一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用，屬于中藥領(lǐng)域，由連翹、金銀花、板藍(lán)根、大黃、廣藿香等藥味組成，本發(fā)明藥物可以破壞細(xì)菌生物被膜，殺滅細(xì)菌。
【專利說明】一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種中藥組合物的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌在不利于其生長的環(huán)境下，通過自身產(chǎn)生的胞外多糖被膜多聚物相互粘連形成的細(xì)菌群落。目前認(rèn)為99%的細(xì)菌以生物膜的形式存在。人類感染疾病，80%涉及細(xì)菌生物膜。
[0003]細(xì)菌生物被膜(B1film，BF)中水分含量可高達(dá)97%，除了水和細(xì)菌外，BF還含有大分子多聚物，如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等，同時(shí)還含有吸附的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。BF具有極強(qiáng)的耐藥性及免疫逃避性，針對(duì)BF形成的藥物滲透屏障，采取了聯(lián)合用藥，用一種藥物破壞BF，用另一種藥物進(jìn)入BF殺菌，由于BF的頑固性，用藥量難以控制，用量低，難以去除BF，會(huì)產(chǎn)生耐藥性，用藥量高，又會(huì)涉及藥物的毒性問題。因此，目前還沒有有效的藥物破壞細(xì)菌生物膜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥制成:
連翹210-280 金銀花210-280 板藍(lán)根210-280大黃45-55 廣藿香75-100綿馬貫眾210-280紅景天75-100 薄荷腦5.5-8.5 麻黃75-100 苦杏仁75-100 魚腥草210-280 甘草75-100 石膏 210-280。
[0005]作為優(yōu)選方式，所述中藥組合物由下列重量份的原料藥制成:
連翹210 金銀花280板藍(lán)根210大黃45廣藿香100 綿馬貫眾280紅景天75薄荷腦5.5麻黃75 苦杏仁100 魚腥草210 甘草100石膏280。
[0006]或
連翹280 金銀花210板藍(lán)根280大黃55廣藿香75 綿馬貫眾210紅景天100薄荷腦8.5麻黃100 苦杏仁75 魚腥草280 甘草 75石膏 210。
[0007]或
連翹258 金銀花258板藍(lán)根258大黃50廣藿香88 綿馬貫眾258紅景天88薄荷腦8 麻黃85苦杏仁85 魚渥草255 甘草 85石骨 255。
[0008]本發(fā)明還提供了所述中藥組合物的活性成分由以下步驟制成:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；
步驟(5)所得干膏粉、步驟(2)所得揮發(fā)油與薄荷腦共同構(gòu)成該中藥組合物的活性成分。
[0009]本發(fā)明藥物的劑型為膠囊劑、片劑、散劑、口服液、丸劑、酊劑、糖漿劑、栓劑、凝膠齊U、噴霧劑或注射劑。
[0010]為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時(shí)加入藥學(xué)可接受的輔料，例如:填充齊?、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑包括:淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括:淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括:硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括:糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括:甜味劑及各種香精；防腐劑包括:尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質(zhì)包括:PEG6000，PEG4000，蟲蠟等(范碧亭《中藥藥劑學(xué)》，上海科學(xué)出版社.1997年12月第I版.各劑型記載的輔料)。
[0011]其中膠囊劑的制備方法，是由以下步驟制成:
(1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；
(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；
(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝入膠囊，即得。
[0012]其中顆粒劑的制備方法，是由以下步驟制成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用；
(5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用；
(6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒；
(7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
[0013]所述細(xì)菌為耐甲氧西林耐藥菌。
