一種金烏賊蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種金烏賊蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途，該抗氧化肽的氨基酸序列為Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met（APPENGMAQM），分子量為1045.21Da。本發明制備工藝科學合理，酶解過程易監控，制得的抗氧化肽具有抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等應用。
【專利說明】一種金烏賊蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于工程【技術領域】，具體涉及功能性食品加工技術或生物制藥技術，尤其是一種酶解金烏賊蛋白制備抗氧化肽的方法。
【背景技術】 [0002]人體代謝和食品氧化變質過程中產生的自由基會對細胞和組織造成嚴重的氧化損傷，從而導致心血管疾病、動脈硬化、癌癥和身體衰老等疾病。以丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)和特丁基對苯二酚(TBHQ)為代表的化學合成抗氧化劑由于抗氧化活性好、價格便宜被廣泛地應用到食品工業中。但是，化學合成抗氧化劑的毒副作用引起了廣泛關注，部分國家已限量或禁止使用。因此，天然抗氧化劑成為開發熱點。
[0003]蛋白質優良的乳化特性使其能在油水界面發揮介導作用，從而能在生物體內清除過量自由基，抑制膜脂質過氧化。近年來人們發現，介于蛋白質和氨基酸間的肽類由于結構特點，抗氧化活性往往更為顯著。玉米抗氧化肽Leu-Asp-Tyr-Gln、Tyr-Ala和 His-Cys-Met-Leu,大豆抗氧化妝 Leu-Val-Asn-Pro-His-Asp-His-Gln-His-Gln-Asn、 Leu-Leu-Pro_His_His_AIa-Asp-AIa-Asp-AIa-Asp-Tyr、 Leu-Leu-Pro-His_His、Val-Asn-Pro-His-Asp-His-Gln-Asn,對蟲下抗氧化妝 Ile-Lys-Lys、Phe-Lys-Lys 和Phe-1le-Lys-Lys,阿拉斯加青鮮魚抗氧化肽Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr等均顯示了顯著的生物活性，具有較大的應用前景。
[0004]金烏賊McWmia)，又名墨魚、烏魚，屬軟體動物門、頭足綱、烏賊目、烏賊科，分布在我國沿海，以黃、渤海產量較多。金烏賊肉營養豐富，蛋白質含量高，并富含鈣、磷、鐵等元素。目前，金烏賊主要鮮用、加工成罐頭食品或干制品。但是， 申請人:發現，以金烏賊蛋白為原料，利用酶解、超濾和色譜等技術制備高活性抗氧化肽及其應用未見報道。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀提供一種能夠抑制脂質過氧化和清除自由基作用的金烏賊蛋白抗氧化肽，其可作為藥品、保健食品和食品添加劑。
[0006]本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種金烏賊蛋白抗氧化肽的制備方法。
[0007]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:該金烏賊蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為十肽化合物，氨基酸序列為AEH-P3:Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)，分子量為 1045.21 Da。
[0008]上述金烏賊蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括下述步驟:
1)將洗凈、去內殼的金烏賊肉用高速組織搗碎機勻漿，按照料液比Ig:3飛mL加入異丙醇，于35~40°C中脫脂18~24 h，然后于4000~5000 rpm離心l(Tl5min除去異丙醇，收集脫脂金烏賊肉固形物；
2)按固液比lg:f3mL向步驟I)所得脫脂金烏賊肉固形物中加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，調節PH為6.5~7.5，得到混合液；3)將上述混合液溫度升至5(T60°C攪拌預熱1(T15min,以脫脂金烏賊肉固形物的質量為基準加入0.8~1.2%的木瓜蛋白酶，在5(T60°C酶解4~6h，得到酶解產物；
4)將上述酶解產物升溫至9(T95°C并恒溫保持l(Tl5min后，冷卻至室溫，然后于4000^5000 rpm離心l(Tl5min，得到酶解液，凍干得酶解物干粉；再將酶解物干粉依次經超濾和層析處理，得到抗氧化肽。
[0009]作為改進，所述步驟4)的超濾和層析的具體過程為:
超濾:將酶解物干粉溶于PH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配成10-15 mg/mL的溶液，于0.1~0.15 MPa的工作壓力和20~25 °C的溫度下采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，凍干得超濾酶解物干粉；
層析:將上述超濾酶解物干粉用PH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配成8~12 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 6.5~7.5磷酸鹽緩沖液進行洗脫，根據220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，凍干得凝膠層析酶解物干粉；將上述凝膠層析酶解物干粉用PH 6.5-7.5磷酸鹽緩沖液配成45飛5μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據抗氧化活性得I個高活性抗氧化妝 Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)。
