人miR-26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了人miR-26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提出了人miR-26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中應(yīng)用的技術(shù)方案。本發(fā)明的研究結(jié)果表明在人脂肪細胞中過表達miR-26b可以明顯抑制脂肪細胞的增殖速度和細胞個數(shù)，可用于制備抑制脂肪細胞增殖的藥物及減肥的藥物。
【專利說明】人miR-26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及人miR-26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肥胖，是一種常見的能量代謝性疾病，是目前在全世界范圍內(nèi)增長最為迅速的慢性疾病。肥胖與冠心病、高血壓、高脂血癥、糖尿病、腦血管意外等多種疾病系密切相關(guān)，嚴重危害著患者的身心健康。加強對肥胖病因、發(fā)病機制及防治藥物的研究己成為21世紀面臨的最大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。目前肥胖的治療策略包括刺激中樞腎上腺素能受體或者阻止5-羥色胺再吸收的食欲抑制劑、消化性脂肪酶抑制劑以及激素調(diào)節(jié)劑。在這 些藥物中，僅阻止5-羥色胺再吸收的脂肪酶抑制劑、奧利司他和西布曲明是FDA許可的藥物，但是會導(dǎo)致包括脂肪瀉、頭痛以及血壓升高等副作用。因此，肥胖的治療和預(yù)防依然是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和預(yù)防領(lǐng)域里的熱點問題之一。
[0003]已知肥胖是機體在遺傳、環(huán)境、行為因素或三者相互作用下能量代謝失衡的結(jié)果，在細胞水平，肥胖表現(xiàn)為脂肪細胞的數(shù)目增多和體積增大，脂肪細胞的增多是由于前脂肪細胞的不斷增殖和分化所引起，而脂肪細胞的體積反映了在特定細胞中脂質(zhì)分解和合成之間的平衡。此外，隨著遺傳學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展，遺傳因素在肥胖發(fā)生中的重要性已倍受重視。近些年來，有關(guān)肥胖的病因?qū)W研究結(jié)果表明，肥胖發(fā)生的病因中遺傳因素占40-70%，因此開展肥胖病因的遺傳學(xué)研究，從基因工程方面入手，尋找一種能夠抑制脂肪細胞增殖和分化的藥物對于肥胖癥的防治將起到非常重要的作用。
[0004]miR_26b是我們采用微流體芯片技術(shù)檢測人原代脂肪前體細胞及誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細胞miRNAs表達譜時發(fā)現(xiàn)的一條高表達于成熟脂肪細胞的miRNA,該miRNA位于人染色體2q35、CTDSPl基因的第4內(nèi)含子，其成熟序列“UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU”在物種間高度保守。但該miRNA與脂肪細胞增殖之間的關(guān)系如何尚未知曉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供人miR_26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明另一個目的是提供人miR_26b在制備減肥藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人miR_26b過表達組的脂肪細胞增殖速度明顯慢于空載對照組脂肪細胞，細胞個數(shù)明顯減少，且人miR-26b過表達組的脂肪細胞中S期細胞比例明顯少于空載對照組，表明染色質(zhì)合成期細胞減少，細胞增殖速度變慢。因此，本發(fā)明提出人miR-26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中的應(yīng)用，進一步，可用于制備抑制脂肪細胞增殖藥物。這些影響脂肪細胞增殖的藥物既可以作用于全身的脂肪組織，也可以與靶向定位物質(zhì)結(jié)合，從而作用于特定部位，抑制特定部位的脂肪細胞增殖。
[0008]本發(fā)明的有益效果
[0009]本發(fā)明檢測了人miR_26b過表達對脂肪細胞增殖功能的影響，顯示過表達miR-26b能抑制脂肪細胞增殖(細胞個數(shù)減少且增殖速度變慢)，可用于制備抑制脂肪細胞增殖的藥物及減肥藥物，為肥胖的預(yù)防和治療提供了新的手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1:pGLV-Hl-GFP/Puro載體圖譜、插入位點及人miR_26b過表達慢病毒載體酶切
