專利名稱：一種融合蛋白的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及融合蛋白的應用，特別涉及融合蛋白在促進粒系造血祖細胞增殖方面的應用。
背景技術：
血液具有運輸物質、維持組織的興奮性、調節機能、防御作用等功能，是構成人體和維持人類生命活動的基本物質之一，所以一旦血液的組成成分發生異常變化，就會引起嚴重的后果。引起血液病的因素很多，諸如化學因素、物理因素、生物因素等，都可以成為血液病發病的誘因或直接原因，其中很多是近幾十年現代工業的產物，從而使血液病的發病率有逐年增高的趨勢。
骨髓抑制型貧血是較為常見的一類因化學、物理、生物因素及不明原因所致骨髓造血組織減少，引起造血功能衰竭而發生的貧血。骨髓抑制可引起骨髓微環境、造血干細胞、造血細胞生長因子等的損傷，粒、巨核系細胞系統也會受到抑制，粒細胞缺乏會引起嚴重感染。
目前放、化療仍然是腫瘤治療中最常用的手段，但大多數患者治療后會產生惡心、 嘔吐等不良反應，其中最常見而且最為嚴重的不良反應就是骨髓抑制，不但致使機體造血功能下降，免疫力降低，使得化療不能按正常劑量進行從而影響治療的連續性，還可引起白細胞和血小板的減少，患者易并發感染和出血，甚至死亡。盡快促進患者造血功能的恢復成為提聞腫瘤治愈率，降低感染發生率，提聞患者生存質量的關鍵。
目前臨床上主要用粒系集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)等集落刺激因子來促進造血功能的恢復。它們直接刺激粒系造血祖細胞的增殖， 縮短白細胞和中性粒細胞的恢復時間，療效快。但是由于CSF是直接刺激無自我更新能力的造血祖細胞的增殖，導致造血祖細胞的耗竭，不利于長期的造血功能的恢復，甚至導致骨髓儲備不足；另外，一些腫瘤細胞，如白血病細胞具有CSF的正常受體，用藥后可能通過提高宿主殘余腫瘤細胞的增殖,提高腫瘤的復發率。同時，由于其作用穩定性差,往往導致外周血及骨髓象中充滿大量幼稚白細胞，使白細胞計數呈現成倍增長、成倍下降的現象，患者為維持正常療程不得不反復用藥。因此，臨床上需要開發出能有效促進造血細胞增殖而對腫瘤細胞無刺激增殖作用的藥物。發明內容
本發明的目的是提供一種促進粒系造血祖細胞增殖的融合蛋白的應用。
本發明的另一目的是提供一種用于促進以粒細胞為主的造血細胞增殖的藥物組合物。
本發明的再一目的是提供一種能夠在體外促進粒系細胞生長的方法。
本發明的第一方面，提供一種融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示，所述融合蛋白用于制備(i)刺激骨髓間充質干細胞向造血干/祖細胞分化的藥物；或 (ii)促進粒系造血祖細胞增殖的藥物。 在另一優選例中，所述藥物用于(1)預防和/或治療化療引起的造血功能低下；(2)預防和/或治療放療引起的造血功能低下；或(3)預防和/或治療白細胞減少癥。在另一優選例中，所述藥物在放療或化療之前、之中、和/或之后使用。本發明的第二方面，提供一種融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示，所述融合蛋白用于促進粒系造血祖細胞的增殖。在另一優選例中，所述融合蛋白用于體外促進粒系造血祖細胞的增殖。本發明的第三方面，提供一種融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示，所述融合蛋白用于制備預防和/或治療白細胞減少癥的藥物。本發明的第四方面，提供一種體外促進粒系祖細胞增殖的方法，在粒系祖細胞的 培養基添加100ng/mL 5iig/mL的融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示。其中，所述粒系祖細胞為粒系造血祖細胞。本發明的第五方面，提供一種藥物組合物，包含融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示；以及藥學上可接受的載體或賦形劑。本發明的藥物組合物是無毒的，并且劑型穩定。