專利名稱：腦炎病毒蛋白及其一種編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腦炎病毒蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
腦炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他異種蛋白引發的超敏反應所致的大腦急性炎癥性疾病。腦炎可以是病毒性感染原發的臨床表現，或者是繼發的臨床表現，引起原發的腦炎的病毒有脊髓灰質炎病毒，埃可病毒、柯薩奇病毒等流行性病毒，或散發性的通過 蚊子、蝶等節肢動物傳播的黃病毒屬的森林腦炎和批膜病毒科甲病毒屬的東方馬腦炎病毒
坐寸o甲病毒為披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員，以蚊蝶等吸血昆蟲為傳播媒介，可引起多種人畜共患傳染病。近年來，國外已對多株甲病毒部分或全部序列測序。國內對這類病毒的分子生物學研究亦取得一定的結果。已有的研究結果表明該病毒屬中和抗體決定簇主要集中在結構蛋白El和E2等糖蛋白上，其中E2蛋白上所占比例更高。加之近年來腺病毒載體因具有安全性好、宿主范圍廣、感染效率高等多種優點，被廣泛用于基因治療和基因工程疫苗研究，為此我們分析比較了多株甲病毒核苷酸序列，人工合成了同源性較高的3kb的核苷酸，利用腺病毒載體構建重組基因工程疫苗，為預防和治療疾病奠定了基礎。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種與腦炎病毒疫苗相關蛋白及其編碼基因。本發明提供的蛋白QE，人工合成，是如下I)或2)的蛋白I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白質。序列表中的序列2由982個氨基酸殘基組成，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白質QE的編碼基因也是本發明保護的范圍，所述編碼基因為如下1)-4)中任一所示的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5’末端第1-2946位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。含有上述編碼基因的重組載體、轉基因細胞系、重組菌、表達盒或重組病毒也是本發明保護的范圍。所述重組載體為pAdeasy-1和重組穿梭質粒經過同源重組得到的；所述重組穿梭質粒是在載體PShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位點間插入所述編碼基因得到的。所述重組病毒為重組腺病毒；所述重組腺病毒為將上述蛋白的編碼基因轉染宿主細胞獲得的重組腺病毒。所述宿主細胞為真核細胞，優選為離體的哺乳動物細胞，尤其優選為HEK-293細胞。本發明的另一個目的是提供一種疫苗。本發明提供的疫苗，其活性成分為如下任意一種
I)所述的蛋白；2)所述編碼基因；3)所述重組腺病毒。上述重組腺病毒在制備疫苗中的應用也是本發明保護的范圍。所述疫苗為腦炎病毒疫苗。上述重組腺病毒在制備提高IFN- Y活性的增強劑中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的實驗證明，從腦炎病毒克隆出QE通過轉染HEK-293細胞而組裝成攜帶有目標抗原基因的重組腺病毒vAd-QE。重組腺病毒vAd-QE感染293細胞能有效表達目的蛋白；通過滴鼻途徑接種BalB/C小鼠，利用間接免疫熒光技術檢測特異性抗體水平，結果表明，所構建的重組腺病毒雖然產生特異性抗體的時間和維持的水平有所不同，但均產生了較好體液免疫反應，為進一步開展免疫保護實驗提供了重要的數據支持。由于病毒在機體內極微量的蛋白表達即可激起免疫反應，因此構建的攜帶有腦炎病毒結構基因的重組腺病毒vAd-QE，有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗株。


