枸杞多糖的可行性和優越性。

2、本發明采用黃酒酵母發酵生產槐糖脂、表面表面活性、甘露糖蛋白等表面活性劑輔助提取枸杞多糖，可顯著提高枸杞多糖提取率和產品純度（75%以上）

附圖說明

圖1為本發明生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖產業化生產工藝流程圖；

圖2為多糖提取率溫度單因素實驗圖；

圖3為多糖提取率料液比單因素實驗圖；

圖4為多糖提取率提取時間單因素實驗圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明實施例提供一種生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖的方法，包括以下步驟：

S1、通過單因素實驗先后采集溫度對枸杞多糖提取率的影響工藝參數、料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數和提取時間對枸杞多糖提取率的影響工藝參數，每個因素做三個平行。

S1中溫度對枸杞多糖提取率的影響工藝參數的采集方法為稱取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去離子水，配制料液比為1:50，分別于26℃、28℃、30℃、32℃空氣搖床內，180r/min，發酵48h后取出，離心取上清液，測定計算多糖提取率，每個因素做三個平行，具體請見圖2：

由圖可見，枸杞多糖提取率在28℃之前隨著溫度的升高而顯著升高，28℃之后隨著溫度的升高而顯著下降，過高的溫度會對酵母的活性有抑制作用，故溫度選在26℃-30℃為宜。

S1中料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數的采集方法為稱取3.6g、4.5g、6g、9g干燥的枸杞粉末，分別加入180mL去離子水（即料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50），于28℃空氣搖床內，180r/min，發酵48h后取出，離心取上清，測定計算多糖提取率，每個因素做三個平行，具體請見圖3：

由圖可見，枸杞多糖的提取率隨著料液比的先顯著增高后顯著下降，在1:40達到最大提取率，料液比為1:40之后開始顯著下降的原因可能是隨著料液比的增大，發酵底物中菌和酶的濃度較小，使多糖的提取率降低。故料液比應選取1:30-1:50為宜。

S1中料液比對枸杞多糖提取率的影響工藝參數的采集方法為稱取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去離子水，配制料液比為1:40，于28℃空氣搖床內，180r/min，分別發酵36h、48h、60h、72h后取出，離心取上清，測定計算多糖提取率，每個因素做三個平行，具體請見圖4：

有圖可知，在微生物提取時間為48h時，枸杞多糖的提取率最大， 48h之后隨著時間的增加，提取率開始顯著下降，時間取36h-60h為宜。

S2、在單因素實驗的基礎上進行L9正交實驗，按照正交實現確定的最佳工藝進行驗證實驗，做出三個平行，具體請見下表：

有圖可知，三個因素對于枸杞多糖提取率影響大小為C>A>B，即料液比>發酵溫度>時間，根據顯著性分析可得，料液比和溫度對微生物法提取枸杞多糖影響顯著（P<0.05），時間對微生物法提取枸杞多糖影響不顯著。由圖微生物法提取正交實驗結果可得最佳提取工藝為A2B1C2，提取率為2.74%，所以微生物法產表面活性劑提取枸杞多糖的最佳工藝為發酵溫度28℃、發酵時間為36h、料液比為1:40。

S3、通過觀察實驗記錄表，取得最佳工藝，并制定生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖產業化生產工藝流程。

如圖1所示，S3中生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖產業化生產工藝流程包括以下步驟：

A1、將枸杞干果放入60℃的烘干機內烘干至恒重，再將其粉碎，然后通過50目篩進行篩選，同時準備黃酒酵母菌種。

A1中黃酒酵母菌種的制作方法包括以下步驟：

A11、YPD培養基的配制；

A12、挑取黃酒酵母單菌落接菌于YPD培養基中，并將混入有黃酒酵母單菌的YPD培養基放入28℃的空氣搖床中，180r/min，培養48小時之后即得。

A11中YPD培養基的配制方法為稱取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析純葡萄糖，加水定容至1000mL，分裝置500mL的錐形瓶中各100 mL，121℃高溫高壓滅菌15min制得。

A2、將適量枸杞干果粉投入提取罐內，加入40倍原料量的去離子水和5%黃酒酵母菌種，加熱攪拌升溫至28℃，保溫攪拌提取36小時。

A3、對保溫攪拌后的液體進行過濾，以得到上清液。濾渣再次用5倍量的水與黃酒酵母分別提取兩次，方法相同。

A3中的過濾采用板框進行，板框由濾板和濾框交替疊合構成，在板與框之間設置有壓濾布。

A4、濾液用真空泵抽到單效濃縮器中（濾液以裝滿容器體積的2/3為宜），在溫度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽壓力0.2MPa條件下進行減壓濃縮，濃縮到至固形物為50-55%左右。

A5、加入4倍體積的無水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉兩次，再經過離心、乙醚洗滌、粉碎和噴霧干燥，最后通過80目篩，得枸杞多糖，A1和A5中粉碎均采用型號為ZN-04B的小型粉碎機。

綜上所述，該生物表面活性劑輔助提取枸杞多糖的方法，以枸杞作為實驗材料，枸杞多糖的提取率作為考察目標，通過酵母產槐糖脂、表面活性素、甘露糖蛋白和熱水法提取枸杞多糖，選取影響枸杞多糖提取率的主要因素，通過單因素實驗和正交設計實驗確定表面活性劑法和熱水法提取枸杞多糖的最優工藝條件，對比表面活性劑法和熱水法提取枸杞多糖的提取率，評價利用酵母產表面劑提取枸杞多糖的可行性和優越性。

需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關系術語僅僅用來將一個實體或者操作與另一個實體或操作區分開來，而不一定要求或者暗示這些實體或操作之間存在任何這種實際的關系或者順序。而且，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個……限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設備中還存在另外的相同要素。

盡管已經示出和描述了本發明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。