在另一優選例中，所述藥物組合物在放療或化療之前、之中、和/或之后使用。在另一優選例中，所述藥物組合物還包括環磷酰胺。本發明的第六方面，提供第五方面所述的藥物組合物的用途，用于制備促進粒系 造血祖細胞增殖的藥物。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖1為各組小鼠不同時間白細胞數(WBC)數的變化圖。圖2顯示化療用藥后第10天各組的骨髓有核細胞數。圖3顯示化療用藥后第10天各組的脾系數。圖4顯示化療用藥后第10天各組的細胞集落數。圖5顯示化療用藥后第10天各組的骨髓有核細胞數中⑶34比例。圖6顯示化療用藥后第10天各組的骨髓有核細胞數中⑶45比例。
具體實施例方式本申請的發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外發現本發明所用的融合蛋白具 有促進粒系造血祖細胞增殖的作用，不僅能夠有效預防而且能夠有效治療放療、化療等引起的造血功能下降及白細胞的減少。在此基礎上，完成了本發明。
融合蛋白
本發明所用的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所示。蛋白單鏈分子量約13_15kD，經復性后該活性蛋白為二聚體，分子量約為25-30kD。本發明所用的融合蛋白，具有良好的活性和穩定性，并提高其表達，促進蛋白復性時正確折疊，延長生物半衰期，增加其在體內的使用效果，且易復性、易分離、活性高及適宜產業化生產和應用。
融合蛋白的應用
本發明的融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示)的用途，能夠用于制備(i)刺激骨髓間充質干細胞向造血干/祖細胞分化的藥物；或
(ii)促進粒系造血祖細胞增殖的藥物。
所述藥物用于
(I)預防和/或治療化療引起的造血功能低下；
(2)預防和/或治療放療引起的造血功能低下；或
(3)預防和/或治療白細胞減少癥。
在另一優選例中，所述藥物用于預防和/或治療白細胞減少癥。
所述藥物在放療或化療之前、之中、和/或之后使用。
實驗研究顯示，本發明的融合蛋白能促進化療藥物/放療導致的造血功能低下的恢復。
該融合蛋白對化療引起的造血損傷有有效的治療作用。融合蛋白的促造血作用， 主要是作用于骨髓基質細胞，改善造血微環境，從而影響造血干/祖細胞的增殖和分化。骨髓有核細胞數、骨髓粒系集落的檢測是最直接反映骨髓增生的證據。CD34細胞和CD45細胞檢測則是最直接反映造血干/祖細胞增殖和分化的證據。
經腹腔注射本發明的融合蛋白后，能促進注射化療藥物環磷酰胺造成的小鼠骨髓有核細胞數和外周血白細胞數的恢復，并且與環磷酰胺對照組相比差別顯著，表明本發明的融合蛋白以促進粒系造血為主。因此，本發明的融合蛋白可認為是一種有效的促造血因子，在促進粒細胞造血方面具有臨床應用前景。
此外，造血微環境是恢復正常造血的先決條件之一，本發明的融合蛋白在體內通過刺激骨髓間充質干細胞增殖，改善造血微環境，促進自然發生或誘發的骨髓抑制或損傷的造血功能恢復，并能刺激骨髓移植后的造血重建。
本發明為造血功能低下、白細胞減少癥等提供了一種有效的預防/治療的藥物。
藥物組合物
本發明的藥物組合物包括本發明的融合蛋白。
本發明所述的藥物組合物具有提高造血干/祖細胞的增殖活性、促進造血功能恢復的功能，可用于治療放、化療引起或自然發生的骨髓損傷造成的造血功能低下。
與目前臨床上普遍使用的重組人粒系集落刺激因子rhG-CSF和rhGM-CSF相比較， 本發明的融合蛋白促增殖作用溫和，加快外周血細胞恢復，因而有臨床應用的廣泛前景。另外融合蛋白不易造成免疫原性。
可按制藥領域已知的常規方法，將本發明的融合蛋白或藥物組合物制成適合臨床上特定給藥方式的藥物。例如可在本發明的融合蛋白或藥物組合物中加入適當的載體或稀釋劑，如水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液以制成可經腸胃道以外途徑給藥的注射劑。也可加入淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、脂質體、明膠、甘露醇等賦形劑或載體。