[0010]優選，所述反相高效液相色譜條件為:進樣量15~25 yg;色譜柱為Zorbax C18(250mmX4.6mm, 5 μ m);流動相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長220 nm。
[0011]本發明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為:一種金烏賊蛋白抗氧化肽的應用，其特征在于 Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)對 DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)亦顯不出良好的脂質過氧化抑制作用；Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑進行應用。
[0012]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明工藝科學合理，選用木瓜蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時融合超濾分級和色譜精制，酶解過程易監控，同時制得的抗氧化肽具有較高的活性；與化學合成的抗氧化劑相比較，本發明制得的抗氧化肽具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發明的超濾分級組分AEH-1II的葡聚糖凝膠G-25層析圖；
圖2是本發明的超濾分級組所分離各分離組分(AEH-1I1-1、AEH-1I1-2、AEH-111-3和AEH-111-4)的DPPH自由基清除活性圖；
圖3是本發明的葡聚糖凝膠G-25柱層析制備酶解物AEH-1I1-3的RP-HPLC分析圖；圖 4 是本發明的抗氧化妝 AEH-P3 (Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met)的質譜圖。
[0014]圖5是本發明的抗氧化肽的DPPH自由基清除活性；
圖6是本發明的抗氧化肽的羥自由基清除活性；圖1是本發明的抗氧化肽的ABTS自由基清除活性；
圖8是本發明的抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除活性)。
[0015]圖9是本發明的抗氧化肽的抗脂質過氧化實驗圖。
【具體實施方式】
[0016]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0017]一種金烏賊蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:金烏賊肉〃脫脂〃酶解〃酶解物〃超濾〃凝膠過濾層析〃高效液相色譜制備〃抗氧化肽。
[0018]實施例1:
1)將洗凈、去殼的金烏賊肉用高速組織搗碎機勻漿，然后按照料液比lg:4mL加入異丙醇，于35°C中脫脂24 h，然后于4500 rpm離心15min除去異丙醇，收集脫脂金烏賊肉固形物；
2)按固液比lg:3mL向上述脫脂金烏賊肉固形物中加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液,調節pH為7.0，得到混合液；
3)將上述混合液溫度升至55°C攪拌預熱10min,以所述脫脂金烏賊肉固形物的質量為基準加入1.0%的木瓜蛋白酶，在55°C酶解5h，得到酶解產物；
4)將上述酶解產物升溫至90°C并恒溫保持15min后，冷卻至室溫，然后于4500rpm離心15min，得到酶解液，凍干得酶解物干粉；再將酶解物干粉依次經超濾和層析，得到抗氧化肽，利用蛋白/多肽序列分析儀和質譜測定其結構，具體過程為:
①超濾:將酶解物干粉溶于PH7.0的磷酸鹽緩沖液配成15 mg/mL的溶液，于0.1~
0.15 MPa的工作壓力和20 °C的溫度下采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，凍干得超濾酶解物干粉；
②層析:將上述超濾酶解物干粉用PH7.0的磷酸鹽緩沖液配成10 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 7.0磷酸鹽緩沖液進行洗脫，根據220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分(圖1)，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物(圖1)，凍干得凝膠層析酶解物干粉；
③反相高效液相色譜(RP-HPLC)精制:將上述凝膠層析酶解物干粉用pH7.0磷酸鹽緩沖液配成50 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化(條件:高效液相色譜儀:Agilent 1260 ;色譜柱為:Zorbax C18 (250mmX4.6mm, 5 μ m);柱溫:室溫；流動相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸);洗脫速度1.0 mL/min ;檢測波長220 nm)，根據抗氧化活性得I個高活性抗氧化肽AEH-P3 (圖2)。
[0019]④結構檢測:收集活性最高的抗氧化肽AEH-P3經檢測為單一峰，利用蛋白/多妝序列分析儀測定氨基酸序列為Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met(APPENGMAQM)，分子量為 1045.21 Da (圖 3)。