及測序鑒定。
[0011]圖2:人miR_26b過表達慢病毒感染人脂肪前體細胞株的鑒定。
[0012]圖3:人miR_26b過表達脂肪細胞和對照細胞生長曲線圖。
[0013]圖4:人miR_26b過表達脂肪細胞和對照細胞24、48小時細胞各周期分布圖(Gl:染色質(zhì)合成前期，S:染色質(zhì)合成期，G2/M:染色質(zhì)合成后期及分裂期)。
【具體實施方式】
[0014]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0015]實施例1
[0016]I材料和方法
[0017]1.1 試驗材料:人前體脂肪細胞株(Human Preadipocytes-visceral, HPA_v)購自美國Sciencell公司。本實驗所需的pGLV-Hl_GFP/Puro質(zhì)粒購自上海吉瑪公司，包裝質(zhì)粒 Pcgvp、Rev、Vsvg 購自美國 Allele Biotech & Pharmaceuticals 公司；pGLV-Hl-miR-26b-GFP/Puro慢病毒載體由本實驗小組自行構(gòu)建；DNA、RNA抽提試劑盒購自德國Qiagen公司,miRNA逆轉(zhuǎn)錄試 劑盒、miRNA檢測試劑盒、TanMan基因表達mix II購自美國 ABI 公司，TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version PCR 試劑盒購自日本Takara公司，脂肪細胞專有培養(yǎng)基7211購自美國Sciencell公司，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自美國NEB公司，引物由美國Invitrogen公司合成。
[0018]1.2 (一)人miR_26b minigene的擴增及人miR_26b慢病毒過表達載體(pGLV-Hl-miR-26b-GFP/Puro)的構(gòu)建
[0019](I).DNA提取:按照以下步驟提取基因組DNA(德國Qiagen公司QIAamp DNA MiniKit)
[0020]I)取4ml離心管一只，加入600 μ I核裂解液，冰上冷卻。
[0021]2)加入10_20mg解凍的人脂肪組織，勻漿機勻漿10秒。將裂解物移至1.5ml離心
管中。65°C孵育30分鐘。
[0022]3)待樣品達到室溫后，加入200 μ I蛋白沉淀液，潤旋震湯20秒，直于冰上冷卻5分鐘。
[0023]4) 13，OOOXg離心4分鐘，可見白色沉淀。將上清移至一新離心管中。
[0024]5)加入600 μ I異丙醇，輕輕顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成。13，000Xg離心I分鐘，棄去上清。
[0025]6)加入600 μ I室溫70%乙醇,輕輕顛倒離心管數(shù)次,13，000 X g離心I分鐘,小心
棄去上清。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10-15分鐘。
[0026]7)向離心管中加入50 μ I雙蒸水，65°C孵育I小時，以充分溶解DNA，4°C保存，得基因組DNA。[0027](2).人 miR_26b minigene 的擴增
[0028](2.1)通過miRBase數(shù)據(jù)庫獲得人miR-26b的前體pre-miRNA_26b的序列；在從1blast中比對查找其所在的基因組序列，根據(jù)引物設(shè)計規(guī)則，采用Primerf軟件設(shè)計擴增包括pre-miR-26b在內(nèi)的序列，并在其上游和下游分別引入BamHI和EcoRI酶切位點，上游引物(含BamHI位點，下劃線區(qū)域)5’ -GCCGGATCCAGGCTCTTCCCACCAATCCG-3’ ;下游引物(含EcoRI 位點，下劃線區(qū)域)5’ -ACCGAATTCGGCCAGCTACCCTGACCACT-3’。目的基因長度為 451bp。(PCR 試劑盒:TaKaRa LA '< DNA Polymerase Hot-Start Version, Takara)
[0029]
【權(quán)利要求】
1.人miR-26b在制備抑制脂肪細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
2.人miR-26b在制備減肥藥`中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK103432595SQ201310361481
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】郭錫熔, 季晨博, 趙亞萍, 宋桂仙, 徐廣峰, 史春梅, 顧平清, 沈亞卉, 李慧 申請人:南京市婦幼保健院