圖1為pAdtrack-QE酶切鑒定2為重組質粒Pac I酶切和PCR鑒定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus) (HE Jing;CHANGGuoHui;WU Jin Song;LI ZhongDuo;ZHU QingYu Cloning and expression of E2 geneof easternequine encephalomyelitis virus. Bulletin of The Academy of MilitaryMedicalSciences. 2002. 02.公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。) HEK-293細胞(Invitrogen公司產品，Cat. No. R750-07);實驗所需限制性內切酶分別購自TaKaRa和Biolabs公司;脂質體Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司；Platinum pfx Taqase 購自 Invitrogen 公司。實施例1、重組腺病毒(vAd-QE)的獲得1、含有目的基因pAdtrack-QE的構建及鑒定
根據東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus) (NC-001547)的基因組序列，突變序列中的多個位點，設計出序列表中的序列I，人工合成出序列I。設計引物擴增編碼QE蛋白的基因，引物序列(引物分別含有KpnI和HindIII酶切位點)見下QE-F: 5，ACGGggtaccATGGCATCACTAGTGACCACCATGTGT-3，QE-R: 5，ACCCaagcttTGCCAATTGCTGCTGTATTC-3，以人工合成出序列I的DNA為模板，利用QE-F和QE-R引物對進行PCR反應，得到的PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到了預期大小一致的片段，約為3Kb。經測序，該PCR產物具有序列表中的序列I自5’末端第1-2967位核苷酸，將該PCR產物的基因命名QE，其OFR為序列I的自5’末端第1-2946位核苷酸，該基因編碼的蛋 白命名為QE，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2，序列2由982個氨基酸殘基組成。回收PCR產物，對PCR產物進行加“A”處理，處理后的PCR樣品與pMD_18T載體(TaKaRa公司產品，Code:D101A. Lot CK3201A)相連，轉化DH5a感受態細胞，挑取陽性菌落提取質粒后測序驗證，結果為該質粒為將序列表中序列I的自5’末端第1-2967位核苷酸插入pMD-18T得到的，命名為pTQE。用KpnI 和 HindIII 雙酶切重組質粒 pTQE 和質粒 pShuttle-CMV (Invitrogen公司產品，Catalog#240007),酶切產物分別用凝膠回收試劑盒切膠回收，并在T4DNA連接酶作用下于16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DHlOB (Invitrogen公司產品，Cat.No. 18290-015)后挑選陽性克隆，提取質粒進行測序，結果為該質粒為將序列表中序列I的自5’末端第1-2967位核苷酸插入pShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位點間得到的載體，命名為 pAdtrack-QE。將pAdtrack-QE進行酶切驗證，酶切產物經過1%DNA凝膠電泳。