[0014]所述耐甲氧西林耐藥菌為大腸桿菌、肺炎克雷伯菌。
[0015]本發(fā)明藥物的其他劑型按比例稱取原料藥后，采用常規(guī)的制備方法制備，例如，范碧亭《中藥藥劑學(xué)》(上海科學(xué)出版社1997年12月第I版)記載的制備工藝，制成藥劑學(xué)可接受的常規(guī)劑型。
[0016]本發(fā)明的各藥味的范圍是經(jīng)過優(yōu)化篩選的，超出權(quán)利要求1中連翹210-280 金銀花210-280 板藍(lán)根210-280大黃45-55廣藿香75-100綿馬貫眾210-280紅景天75-100 薄荷腦5.5-8.5麻黃75-100 苦杏仁75-100 魚腥草210-280 甘草75-100石膏210-280的范圍，藥物的作用效果不明顯。
[0017]為證實(shí)本發(fā)明藥物組合物破壞細(xì)菌生物膜的作用效果，用實(shí)施例制得的膠囊劑，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):
I材料和方法 1.1材料
1.1.1菌株
大腸桿菌(Escherichia coli, ATCC 25922)，肺炎克雷伯菌。
[0018]藥品制備及分組
注射用青霉素鈉，80萬單位，華北制藥生產(chǎn)，批號(hào)X1108105。甲氧西林鈉鹽(methicillin sodium salt),購自 Sigma 公司，批號(hào) 1371696V。
[0019]本發(fā)明藥物膠囊內(nèi)容物，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)111006，每克含生藥9.78g，進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)時(shí)，配置成內(nèi)容物粉末，按以下方法將其分為三部分:
(I)乙酸乙酯提取物(YSYZ):反復(fù)用乙酸乙酯適量溶解10g內(nèi)容物粉末，離心4分鐘，轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)/分，取上清，至所收集的乙酸乙酯上清肉眼觀為無色透明。水浴80°C (稍高于乙酸乙酯的沸點(diǎn))加熱至蒸干，并用乙醇溶解備用。(2)殘?jiān)嵛?CZ):100g內(nèi)容物粉末乙酸乙酯提取后剩余的藥殘?jiān)眉兯ㄈ苡?00ml容量瓶中水浴80°C加熱2小時(shí)，充分溶解反復(fù)離心藥液，除去藥渣1000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘。將澄清藥液蒸干以同體積培養(yǎng)基溶解備用。(3)總水提液(ZS):將10g內(nèi)容物粉末用純水定溶于500ml容量瓶中水浴80°C加熱，反復(fù)離心(1000轉(zhuǎn)/min，4min)取上清藥液，將藥液蒸干，以同體積含葡萄糖0.25%培養(yǎng)基溶解備用。
[0020]藥物濃度及分組:(I)抗生素組共10個(gè)濃度，為青霉素或甲氧西林，濃度范圍20?0.04 μ g/ml。(2) YSYZ 組共 10 個(gè)濃度，濃度范圍為 6370 μ g/ml ?12.4 yg/mL.(3)CZ組共10個(gè)濃度，濃度范圍為12275(Γ239.75 μ g/ml。(4) ZS組共10個(gè)濃度，濃度范圍為 173000?237.89 μ g/ml。
[0021]主要試劑與儀器
胰蛋白胨、酵母提取物(英國OXOID公司)，TSB、TSA培養(yǎng)基(美國BD公司)，氯化鈉(國藥集團(tuán))，結(jié)晶紫(美國AMRESC0公司)，微生物活性檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，Matrix染色劑、LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability 試劑盒(美國 Molecular Probes 公司)，戊二醛(上海化學(xué)試劑公司)，自動(dòng)洗板機(jī)(美國伯騰儀器有限公司)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋)、超凈臺(tái)、恒溫?fù)u床、恒溫水浴鍋，分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。
[0022]方法
1.2.1細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)大腸桿菌:LB培養(yǎng)基，37°C常規(guī)培養(yǎng)。
[0023]肺炎克雷伯菌:LB培養(yǎng)基，37°C常規(guī)培養(yǎng)。
[0024]微孔板法檢測本發(fā)明藥物對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響
將YSYZ、CZ、ZS和青霉素(或甲氧西林)分別用含0.25%葡萄糖的培養(yǎng)液于96孔平底培養(yǎng)板進(jìn)行倍比稀釋，每孔加入搖床過夜培養(yǎng)的菌液(37°C，280轉(zhuǎn)/分)，稀釋菌液使其孔中濃度達(dá)到0D600=0.05，陰性對(duì)照以同體積含糖培養(yǎng)液代替藥物。每個(gè)濃度作3個(gè)復(fù)孔，將板子置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。染色前用洗板機(jī)以0.9%生理鹽水將培養(yǎng)的96孔板清洗2次，洗去孔中未粘附的細(xì)菌。以結(jié)晶紫(CV)和細(xì)菌生物活性染色試劑盒(WST)分別染色后用酶標(biāo)儀分別對(duì)每孔BF的生物總量和活菌量進(jìn)行測定。
