用于治療肺癌的cd8毒性t淋巴細胞及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及用于治療肺癌的CD8毒性T淋巴細胞（CTL）及其制備方法，用人工抗原提呈細胞（artificial?antigen?presenting?cell，aAPC）668株負載抗原肽后在體外高效活化用磁珠法分選HLA-A2陽性腫瘤患者外周血而來的CD8T細胞，CD8T細胞經激活，分化成具為具有殺傷腫瘤細胞的CD8毒性細胞(CTL),誘導的CTL分泌IFN-γ，且體外對人腫瘤細胞株和體內對自體腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用，CTL回輸給病人后可用來治愈腫瘤患者或延長患者的生命。
【專利說明】用于治療肺癌的CD8毒性T淋巴細胞及其制備方法
[【技術領域】]
[0001]本發明涉及⑶8毒性T淋巴細胞(CTL)及其制備方法，具體涉及用于治療肺癌的⑶8毒性T淋巴細胞(CTL)及其制備方法。
[【背景技術】]
[0002](I)自體細胞的過繼免疫治療
[0003]自體細胞免疫治療的出現，彌補了三大傳統腫瘤治療一放療、化療和手術治療難以徹底抹殺腫瘤細胞的缺陷，它是用自己的細胞治自己的病，通過提高病人自身的免疫系統的功能，增強特異性腫瘤殺傷細胞的分化能力，在沒有任何副作用的前提下，可以在細胞水平上殺滅腫瘤。這項實現患者自身機體的“自主抗癌”療法，有望達到完全消滅體內癌細胞并根治的目的，將成為未來癌癥治療的一個主要方向。這項技術被認為是“二十一世紀最有希望攻克腫瘤的治療技術”，也是世界上目前唯一有希望完全消滅腫瘤細胞的治療手段。腫瘤自體細胞免疫療法適用于多種實體腫瘤，包括惡性黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等實體瘤手術后防止復發，也可以用于多發性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系統惡性腫瘤的復發，對于大多數細胞免疫治療的適應人群還可以用于上述腫瘤的進一步鞏固治療，達到延長生存期、提高生活質量和抑制腫瘤惡化的目的。美國FDA于2010年4月29日批準了第一支基于該技術的治療產品上市，中國也已立法規定此技術作為第三類醫療技術，允許有資質的醫院開展。
[0004](2)第二代過繼免疫細胞治療一⑶8T細胞免疫治療的優勢
[0005]第一代過繼自體細胞免疫療法主要包括三種免疫細胞的療法一 DC、CIK、DCCIK，療法優點突顯在:通過采集人體自身免疫細胞，經由體外培養使其數量成千上萬倍增多，進而使免疫細胞的靶向性殺傷功能增強，然后再回輸到人體以殺滅血液及組織中的病原體、修復機體受損組織細胞，以及調節和增強機體的免疫功能。這項技術在國內若干家公立醫院已經開展，廣大的醫療機構尚處在待開發狀態。但是，腫瘤殺傷的特異性低而且殺傷機理不是很清楚。CD8T細胞治療是第二代免疫細胞治療，CD8T細胞是癌細胞最原始的天敵，具有腫瘤特異性抗原識別和有效殺傷癌細胞的效果。作為第二代免疫細胞治療技術，CD8T細胞技術屬于近幾年獲得重大突破的最新技術。除具有第一代自體細胞免疫療法的優點外，與第一代免疫細胞治療技術DC\CIK技術相比，不僅在安全性上得到了更好的保證，對癌細胞的殺傷性和靶向性上更是得到了顯著提升，有效改善了 DC\CIK技術腫瘤殺傷效果有限的局限性，是真正有望根治癌癥的最新技術
[
【發明內容】
]
[0006] 為了解決現有技術中的上述不足和缺陷，本發明提供一種用人工抗原提呈細胞制備治療肺癌的CD8毒性T淋巴細胞(CTL)及其制備方法。
[0007]為了實現上述目的，設計一種用于治療肺癌的⑶8毒性T淋巴細胞(CTL)的制備方法，其特征在于用人工抗原提呈細胞負載抗原肽后在體外高效活化用磁珠法分選HLA-A2陽性腫瘤患者外周血而來的CD8T細胞，CD8T細胞經激活，分化成具為具有殺傷腫瘤細胞的⑶8毒性T淋巴細胞(CTL)。
[0008]通過果蠅細胞制備所述的人工抗原提呈細胞，通過在果蠅細胞表面共表達MHC I和T細胞共刺激分子，使果蠅細胞具有抗原遞呈的功能。
[0009]所述的人工抗原提呈細胞是由編碼HLA-A2和兩個共刺激分子⑶80和⑶54的cDNA轉染原始果蠅細胞株S2而得到的穩定表達HLA-A2、⑶80和⑶54分子的細胞株。