本發明的融合蛋白或藥物組合物可通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等常規途徑給藥。
本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實施例I
融合蛋白的制備
I.重組載體的構建
用全基因合成方式合成DNA序列(SEQ ID NO: I) 通過酶切后將其插入載體 PBV220中。得到優化的表達質粒，經酶切和測序驗證插入片段與設計一致。
2.工程菌的構建、驗證和保存
采用分子克隆操作技術，以常規的氯化鈣法制備感受態表達系統后，用步驟2所得的表達質粒進行轉化大腸桿菌JM109，在抗性平板中挑取單菌落，經培養后抽提質粒，進行酶切驗證，最后測序，證實表達載體序列正確。挑取重組子，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的LB培養液的搖瓶中，在30°C的條件下以180rpm的轉速在氣浴振蕩器中培養15小時， 在冰浴條件下加入無菌甘油，使之達到15%的濃度，分裝后在_80°C冰箱保存。
3.工程菌的培養
從轉化后含有正確表達質粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于裝有含氨芐青霉素的LB培養液的搖瓶中，LB培養基為10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸出粉，5g/L NaCl ； 氨芐青霉素含量為100μ g/mL ;在30°C的條件下以180rpm的轉速在搖床中培養8小時，再按體積比為I :10的比例將培養物接種到LB培養基中，pH7. 0±0. 2，培養溫度為30°C，攪拌速度180rpm，培養4小時。然后，升溫至42°C進行誘導，繼續培養6小時，培養結束后， 在7500rpm4±2°C條件下，離心分離，收集菌體，菌體裂解后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，在 15KD分子量處，與誘導前的重組菌及不含質粒的出發菌相比，有清晰條帶增加，說明已經表達產生了目標蛋白質。
4.包涵體的提取和洗滌
將步驟4收集的菌體，與TE溶液，按Ig =IOmL的比例混合，再按Ig lmg的比例， 與溶菌酶混合，采用高壓均質法進行菌體破碎，然后在IOOOOrpm離心，收集沉淀，以Ig沉淀物20mL洗滌液的比例加入IM尿素水溶液洗滌，攪拌2h后，4±2°C離心收集沉淀物，再用0. 5%曲拉通水溶液進行二次洗滌，之后，以Ig沉淀物20mlTris的比例，加入IOmM的 Tris (pH7. 5)，清洗，收集沉淀，得包涵體；
5.包涵體的裂解、復性
以Ig包涵體IOmL裂解液的比例加入裂解液，裂解液為6M Gu-HCl、20mMPBS、IOmM DTT。在4±2°C下，攪拌裂解8小時，離心，離心轉速lOOOOrpm，離心溫度為4±2°C，離心時間為30分鐘，棄沉淀，取離心上清液加入復性液中，稀釋至蛋白含量為O. lmg/mL，復性10 天，復性液為 20mM Na2HPO4 · 12Η20、1· 5mMNaH2P04 · 2H20、140mM NaCl、5mM EDTA、lmM 谷胱甘妝等。
6.蛋白純化
采用陰離子交換層析、陽離子交換層析、分子排阻層析的方法，按常規的洗脫方法從復性液中回收有活性的融合蛋白二倍體。后在-30 7°C下凍干，得到融合蛋白，序列如 SEQ ID NO:2 所示。
經非還原電泳SDS-PAGE檢測產品純度超過95%，分子量約為30KD ；HPLC鑒定其純度超過95%。經測定，N末端與C末端測定均與理論值一致。
每批培養物的得率為7. 02mg/L融合蛋白。
實施例2
融合蛋白在化療損傷模型中的促進造血作用
2. I本實施例的目的是觀察融合蛋白對化療引起的白細胞減少癥的治療作用，為治療腫瘤患者化療后骨髓損傷造血功能低下尋找安全有效的藥物。其中，本實施例中使用實施例I制備的融合蛋白，序列如SEQ ID N0:2所示。