[0020]將上述制得的金烏賊蛋白抗氧化肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met(APPENGMAQM)進行DPPH自由基清除實驗、羥基自由基清除實驗、ABTS自由基清除實驗、超氧陰離子自由基清除實驗和脂質過氧化抑制實驗。實驗結果表明=Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-GIy-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)對 DPPH 自由基(EC50 4.01 mg/mL)、羥自由基(EC50 4.66mg/mL)、ABTS自由基(EC5tl 3.44 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5tl 6.03 mg/mL)具有良好的清除作用；同時，Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)亦顯不出良好的脂質過氧化抑制作用。
[0021]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形 ，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種金烏賊蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為Ala-PiO-PiO-GIu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQ ID NO: 1，分子量為 1045.21 Da。
2.—種權利要求1所述的金烏賊蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將洗凈、去內殼的金烏賊肉用高速組織搗碎機勻漿，然后按照料液比Ig:3飛mL加入異丙醇，于35~40°C中脫脂18~24 h，然后于4000~5000 rpm離心l(Tl5min除去異丙醇，收集脫脂金烏賊肉固形物； 2)按固液比lg:l~3mL向步驟I)所述脫脂金烏賊肉固形物中加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，調節PH為6.5~7.5，得到混合液； 3)將步驟2)所述混合液溫度升至5(T60°C攪拌預熱1(T15min,以步驟I)所述脫脂金烏賊肉固形物的質量為基準加入0.8~1.2%的木瓜蛋白酶，在5(T60°C酶解4~6h，得到酶解產物； 4)將步驟3)所得的酶解產物升溫至9(T95°C并恒溫保持l(Tl5min后，冷卻至室溫，然后于4000~5000 rpm離心l(Tl5min，得到酶解液，凍干得酶解物干粉；再將酶解物干粉依次經超濾和層析純化，得到抗氧化肽。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5 X IO6 U/g。
4.根據權利要求2所述 的制備方法，其特征在于所述步驟4)的超濾和層析的具體過程為: 超濾:將酶解物干粉溶于PH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配成1(T15 mg/mL的溶液，于0.1~0.15 MPa的工作壓力和20~25 °C的溫度下采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，凍干得超濾酶解物干粉； 層析:將上述超濾酶解物干粉用PH 6.5~7.5的磷酸鹽緩沖液配成8~12 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用pH 6.5~7.5磷酸鹽緩沖液進行洗脫，根據220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，凍干得凝膠層析酶解物干粉；將上述凝膠層析酶解物干粉用PH 6.5^7.5磷酸鹽緩沖液配成45飛5μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據抗氧化活性得I個高活性抗氧化妝 Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQ ID NO:1; 優選，所述反相高效液相色譜條件為:進樣量15~25 μ g;色譜柱為Zorbax C18(250mmX4.6mm, 5 μ m);流動相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長220 nm。
5.一種權利要求1所述的金烏賊蛋白抗氧化肽的應用，其特征在于Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQ ID NO:1 應用于對 DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除；Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-MetSEQ ID NO:1 應用于脂質過氧化抑制；Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQID NO:1作為藥品、保健食品和食品添加劑進行應用。
【文檔編號】A61P39/06GK103467568SQ201310194623
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2013年5月23日
【發明者】王斌, 郁迪, 徐銀峰, 胡發遠 申請人:浙江海洋學院