結果見圖1 所示，其中 1、DL2000 (Marker 條帶分別為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ;2、KpnI+Hindlll 消化 pAdtrack-QE ;3、EcoRII+EcoRV 消化pAdtrack-QE ;4、SalI+XbaI 消化 pShuttle-CMV ;5、DL15000 (Marker 條帶分別為 15000bp、10000bp、7500bp、2500bp、IOOObp和250bp)，從圖中看出，泳道I酶切后的產物顯示兩條電泳帶一條為質粒載體帶，大小9Kb，另一條為克隆的目的基因帶，大小約為3Kb，與相應的PCR擴增產物大小一致，進一步表明已成功的將QE基因(序列表中的序列I自5’末端第1-2967位核苷酸)克隆至質粒pShuttle-CMV得到pAdtrack-QE。2、重組腺病毒載體的構建菌BJ5183購自上海杰美基因醫藥科技有限公司，貨號為GMS12223. 2。將腺病毒骨架質粒pAdeasy-1 (Invitrogen 公司產品，Catalog#240005,含有 GFP報告基因)經過PacI (購自Biolabs公司，貨號為R05647S)酶切后，轉入宿主菌BJ5183中，得到含有腺病毒骨架質粒pAdeasy-1的宿主菌BJ5183。將上述pAdtrack-QE和穿梭質粒pShuttle-CMV分別用PmeI (購自Biolabs公司，貨號為R0560S)經37°C充分消化，使用Gel Extraction kit試劑盒(購自OMGEA公司，貨號為D2500-01)回收線性化的 pAdtrack-QE 和 pShuttle-CMV。將線性化的質粒pAdtrack-QE電轉化到含有腺病毒骨架質粒pAdeasy-1的宿主菌BJ5183感受態細胞中，由于大腸桿菌BJ5183具有Sm抗性，pAdeasy-1具有Amp抗性，而重組質粒pAdtrack-QE和穿梭載體質粒pShuttle-CMV具有Kan抗性,在重組過程中穿梭質粒上的Kan抗性取代了 pAdeasy-1上的Amp抗性，因此根據Kan和Sm雙重抗性來篩選陽性克隆，得到的陽性克隆。提取轉入線性化的質粒pAdtrack-QE的陽性克隆的質粒進行Pac I酶切鑒定，1%DNA凝膠電泳結果見圖2A所示，其中1:DL15000Marker 2 pAdTrack-QE 3 :陽性克隆質粒4 :pShuttle-CMV 5:pAdeaSy-l。從圖中可以看出，泳道3酶切后產生兩個片度，小片度大小為4. 5Kb左右，含有復制子和卡那霉素抗性基因，大片度為含有目的基因QE的病毒骨架，大小約36Kb (病毒骨架大小約33. 5Kb而目的基因QE 3Kb)，將該重組質粒命名為重組質粒pAd-QE ;泳道2重組穿梭質粒pAdTack-QE經過Pac I酶切后,產生2個片段，其中一個含有目的基因QE約9Kb，另一個片段含有穿梭質粒pShuttle-CMV上的復制子和卡那霉素抗性基因大小約3Kb。提取轉入線性化的質粒pAdtrack-QE的陽性克隆的質粒進行PCR鑒定，引物為 QE-F、QE-R (請核實)，結果見圖 2B 1 DL15000Marker 2 pShuttle-CMV 3 pAdTrack-QE4 pAd-QE 5 :pAdeasy_l,可以看出，重組質粒pAd-QE可擴增出與預期的目的片度3Kb,進一步說明已經成功構建攜帶有目的基因QE的重組腺病毒骨架質粒pAd-QE。3、組裝成重組腺病毒將HEK-293細胞接種到6孔板中，37 °C培養，細胞生長至60%_70%，用脂質體Lipofectamin 2000 (購自Invitrogen公司)介導重組腺病毒骨架質粒pAd-QE轉染入細胞中，轉染完成7-10天后，收集細胞，經3輪反復凍融，離心收集上清液，即為含有目的基因的重組腺病毒vAd-QE。轉染實驗按照說明書進行，培養7-10天，定期在熒光顯微鏡下檢測是否產生熒光，判斷轉染是否成功，由于該重組病毒上含有綠色熒光蛋白(GFP)的報告基因，因此可以說明一旦有熒光就表示轉染成功。4、重組腺病毒vAd-QE的擴增及目的蛋白的表達I)重組腺病毒vAd-QE的擴增將上述3獲得的轉染完成7-10天后，收集細胞，經3輪反復凍融，離心收集上清液，即為重組腺病毒vAd-QE，進行下一代擴增，連續擴增3代，第二次收集上清液，比第一次