[0025]微孔板法檢測本發(fā)明藥物對(duì)成熟細(xì)菌生物膜的作用
細(xì)菌于搖床過夜培養(yǎng)(37°C，280轉(zhuǎn)/分)，將用含0.25%葡萄糖的培養(yǎng)液稀釋好的菌液加入96孔板，使孔中濃度達(dá)到0D600=0.05，以37°C在恒溫箱中培養(yǎng)成熟細(xì)菌生物膜，24h后，棄去上清，將稀釋好的藥物加入孔中繼續(xù)培養(yǎng)于37°C培養(yǎng)24h，以CV染色和WST檢測方法用酶標(biāo)儀分別對(duì)每孔的生物總量和活菌量進(jìn)行測定。
[0026]抑菌率的半抑制率的計(jì)算
半抑制率(IC50)為IC50為50%抑制濃度時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用1git法將數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，算出藥物IC50值。
[0027]激光共聚焦觀察藥物對(duì)生物膜的影響
藥物對(duì)S.a細(xì)菌生物膜形成的影響:細(xì)菌于搖床培養(yǎng)過夜(37°C，280轉(zhuǎn)/分)，同時(shí)在小皿中加入Iml藥液和Iml稀釋的菌液，使菌液濃度達(dá)0D600=0.05，所加入的青霉素/甲氧西林小皿中終濃度為20μ g/ml，ZS為173000 μ g/ml。將小皿置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)后棄去上清，用0.9%生理鹽水小心清洗兩次，去掉未粘附細(xì)菌，加入200 μ I matrix染料，同時(shí)以1.5 μ Ι/ml濃度分別加入PI和Syto9染色，將標(biāo)本染色30min，在激光共聚焦上觀察，P1、Syto9、matrix 所需的激發(fā)波長分別為 488nm、559nm、559nm。
[0028]藥物對(duì)成熟S.a細(xì)菌生物膜的影響:細(xì)菌于搖床培養(yǎng)過夜(37°C，280轉(zhuǎn)/min)，在小皿中加入Iml藥液和Iml稀釋的菌液，使菌液濃度達(dá)0D600=0.05，所加入的青霉素/甲氧西林小皿中終濃度為20μ g/ml，ZS為173000 μ g/ml。將小皿置于37°C培養(yǎng)24小時(shí)后棄去上清，后加入藥物再于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。染色前，用0.9%生理鹽水小心清洗兩次，加入三種染色劑染色30分鐘后，于激光共聚焦上觀察。
[0029]掃描電鏡觀察藥物對(duì)生物膜的影響
將大小5mmX 5mm的載玻片放入24孔板，每孔一個(gè)，孔中菌液0D600值為0.05，將玻片于37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，取各藥物組最大濃度藥物加入其中，繼續(xù)于37°C培養(yǎng)24小時(shí)。取出載玻片，將樣本進(jìn)行處理:(I)固定，前固定為使用4%戊二醛固定2小時(shí)，后固定為1%鋨酸固定液固定2小時(shí)，固定后，以PBS緩沖液漂洗2次，5分鐘/次，(2)梯度脫水，將樣本依次放入50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮、100%丙酮各15分鐘，進(jìn)行梯度脫水，(3)用100%叔丁醇浸透樣本，放入-20°C冰箱30分鐘。(4)取出樣品真空冷凍干燥儀干燥4小時(shí)。(5)將干燥好的樣品粘于樣品臺(tái)，將其噴金鍍膜，后于掃描電鏡下觀察。
[0030]透射電鏡觀察藥物對(duì)生物膜的影響
將細(xì)菌增菌菌液用培養(yǎng)液稀釋，使其0D600值為0.05，加入離心管中以37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去管中一半上清，分別加入藥物，取各藥物組最大濃度，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。將樣本離心，8000轉(zhuǎn)/分，10分鐘。樣品按下列步驟處理:(I)前固定4%戊二醛固定彡2小時(shí)。固定完畢，用PBS緩沖液漂洗3次，5分鐘/次(2)后固定1%鋨酸固定液固定I?2小時(shí)。固定完畢，用PBS緩沖液漂洗3次，5分鐘/次。(3)梯度脫水:依次經(jīng)50%丙酮脫水15分鐘，70%丙酮15分鐘，90%丙酮15分鐘，100%丙酮I O分鐘脫水兩次。(4)梯度浸透:依次經(jīng)丙酮2:1包埋劑2小時(shí)，丙酮1:1包埋劑2小時(shí)，純包埋劑2小時(shí)。(5)包埋操作:將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中孔頂，然后置烤箱烘干，依次在烤箱37°C加溫12小時(shí)，450C 12小時(shí)，60°C 24小時(shí)，形成包埋塊。(6)將樣本切成超薄切片(5 μ m)后在透射電鏡下觀察。
[0031]結(jié)果
2.1本發(fā)明藥物對(duì)大腸桿菌生物膜的影響
(I)微孔板法檢測本發(fā)明藥物對(duì)大腸桿菌生物膜的影響