本實施例采用清潔級BALB/c小鼠，雄性，體重18 20g，隨機分組，每組10只。小鼠共分為五組，如下
CTX組單獨給予環磷酰胺(CTX)，劑量為100mg/kg體重/天，注射體積為100 μ L， 連續給藥3天；第4天起每天注射100 μ L磷酸緩沖溶液(PBS),連續注射6天；
50 μ g組在連續3天給予環磷酰胺(100mg/kg體重/天，注射體積為100 μ L)后， 連續6天給予融合蛋白，劑量為50 μ g/鼠/天，注射體積為100 μ L ;
25 μ g組在連續3天給予環磷酰胺(100mg/kg體重/天，注射體積為100 μ L)后， 連續6天給予融合蛋白，劑量為25 μ g/鼠/天，注射體積為100 μ L ;
10 μ g組在連續3天給予環磷酰胺(100mg/kg體重/天，注射體積為100 μ L)后， 連續6天給予融合蛋白，劑量為10 μ g/鼠/天，注射體積為100 μ L0
正常組每天注射100 μ L磷酸緩沖溶液(PBS)，連續注射9天；
檢測指標如下
(I)各組分別于第I天(未給藥時)，第2-10天，連續檢測外周血白細胞(WBC)數。 步驟如下用毛細管在小鼠右眼眼眶取血，每次取50yL，放在含有抗凝劑的試管中，然后用血細胞分析儀采用全血模式測試血液中白細胞數。
(2)第10天檢測各組小鼠骨髓有核細胞數(BMNC)。步驟如下無菌環境下處死小鼠，在75%的酒精浸泡5min。剝開小鼠大腿的肌肉，取出股骨，用剪刀把股骨兩端剪斷，用 5mL的注射器吸取PBS，從股骨一端沖洗，然后用400目的無菌紗布過濾沖洗液，過濾后調整細胞濃度，然后用計數板在顯微鏡下計數。
(3)第10天檢測各組小鼠胸骨和股骨骨髓中粒系細胞的變化，步驟如下處死小鼠，取出股骨和胸骨，在10%的甲醛溶液中浸泡48h后，做HE染色的石蠟切片，然后在顯微鏡下觀察粒系細胞的變化。
(4)第10天檢測各組小鼠脾系數的變化，步驟如下處死小鼠前，先測量每只小鼠的體重。處死后，取出脾臟稱重，脾重與體重的比值即為脾系數。
(5)第10天檢測各組小鼠骨髓細胞中⑶34+細胞比例的變化；
步驟按檢測指標(2)的方法取出骨髓細胞，調整細胞濃度為5X IO6個/mL，用抗體稀釋液洗滌，離心棄上清液，加10μ LCD34抗體，4°C孵化半小時，加抗體稀釋液洗去多余的抗體，離心棄上清液，加抗體保存液調整細胞濃度為IX IO6個/mL，采用流式細胞儀檢測。
(6)第10天檢測各組小鼠骨髓細胞中⑶45+細胞比例的變化；
步驟按檢測指標(2)的方法取出骨髓細胞，調整細胞濃度為5X IO6個/mL。
用抗體稀釋液洗滌，離心棄上清液，加10 μ IXD45抗體，4°C孵化半小時，加抗體稀釋液洗去多余的抗體，離心棄上清液，加抗體保存液調整細胞濃度為I X IO6個/mL，采用流式細胞儀檢測。
(7)第11天檢測CFU-GM集落數的變化
步驟在無菌環境下處死小鼠，在75%的酒精浸泡5min。剝開小鼠大腿的肌肉，取出股骨，用剪刀把股骨兩端剪斷，用注射器吸取5mL PBS，從股骨一端沖洗，然后用400目的無菌紗布過濾沖洗液，過濾后的液體調整濃度為I X 105/mL。在無菌環境下，離心ImL沖洗液，加入100 μ L的DMEM培基，吹打均勻成細胞懸浮液。取一個細胞凍存瓶，里面加入ImL 甲基纖維素培養基，再加入10 μ L細胞懸浮液，用移液槍吹打均勻。在24孔細胞培養板中每孔加入500 μ L均勻混合的含細胞的甲基纖維素培基。然后放到恒溫培養箱中培養兩周， 顯微鏡下數CFU-GM集落的個數(50個細胞以上為一個集落)。
2. 2本實施例研究融合蛋白對化療損傷的預防治療作用，其中使用實施例I制備的融合蛋白。實驗分組如下
CTX組連續注射6天PBS，注射體積為100 μ L，然后再注射3天CTX，劑量為 100mg/kg體重/天，注射體積為100 μ L ；
聯合用藥組先連續6天腹腔注射融合蛋白，劑量為50 μ g/鼠/天，注射體積為 100 μ L，隨后再連續注射3天環磷酰胺，劑量為100mg/kg體重/天，注射體積為100 μ L ;
對照組每天注射100 μ L PBS溶液，連續注射9天。
各組小鼠于第10天處死。