數量增多。2)目的蛋白的表達取200ul上述獲得的第二次收集的上清液(重組腺病毒vAd-QE，病毒的濃度為LgTCID5tlA). 2ml=8. 0)感染5xl06的HEK-293細胞，4天后，收集細胞。細胞經處理后進行SDS-PAGE電泳。結果經SDS電泳，得到大小為110KD的蛋白(QE蛋白)，與預期蛋白的大小一致。說明重組腺病毒有效的介導QE在細胞中表達。采用同樣的方法將上述線性化的pShuttle-CMV和pAdeasy-1共同轉入宿主菌BJ5183感受態細胞中，得到重組腺病毒載體，記作pAd-GFP ;將pAd_GFP轉染HEK-293細胞，獲得陰性對照腺病毒vAd-GFP。對照腺病毒vAd-GFP中無QE蛋白表達；實施例2、重組腺病毒(vAd-QE)的滴鼻接種中和抗體測定6-7周齡的BALB/c小鼠隨機分為3組，分別為vAd_GFP對照組、vAd-QE免疫組和PBS對照組，每組20只小鼠。vAd-GFP對照組拭鼻方式感染20ul由實施例1獲得對照腺病毒vAd-GFP(108pfu)ovAd-QE免疫組拭鼻方式感染20ul由實施例1獲得的重組腺病毒(vAd_QE)(108pfu)oPBS對照組拭鼻方式感染20ulPBS溶液(0. 01M/L pH7. 2)一、血清和淋巴細胞檢測將3個小組在第一次免疫后的第4周加強免疫一次。在免疫后每間隔一周時間通過尾靜脈采集小鼠血液，離心后分別收集血清和淋巴細胞沉淀。
1、間接免疫熒光試驗測定免疫小鼠血清中病毒的抗體反應用東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus)感染的HEK-293制備抗原片，制備的方法如下所述實驗前準備把抗原片擺放在抗原架上，每個架上排放2排，I排4個，完畢后用罩子蓋上防止灰塵的進入。之后按照下面步驟進行I)待75cm2方瓶的HEK-293細胞生長至80%左右的時候，用東部馬腦炎病毒2ml感染細胞I小時后，吸出吸附液，補加新鮮的細胞維持液，放入培養箱中培養；2)當細胞出現細胞病變的時候(約25% — 50%)，按照細胞傳代的方法消化細胞，用適量體積的培養液(含有10%胎牛血清的DMEM細胞生長液，具體配方向500mlDMEM液體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-Antimycotic、100X NEAA、lOOulHEPES,之后用實驗室配制的經過0. 22um濾膜過濾除菌的7. 5% (質量百分含量)NaHCO3調節溶液的pH值至
7.0—7. 2，上述液體均為GIBCO公司產品);3ml)懸浮細胞，每個抗原孔加入40ul細胞懸液，蓋上蓋子后放入培養箱中繼續培養8小時；3)取一燒杯內盛PBS溶液(0. 01mol/L pH=7. 2)，將吸附后的抗原片緩緩放入溶液中，浸泡Imin左右,取出放在工作臺內晾干,約需30min ；4)將抗原片放入盛有丙酮(國藥集團化學試劑有限公司分析純濃度99. 5%)的燒杯中，-20 0C 30min或者過夜；5)取出晾干后保存于低溫(_40°C以下)冰箱中備用。間接免疫熒光法采集小鼠全血后放置于37°C培養箱孵育30min，經SOOrpm離心15min后吸取上清得到血清。之后將血清按照實驗要求進行稀釋后進行間接免疫熒光實驗，具體實驗步驟如下I)從冰箱中取出抗原片，肉眼觀察上面的細胞是否脫落，如果有脫落孔，放棄不用；2)在抗原片上用蠟筆在吸附有抗原的畫圈周圍劃一圈，防止所加樣品溢流；3)根據實驗的需要稀釋所檢測的血清后加樣，每孔20_25ul，一般需要做復孔，故需要50ul，根據需要做倍比稀釋；首濃度按照1:10，故需要加入IOul血清+90ul抗體稀釋液，在漩渦混合器上充分混勻后取出50ul 1:10稀釋液+50ul血清稀釋液(1:20)，依此稀釋下去，一般稀釋至1:160 ；4)把已經加樣的抗原片放入鋪有塑料板的飯盒中，放入37°C、5%C02培養箱中孵育30min ；5)取出抗原片，放入洗板槽內，向里面加入洗滌液(0. 005M PBS+0. 02%(體積百分含量)Tween 20)，在水平振蕩器上洗滌5min，重復3次；6)待抗原片完全風干后，加入1:50稀釋的滅光抗體25ul/孔，放入飯盒后在37 C、5%C02培養箱中孵育30min ；熒光抗體的稀釋取出針對所加入血清來源的適量熒光抗體，用0. 