[0010]通過紅細胞制備所述的人工抗原提呈細胞，將可溶性的MHC I類分子和微球蛋白包被在其表面，使其具有抗原遞呈的功能。 [0011]所述的抗原肽是與MHC I類分子具有高親和結合的多肽分子。
[0012]所述的抗原肽為MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-l、SSX-2、WT-1 和 hTERT。
[0013]上述⑶8毒性T淋巴細胞(CTL)可用于制造肺癌治療藥物。
[0014]本發明同現有技術相比，用人工抗原提呈細胞(artificial antigen presentingcell, aAPC) 668株負載抗原肽后在體外高效活化用磁珠法分選HLA-A2陽性腫瘤患者外周血而來的CD8T細胞，CD8T細胞經激活，分化成具為具有殺傷腫瘤細胞的CD8毒性細胞(CTL)，誘導的CTL分泌IFN- Y，且體外對人腫瘤細胞株和體內對自體腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用，CTL回輸給病人后可用來治愈腫瘤患者或延長患者的生命。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0015]圖1為多肽與MHCI結合的親和性示意圖；
[0016]圖2為多肽與MHCI結合的親和性示意圖；
[0017]圖3為⑶8T細胞增長曲線示意圖；
[0018]圖4為CTL活性測試示意圖；
[0019]圖5為CTL活性測試示意圖；
[0020]圖6為CTL分泌IFN- Y示意圖；
[0021]圖7為⑶62L，CCR7等分子在靜止的⑶8T細胞和CTL上的表達示意圖。
[【具體實施方式】]
[0022]為了使本發明更加清楚，結合附圖和實施例對本發明做進一步說明，應當理解，本實施例并不用于限定本發明的保護范圍。
[0023]I)多肽的制備和分析:運用生物信息學的方法，分析肺癌特異性抗原分子內的抗原肽片段，設計能與MHC I類分子結合的肽段，并在體外合成這些肽段，保證純度在95%以上。研究肽段與MHC I類分子的結合穩定性。
[0024]2)人造抗原提呈細胞:
[0025](I)昆蟲細胞人造抗原遞呈細胞(aAPC)的制備:構建表達各種相關蛋白的載體。以果蠅S2細胞為基礎，共轉染表達HLA-A2、β-微球蛋白、⑶80、細胞間黏附分子-1(ICAM-1,⑶54);流式細胞術(FACS)分析各種分子的表達情況，保證相關分子的表達在80%以上。
[0026](2)紅細胞人造抗原遞呈細胞(aAPC)的制備:通過果蠅細胞表達可溶性HLA-A2分子和β2-微球蛋白，并包被于紅細胞表面。通過流式細胞術分析，包被相關分子的紅細胞占總數的80%以上。
[0027]3)分離⑶8+Τ細胞及純度分析:使用Ficoll或類似試劑進行分離PBMC，用磁珠法免疫純化分離CD8+細胞。通過流式細胞術，分析CD8+T細胞的純度。
[0028]4) CTL的產生:利用人工抗原遞呈細胞和合成的抗原肽與⑶8Τ細胞在體外共培養，在多肽存在的條件下用同一個捐贈者的PBMC中的非CD8粘附細胞(第一天已凍存)重覆刺激⑶8細胞，細胞擴增后產生⑶8Τ毒性T淋巴細胞(CTL)。
[0029]5)特異的CTL活性:通過51Cr釋放試驗，測定CTL對靶細胞的殺傷作用；
[0030]6)高質量CTL的確定:通過對CTL表型的追蹤測定，可以確定高質量的CTL的表型分子表達水平。
[0031]7) CTL體內活性試驗:使用肺癌小鼠模型分析檢測CTL活性。
[0032]抗原肽的設計:根據文獻報道的有關肺癌特異表達的抗原分子，計算機程序按照MHC I與多肽結合的立體結構預測與MHCI高親和結合的多肽分子(SYFPEITHI epitopeprediction)。表一所列出的7個多肽來自于7個腫瘤抗原上與MHC I親和性最高的可能的抗原肽，這些腫瘤抗原分別是MAGE-1，MAGE-3, NY-ESO-1, SSX-2, WT-1和hTERT。在程序中
輸入抗原氨基酸順序，計算機將顯示出一系列親和性不同的與MHC I結合的多肽。
[0033]
抗原抗原肽順序
MAGE-1KVLEYVIKV (948)
MAGE-3FLWGPRALV (909)`[0034]
NY-ESO-lSLLM WITQV (906)
SSX-2KASEKIFYV (922)
WT-1RMFPNAPYL (974)