為觀察本發(fā)明藥物對(duì)大腸桿菌生物膜生物總量和活菌數(shù)的影響，行CV和WST染色后測量，結(jié)果分別見圖1和圖2。
[0032]圖1中，與對(duì)照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對(duì)BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響。
與對(duì)照組相比，CZ (122750^15343.75 μ g/ml),ZS (86500、21625 μ g/ml)，能夠減少大腸桿菌生物膜形成過程中的生物總量以及活菌數(shù)。從半抑制率(IC50)看，CZ組抑制效果最佳，其對(duì)生物總量IC50為58188 μ g/ml，對(duì)活菌數(shù)IC50為56528 μ g/ml。
[0033]乙醇溶劑對(duì)照組中一些濃度對(duì)BF中活菌數(shù)的抑制具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從IC50看，抑制作用不明顯。
[0034]本發(fā)明三藥物組中，CZ組效果相對(duì)最好，能抑制大腸桿菌BF形成階段的生物總量(CV)0
[0035]圖2中，與對(duì)照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對(duì)BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響。
[0036]可以看到，與對(duì)照組相比，YSYZ、CZ、ZS對(duì)成熟大腸桿菌生物膜生物總量及和活菌數(shù)無明顯抑制作用。青霉素(2.5、0.041 μ g/ml)對(duì)生物膜內(nèi)活菌數(shù)有影響。本發(fā)明藥物三個(gè)藥物組對(duì)成熟大腸桿菌BF抑制效果均不明顯。
[0037](2)激光共聚焦觀察本發(fā)明藥物對(duì)大腸桿菌生物膜的影響
為研究本發(fā)明藥物對(duì)大腸桿菌細(xì)菌生物膜厚度和成分，即活菌、死菌、胞外基質(zhì)的作用情況，對(duì)生物膜進(jìn)行活(syto-9)、死菌(PI)及細(xì)菌外基質(zhì)(matrix)熒光染色后，激光共聚焦下觀察生物膜形態(tài)及熒光強(qiáng)度，結(jié)果分別如圖3、圖4所示。
[0038]圖3示，與對(duì)照組相比抗生素組(青霉素，20 μ g/ml)活菌熒光強(qiáng)度和胞外基質(zhì)熒光強(qiáng)度上升，ZS組，(173000 μ g/ml)胞外基質(zhì)強(qiáng)度上升而活菌熒光強(qiáng)度、死菌熒光強(qiáng)度下降。
[0039]圖4示，與對(duì)照組相比，可以看出抗生素組(青霉素，20 μ g/ml)成熟BF中活菌、死菌、胞外基質(zhì)染色熒光強(qiáng)度均有不同程度的增強(qiáng)；ZS組(173000 μ g/ml)胞外基質(zhì)大幅上升，而活菌、死熒光強(qiáng)度大幅下降。
[0040]本發(fā)明藥物對(duì)肺炎克雷伯的影響
(I)微孔板法檢測本發(fā)明藥物對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜的影響
為觀察本發(fā)明藥物對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜生物總量和活菌數(shù)的影響，行CV和WST染色法測量，結(jié)果分別見圖5、圖6。
[0041]圖5中，與對(duì)照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對(duì)BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響。
[0042]與對(duì)照組相比，YSYZ(6370?3185μ g/ml)、CZ (122750^479.49 μ g/ml)、ZS(86500^675.78 μ g/ml)，能夠減少肺炎克雷伯菌生物膜形成過程中的活菌數(shù)，而各藥物組對(duì)生物總量無明顯抑制。從半抑菌率看，本發(fā)明藥物三種提取物對(duì)細(xì)菌生物膜活菌(WST)都有一定的抑制，其中CZ組對(duì)活菌數(shù)的IC50為3160μ g/ml，效果最佳。Fig 15中，乙醇溶劑一些濃度對(duì)照組對(duì)生物抑制作用也具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0043]本發(fā)明藥物三個(gè)藥物組均對(duì)肺炎克雷伯BF中活菌數(shù)有抑制作用。其中YSYZ組和CZ組效果較好。
[0044]圖6中，與對(duì)照組相比，*P〈0.05 ； #P〈0.01 ； CV染色法示各給藥組對(duì)BF生物總量的影響；WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響。
[0045]乙醇溶劑對(duì)照組對(duì)BF影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，青霉素(1.25、
0.623 μ g/ml)對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜生物總量有抑制作用。