02%(質量百分含量)伊文斯蘭溶液按照1:50稀釋抗體，該實驗所使用的抗體為FITC-conjugate-GoatAnt1-Human IgG 購自 Sigma 公司。7)重復步驟5);8)風干后，滴加無菌水在熒光顯微鏡下觀察熒光情況并記錄結果。利用間接免疫熒光試驗測，結果顯示在首次免疫I周后小鼠血清抗體水平開始升高，血清效價為1:20，在首免2周后血清效價達至1:80，3周后降至較低水平；血清效價為 1:30。加強免疫后，抗體水平再次迅速升高，升高幅度比首次免疫整體要高，血清效價達到I 160。對照組vAd-GFP和PBS始終未檢測出特異性抗體(小于1:10)。2、流式分析淋巴細胞中⑶/、⑶/數流式分析淋巴細胞中⑶/、⑶/數，結果如下免疫小鼠中，vAd-QE免疫I周后⑶/淋巴細胞占總淋巴細胞的10%，2周以后恢復至正常水平約占5%，加強免疫后，vAd-QE免疫組⑶/淋巴細胞開始持續升高，占總淋巴細胞的10%并在加免4周后達至30%，而PBS對照組⑶/淋巴細胞一直占總淋巴細胞的5%。免疫組小鼠中，vAd-QE免疫I周后達至高峰，⑶8+淋巴細胞占總淋巴細胞的16%，隨后恢復至正常水平約占2%，在首免后3周⑶/淋巴細胞數量再次升高占總淋巴細胞的3% ；加強免疫后，vAd-QE免疫組OT8+淋巴細胞開始持續升高，在免疫I周后達至峰值約占總淋巴細胞的12%，隨后緩慢下降至正常水平2%，3周后又緩慢升至較高水平約占8%。vAd-GFP對照組在首免后OT8+淋巴細胞數量變化則不明顯。PBS對照組則無顯著變化。二、利用酶聯免疫斑點試驗(ELISP0T)對細胞因子生成細胞進行定量加強免疫4周后，每組隨機挑選4只小鼠，處死后立即無菌采取脾臟，加入IOml含有10%胎牛血清的1640培養液(含有10%胎牛血清的1640培養液向500mlRPMIMEDIUM1640 液體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA,lOOulHEPES，之后用實驗室配置的經過過濾除菌的7. 5% NaHCO3 (質量百分比)調節溶液的pH值為 7. 0—7. 2 ;上述 RPMI MEDIUM1640、胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOXNEAA、HEPES 均為 GIBCO 公司產品；RPMI MEDIUM1640 GIBCO 公司產品，L0T:8109086)，將脾組織通過200目銅網制成細胞懸液,收集到無菌的離心管中，15000rpm/min離心5min,棄上清液后用1640培養基離心洗滌細胞兩次，最后將脾細胞稀釋成2X IO7個/ml，制成細胞懸液備用。以細胞培養的東部馬腦炎病毒作為特異刺激因子(將2 X IO7個/ml個脾細胞IO8Pfu的東部馬腦炎病毒混合，共同孵育48小時，按照ELISP0T實驗的操作，脾細胞與特異的刺激因子要分別加入到孔中，之后在孔內反應，不能在孔外混合后加入其內)，利用酶聯免疫斑點試驗(ELISP0T)對細胞因子生成細胞進行定量。具體的實驗步驟1. Coating antibody (包被抗體)無菌條件下進行用Coating buffer (I XPBS pH7. 2)稀釋 capture 抗體(200 倍)，終濃度 5ug/ml 包被板子，每孔加IOOul稀釋的capture抗體4°C過夜。
2. Blocking (封閉)無菌條件下進行吸干孔中包被液，洗板子，每孔加入200ul Blocking溶液，洗孔一次。(在滅菌吸水紙上扣干)3. Cell Activation (刺激細胞)無菌條件下進行3.1棄Blocking溶液，準備刺激用的抗原，用組織完全培養基稀釋適宜濃度50ug/ml，每孔加入IOOul ；(不要拍板子)3. 2準備I X IO6個脾細胞懸液，每孔加入IOOul ；(注避免震動)3. 3蓋上蓋子，板子放置37°C，5%C02, 99%濕度的培養箱根據細胞情況培養48小時。(注時刻避免碰撞) 4. Detection antibody (檢測抗體):4.1在無菌條件下吸去細胞懸液，用去離子水(冰冷的去離子水，低滲法裂解細胞)洗2遍，每遍浸泡3-5min，以下實驗操作可以拿到超凈工作臺外進行；4. 