檢測指標
各組小鼠與第I天，第8天，第10天檢測外周血白細胞數，方法同實施例2. I。
2. 3本實施例研究融合蛋白與化療藥聯合使用時對化療引起的白細胞損傷的促恢復作用，其中使用實施例I制備的融合蛋白。實驗分組如下
CTX組連續3天注射CTX，劑量為100mg/kg體重/天，注射體積為100 μ L。然后再連續3天注射與CTX等體積的PBS溶液；
聯合用藥組從第I天起同時給予融合蛋白(劑量為50 μ g/鼠/天)和CTX (劑量為100mg/kg體重/天)，注射體積均為100 μ L ;三天后停用CTX，融合蛋白再繼續注射3天， 注射體積為100 μ L ;
對照組每天注射100 μ L PBS溶液，連續注射六天。
各組小鼠于第7天處死。
檢測指標
各組小鼠與第I天，第4天，第7天檢測外周血白細胞數，方法同實施例2. I。
統計學處理
各項數據均以x±s表示，實驗數據經方差齊性檢驗后，采用方差分析或t檢驗。
結果
表I顯示了實施例2. I自實驗開始第10天，各組小鼠胸骨骨髓細胞中粒系細胞的變化情況。
表I
權利要求
1.一種融合蛋白的用途，其特征在于，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :4所示，用于制備 (i)刺激骨髓間充質干細胞向造血干/祖細胞分化的藥物；或 (ii)促進粒系造血祖細胞增殖的藥物。
2.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述藥物用于 (1)預防和/或治療化療引起的造血功能低下； (2)預防和/或治療放療引起的造血功能低下；或 (3)預防和/或治療白細胞減少癥。
3.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述藥物在放療或化療之前、之中、和/或之后使用。
4.一種融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所示，其特征在于，用于促進粒系造血祖細胞的增殖。
5.一種融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:4所示，其特征在于，用于制備預防和/或治療白細胞減少癥的藥物。
6.一種體外促進粒系祖細胞增殖的方法，其特征在于，在粒系祖細胞的培養基添加100ng/mL飛ii g/mL的融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示。
7.—種藥物組合物，其特征在于，包含 融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示；以及 藥學上可接受的載體或賦形劑。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物在放療或化療之前、之中、和/或之后使用。
9.如權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還包括環磷酰胺。
10.如權利要求7所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備促進粒系造血祖細胞增殖的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種融合蛋白的應用，用于刺激骨髓間充質干細胞向造血干/祖細胞分化的藥物；或粒系造血祖細胞增殖的藥物，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示。且所述藥物可以用于預防和/或治療(i)化療引起的造血功能低下；(ii)放療引起的造血功能低下；或(iii)白細胞減少癥。
文檔編號A61P7/06GK102973922SQ201210553208
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月18日 優先權日2012年12月18日
發明者劉昌勝, 邢萬里, 王靖, 錢江潮, 梁婧 申請人:華東理工大學