[0046]YSYZ (6370^1592.5 μ g/ml),CZ (122750 μ g/ml),ZS (173000-86500 μ g/ml) CZ、ZS能夠減少活菌數(shù)。從半抑制率(IC50)看，CZ組效果相對(duì)差，而ZS較好，為208353 μ g/ml ο
[0047]本發(fā)明藥物三個(gè)藥物組中，從抑菌率看，YSYZ組因其乙醇溶劑對(duì)照組的陽性結(jié)果影響，對(duì)成熟BF抑制作用不突出，而ZS組抗生物膜作用相對(duì)較好，能抑制肺炎克雷伯BF活菌數(shù)(IC50 為 208353 μ g/ml)。
[0048](2)激光共聚焦觀察本發(fā)明藥物對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜的影響為研究本發(fā)明藥物對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜厚度和成分，即活菌、死菌、胞外基質(zhì)的作用情況，對(duì)生物膜進(jìn)行活(syto-9)、死菌(PI)及細(xì)菌外基質(zhì)(matrix)熒光染色后，激光共聚焦下觀察生物膜形態(tài)及熒光強(qiáng)度，結(jié)果分別如圖7、圖8所示。
[0049]圖7中，與對(duì)照組相比，可以看出抗生素組(青霉素，20μ g/ml)BF活菌、死菌、胞外基質(zhì)染色中均有下降。本發(fā)明藥物組(ZS,173000 μ g/ml )BF中活菌、死菌、胞外基質(zhì)染色熒光強(qiáng)度大幅度下降。
[0050]圖8中，與對(duì)照組相比可以看出抗生素組(青霉素，20 μ g/ml)活菌、死菌、胞外基質(zhì)熒光強(qiáng)度均有下降。本發(fā)明藥物組(ZS，173000 μ g/ml)活菌熒光強(qiáng)度大幅下降，死菌和胞外基質(zhì)無明顯變化。
[0051]結(jié)論
本發(fā)明藥物主要表現(xiàn)在其對(duì)于生物膜厚度及細(xì)菌數(shù)量的抑制，可以抑制膜中活菌量和死菌量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1是各給藥組對(duì)大腸桿菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對(duì)BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響；
圖2是各給藥組對(duì)成熟大腸桿菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對(duì)BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響；
圖3是激光共聚焦觀察藥物對(duì)大腸桿菌生物膜的影響；
圖4是激光共聚焦觀察藥物對(duì)成熟大腸桿菌生物膜的影響；
圖5是各給藥組對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對(duì)BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響；
圖6是各給藥組對(duì)成熟肺炎克雷伯菌生物膜形成影響圖，CV染色法各給藥組對(duì)BF生物總量的影響以及WST染色法示各給藥組對(duì)BF內(nèi)活菌數(shù)的影響；
圖7是激光共聚焦觀察藥物對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜的影響；
圖8是激光共聚焦觀察藥物對(duì)成熟肺炎克雷伯菌生物膜的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0053]實(shí)施例1:
原料藥配方為:
連翹258g 金銀花258 g板藍(lán)根258 g大黃50 g廣藿香88 g 綿馬貫眾258 g紅景天88 g薄荷腦8 g麻黃85 g苦杏仁85 g 魚腥草255 g 甘草 85 g石膏 255g。
[0054]制備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加6倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢ィ瑸V液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時(shí)，第二次1.5小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次1.5小時(shí)，第二次I小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10的清膏，加乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15的清膏，噴霧干燥，得干膏粉，備用；
(5)將步驟(4)所得干膏粉加入淀粉138克，用85%乙醇制粒；
(6)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(5)所得顆粒，密閉，混勻，裝入1000粒膠囊，即得。
[0055]實(shí)施例2:
原料藥配方為:
連翹210 g 金銀花280 g板藍(lán)根210 g大黃45 g廣藿香100 g 綿馬貫眾280 g紅景天75 g薄荷腦5.5 g麻黃75 g 苦杏仁100 g 魚腥草210 g甘草100 g石膏280g。