2 每孔用 200ul wash buffer I 洗 3 遍，棄 wash buffer I (最后一遍后拍干)4. 3 稀釋 Detection 抗體，用稀釋 buffer (I XPBS+10%FBS) 250 倍稀釋，終濃度2ug/ml。每孔加入 IOOul ；4. 4蓋上蓋子，室溫培養2小時。5.加入酶連抗體5.1棄Detection抗體溶液,每孔用200ul wash buffer I洗3遍。(最后一遍拍干);5. 2 用稀釋 buffer 稀釋 Streptavidin-HRP (用稀釋 buffer (I XPBS+10%FBS)稀釋100倍。現用現配，用完多余的棄之)每孔加IOOul ；5. 3蓋上蓋子，室溫培養I小時。6 結果檢測6.1 棄 Streptavidin-HRP 溶液，每孔用 200ul wash buffer I 洗 4 遍；6. 2 每孔用 200ul wash buffer II洗 2 遍(最后一遍拍干)；6. 3加入底物AEC，每孔加IOOul (注意避光)。控制斑點形成約需要15min ；6. 4用去離子水(洗2遍)終止底物反應；6.5室溫避光空氣吹干板子2小時-過夜，至板子全干，避光保存板子待檢測。注不要將板子放到烤箱中，防止膜發脆、破裂。)結果ELISP0T的結果是通過最后的板子出斑的數目來確定，通過分析可以看到vAd-QE免疫組出斑數目明顯增加，說明經東部馬腦炎病毒的刺激后，vAd-QE免疫組小鼠脾細胞分泌IFN- y活性明顯增高，抗原刺激后vAd-QE免疫組小鼠脾細胞分泌IFN- y活性是對照vAd-GFP組的5倍，是PBS對照組的19倍(根據出斑數目來統計倍數)。三、攻毒實驗1、發病和存活狀況加強免疫4周后，vAd-GFP對照組、vAd-QE免疫組和PBS對照組的每組處死后剩余的小鼠在BSL-3實驗室進行攻毒實驗，再將8只小鼠為一組，分為兩組vAd-GFP對照組A :腹腔注射215個LD5tl (半數致死劑量)東部馬腦炎病毒vAd-GFP對照組B :腹腔注射21個LD5tl東部馬腦炎病毒
vAd-QE免疫組A :腹腔注射215個LD5tl (半數致死劑量)東部馬腦炎病毒vAd-QE免疫組B :腹腔注射21個LD5tl東部馬腦炎病毒PBS對照組A :腹腔注射215個LD5tl (半數致死劑量)東部馬腦炎病毒PBS對照組B :腹腔注射21個LD5tl東部馬腦炎病毒持續4周觀察小鼠發病和存活狀況。結果為加強免疫4周后，215個LD50的東部馬腦炎病毒攻擊后，vAd_QE免疫組A的保護效率為87. 5% (8只小鼠死亡I只小鼠)；21個LD50東部馬腦炎病毒攻擊后，vAd-QE免疫組B的保護率為100% (無小鼠死亡);對照組(vAd-GFP對照組A、vAd-GFP對照組B、PBS 對照組A、PBS對照組B)均無保護作用(8只小鼠都死亡)。保護率是最后存活小鼠的數量與其攻毒前小鼠的數量比值。2、利用BHK細胞單層測定小鼠血清中和抗體收集上述攻毒后的各組小鼠的血清，利用BHK細胞(Invitrogen公司產品，Cat.No. R760-07)單層測定小鼠血清中和抗體。先將免疫小鼠血清適當稀釋后，置56°C水浴中處理30min，破壞其中的補體和其他不耐熱的非特異性毒性因子，然后以維持液(含有2%(體積百分比)胎牛血清的細胞維持液的配置方法向500ml DMEM液體中加入IOml胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAAUOOuI HEPES，之后用實驗室配置的經過過濾除菌的7. 5%NaHC03 (質量百分比)調節溶液的pH值為7. 0—7. 2 ;上述DMEM、胎牛血清、100XAntibiotic-AntimycoticUOOX NEAA,HEPES均為GIBCO公司產品)在無菌離心管中進行2倍連續稀釋。取100個TCID5tl東部馬腦炎病毒病毒液和等體積不同稀釋度的血清，充分混勻后置37°C孵育lh，中間上下顛倒離心管混勻液體1-2次，I小時后取出96孔板，其內的BHK細胞已鋪滿單層，吸去細胞單層上的培養基，加入作用過的病毒-抗體混合液(即上述孵育過的混勻液體)，培養板上同時設陽性和陰性對照孔(陽性對照為用細胞維持液稀釋為100個TCID5tl的東部馬腦炎病毒病毒液，陰性對照為用細胞維持液稀釋的不同濃度的血清，空白對照為細胞維持液)。