[0056]制備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加5倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢ィ瑸V液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6倍量50%的乙醇提取2次，第一次3小時(shí)，第二次I小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次0.5小時(shí)，第二次2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15的清膏，加乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.20的清膏，噴霧干燥，得干膏粉，備用；
(5)將步驟(4)所得干膏粉加入淀粉134克，用85%乙醇制粒；
(6)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(5)所得顆粒，按常規(guī)制劑方法制成片劑即得。
[0057]實(shí)施例3:
原料藥配方為:
連翹280 g 金銀花210 g板藍(lán)根280 g大黃55 g廣藿香75 g 綿馬貫眾210 g紅景天100 g薄荷腦8.5 g麻黃100 g苦杏仁75 g 魚腥草280 g甘草 75 g石膏 210g。
[0058]制備方法為:
(1)按照上述處方稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香碎斷，加8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘?jiān)鼦壢ィ瑸V液備用；
(3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用10倍量90%的乙醇提取2次，第一次I小時(shí)，第二次3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用；
(4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次2.5小時(shí)，第二次0.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.12的清膏，加乙醇，調(diào)節(jié)至醇濃度為70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，回收乙醇至無醇味，所得濾液與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.13的清膏，噴霧干燥，得干膏粉，備用；
(5)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(4)所得干膏粉，按常規(guī)制劑方法制成丸劑即得。
[0059]實(shí)施例4:
原料藥配方為:
連翹280g 金銀花210g板藍(lán)根280g大黃55g廣藿香75g 綿馬貫眾210g紅景天10g薄荷腦8.5g麻黃10g 苦杏仁75g 魚腥草280g 甘草 75g石膏 210g。
[0060]制備方法:
(一)提取工藝:
(1)按照上述處方量稱取中藥材，凈選，酌情碎斷；
(2)廣藿香加6倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4h，收集揮發(fā)油，出油率為0.33 ±0.05%,提取液過濾后備用，殘?jiān)鼦壢ィ?br> (3)連翹、炙麻黃、魚腥草、大黃，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小時(shí)，第二次
1.5小時(shí)，提取液過濾，濾液合并，回收乙醇至無醇味,備用；
(4)金銀花、苦杏仁、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，第一次1.5小時(shí)，第二次I小時(shí)，提取液過濾，濾液合并同時(shí)加入步驟(2)廣藿香提油后的水溶液，濃縮成60°C測定相對(duì)密度為1.10清膏，加95%乙醇，邊加邊攪拌，至醇濃度70%，冷藏放置24小時(shí)，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，與醇提液合并，濃縮至濃縮成60°C測定相對(duì)密度為1.20稠膏，備用；
(二)制劑工藝:
(5)制劑配方為:步驟(4)所得稠膏335.5g 薄荷腦5g
步驟(2)所得廣藿香油0.2ml 糖粉342.5g 糊精514.0g
(6)制粒:將糖粉和糊精混合均勻，用稠膏作粘合劑制軟材，14目篩網(wǎng)制粒，60—65°C烘干，10目篩網(wǎng)整粒；
(7)分裝:篩出細(xì)粉適量，將薄荷腦、廣藿香揮發(fā)油加入適量乙醇，溶解，噴入細(xì)粉中，混合均勻，并與顆粒混合均勻，密閉半小時(shí)，裝袋，即得，以上處方可制成顆粒1000g。
【權(quán)利要求】