放入含有5%C02的37°C培養箱中培養，每天觀察和記錄細胞病變的情況。中和實驗檢測血清效價，具體方法如下通過顯微鏡觀察細胞的病變情況(病變時細胞膨大變圓聚集)，當孔內細胞病變達到90%以上記為++++，細胞病變達到75%以上記為+++，細胞病變達到50%以上記為++，細胞病變達到25%以上記為+，無細胞病變記為_，最后用Reed-Muench法計算血清的中和指數。結果接種病毒前vAd-QE免疫組A和vAd-QE免疫組B小鼠血清效價均為1:120，攻毒4周后，接種21個LD50的東部馬腦炎病毒攻擊后的vAd-QE免疫組B存活小鼠的血清效價為1:360，215個LD50東部馬腦炎病毒攻擊后的vAd-QE免疫組A的存活小鼠血清效價則為1:600。而對照組(vAd-GFP對照組A、vAd-GFP對照組B、PBS對照組A、PBS對照組B )均無特異性抗體的產生。結果表明，所構建的重組腺病毒vAd-QE產生了較好體液免疫反應，為進一步開展免疫保護實驗提供了重要的數據支持。
權利要求
1.含有蛋白的編碼基因的重組病毒； 所述蛋白，是如下I)或2)的蛋白 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白； 2)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白。
2.根據權利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述編碼基因為如下al)_a4)中任一所不的基因 al)序列表中序列I所不的DNA分子； a2)序列表中序列I自5’末端第1-2946位核苷酸所不的DNA分子； a3)在嚴格條件下與al)或a2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子； a4)與al)或a2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
3.根據權利要求1或2所述的重組病毒，其特征在于 所述重組病毒為重組腺病毒；所述重組腺病毒為將重組載體轉入宿主細胞后，得到的重組腺病毒； 所述重組載體為含有權利要求2中所述編碼基因的重組載體。
4.根據權利要求3所述的重組病毒，其特征在于所述重組載體為pAdeasy-1和重組穿梭質粒經過同源重組得到的；所述重組穿梭質粒是將權利要求2中所述編碼基因插入到載體pShuttle-CMV的多克隆位點間得到的質粒。
5.根據權利要求3或4所述的重組病毒，其特征在于所述宿主細胞為真核細胞。
6.根據權利要求5所述的重組病毒，其特征在于所述真核細胞為離體的哺乳動物細胞。
7.根據權利要求6所述的重組病毒，其特征在于所述離體的哺乳動物細胞為HEK-293細胞。
8.一種疫苗，它的活性成分為權利要求1-7中任一所述的重組腺病毒。
9.權利要求1-7中任一所述重組腺病毒在制備疫苗中的應用；所述疫苗具體為腦炎病毒疫苗。
10.權利要求1-7中任一所述重組腺病毒在制備提高IFN-Y活性的增強劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種與腦炎病毒疫苗相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。本發明的實驗證明，本發明獲得的重組腺病毒vAd-QE有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗。
文檔編號A61K48/00GK103014063SQ20121055295
公開日2013年4月3日 申請日期2010年10月9日 優先權日2010年10月9日
發明者常國輝, 林磊, 吳曉燕, 戶義, 張雨, 柳洪濤, 李靖, 羅彥軍, 孫偉, 康曉平, 楊銀輝, 祝慶余 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所