1.一種中藥組合物在制備破壞細(xì)菌生物膜的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物由下列重量份的原料藥制成: 連翹210-280 金銀花210-280 板藍(lán)根210-280大黃45-55 廣藿香75-100綿馬貫眾210-280紅景天75-100 薄荷腦5.5-8.5 麻黃75-100 苦杏仁75-100 魚腥草210-280 甘草75-100 石膏 210-280。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物由下列重量份的原料藥制成: 連翹210 金銀花280板藍(lán)根210大黃45廣藿香100 綿馬貫眾280紅景天75薄荷腦5.5麻黃75 苦杏仁100 魚腥草210 甘草100石膏280。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物由下列重量份的原料藥制成: 連翹280 金銀花210板藍(lán)根280大黃55廣藿香75 綿馬貫眾210紅景天100薄荷腦8.5麻黃100 苦杏仁75 魚腥草280 甘草 75石膏 210。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物由下列重量份的原料藥制成: 連翹258 金銀花258板藍(lán)根258大黃50廣藿香88 綿馬貫眾258紅景天88薄荷腦8 麻黃85苦杏仁85 魚渥草255 甘草 85石骨 255。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述中藥組合物的活性成分由以下步驟制成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選； (2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用； (3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用； (5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用； 步驟(5)所得干膏粉、步驟(2)所得揮發(fā)油與薄荷腦共同構(gòu)成該中藥組合物的活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物劑型為膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、口服液、丸劑、酊劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、噴霧劑或注射劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述膠囊劑是由以下步驟制成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選； (2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用； (3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用； (5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用； (6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒； (7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝入膠囊，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于顆粒劑的制備方法是由以下步驟制成: (1)按照原料藥重量比例稱取中藥材，凈選，酌情碎斷； (2)廣藿香碎斷，加5-8倍量水提取揮發(fā)油，提油時(shí)間4小時(shí)，收集揮發(fā)油，備用；提取液過濾后，殘洛棄去，濾液備用； (3)連翹、麻黃、魚腥草、大黃，用6-10倍量50-90%的乙醇提取2次，每次1_3小時(shí)，提取液合并過濾，回收乙醇，濾液備用； (4)金銀花、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、甘草、紅景天，加7-11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次0.5-2.5小時(shí)，提取液合并過濾，所得濾液與步驟(2)廣藿香提油后的濾液合并，濃縮成在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.10-1.15的清膏，加入乙醇，調(diào)解至醇濃度為70%，冷藏放置，過濾，回收乙醇至無醇味，得清膏備用； (5)將步驟(4)所得所得清膏與步驟(3)所得醇提液合并，濃縮至在60°C時(shí)測定相對(duì)密度為1.15-1.20的清膏，干燥，得干膏粉，備用； (6)將步驟(5)所得干膏粉加入適當(dāng)藥學(xué)上可接受的輔料制粒； (7)將薄荷腦、步驟(2)所得揮發(fā)油加入乙醇溶解，噴入步驟(6)所得顆粒，密閉，混勻，裝袋，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)菌為耐甲氧西林耐藥菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述耐甲氧西林耐藥菌為大腸桿囷、肺炎克雷伯囷。
【文檔編號(hào)】A61K33/06GK104367688SQ201310347948
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】王宏濤, 劉敏彥, 唐思文, 徐登峰 申請(qǐng)人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司