hTERTYLFFYRKSV(933)
[0035]MAGE=melanoma antigen gene
[0036]SSX=synovial sarcoma, X breakpoint2
[0037]WT=Wi lm，s Tumor
[0038]NY-ESO=cancer-testis antigen
[0039]hTERT=human telomerase reverse transcriptase
[0040]抗原肽的穩定MHC I的確定:對于肽結合在主要組織相容性復合體(MHC/HLA-A2)分子的研究分析基于肽對果蠅人工抗原提呈細胞(aAPCs，668)上I類MHC的穩定能力。在96孔V型板上1: 10稀釋多肽，使最終肽濃度分別為200uM, 20uM, 2uM, 200nM, 20nM, 2nM,每孔多肽溶液為100 μ 1，同時設置無肽孔為陰性對照。將100 μ I的經ImM CuS04誘導的果蠅668細胞(細胞濃度調至I X IO6個/ml)置于V底96孔板中，于26°C，5%C02條件下培養，18h后移至37°C，5%C02的細胞培養箱中繼續培養2h。隨后將細胞用FACS緩沖液(PBS, 2.5%FCS, 0.01%NaN3)洗滌一次，懸浮細胞在50 μ I的FACS緩沖液中，接著每孔加入I μ I FITC 標記的鼠抗人 HLA-A2 抗體(BD Pharmingen, Cat.N0.551285)和 I μ I PI 染色，4°C培養30min，染色后將洗滌后的細胞重新懸浮于200 μ I FACS緩沖液并將細胞轉移至96個微型管中。樣本用FACScan流式細胞儀測定，CellQuest軟件分析，如圖1、圖2所示。
[0041]⑶8Τ細胞增長曲線:從HLA-A2陽性捐獻者中用血分儀得到的白細胞經Ficoll分離得到PBMC，經抗⑶8抗體連接的磁珠進一步純化出的⑶8+Τ細胞，再和已負載多肽的果蠅APC668 于 37°C，5%C02 培養 5 天。在第五天加入人 IL-2 (20U/ml, R&D)和 IL-7 (30U/ml, R&D體)，并于第7天和第15天，在多肽存在的條件下用同一個捐贈者的PBMC中的非CD8粘附細胞重復刺激⑶8+T細胞兩次，細胞濃度用細胞培養液調節至2 X 106/ml。在第7，10，12，14，17，20，22天用Typan Blue細胞計數而獲得細胞增長曲線，如圖3所示。
[0042]CTL活性測定:
[0043]釋放51Cr方法:CTL (效應物)活性用標準的鉻(51Cr)釋放試驗來衡量，負載單一月太的 T2 細胞(祀目標)作為祀細胞(Brunner et al., Immunology.1968February; 14 (2): 181-96)。利用1:5的CTL (效應物)系列稀釋倍數產生的劑量應答，得到最高效應物(E)和靶目標(T)比率為50:1。在試驗之前，靶細胞(3 X 106cells/100 μ I Τ2細胞放置在含有4%FCS的IXPBS中)用100 μ I51Cr (Perkin Elmer)標記并于37°C培養lh。結束后標記的靶細胞用含有2.5%馬血清(Invitrogen)的I X Hank’s平衡鹽溶液(Invitrogen)洗4次，于40C 1200-1500rpm離心8min，重新懸浮在15ml新鮮MLR培養基(含10%FCS，1%谷氨酰胺，1%青霉素-鏈霉素，1%HEPES和1%MEM非必須氨基酸的RPM1-1640溶液)中。標記的T2細胞最終濃度定為0.2X IO6個/ml。試驗前，標記的T2細胞用IOuM單一肽于室溫下負載30min ；100 μ I CTL (初濃度為5 X IO6個/ml)用MLR培養基在圓底96孔板中連讀稀釋1:5，每個效應細胞濃度設I個重復。在每個孔中含有不同稀釋倍數的CTLlOOy 1，加入50 μ I Κ562細胞(4 X IO6 個 /ml) ( ATCC? Number:CCL-243?)和 50 μ I 負載肽的 51Cr 標記的 Τ2 靶細胞(0.2X IO6個/ml),于37°C，5%C0培養4h,900rpm離心5min,每孔取100 μ I上清液至51Cr計數管中計數(如圖4、圖5所示)。
[0044]IFN- Y的測定:在96孔板中，負載多肽的100 μ I靶細胞Τ2或腫瘤細胞(106cells/1000y 1，多肽濃度:5μ g/ml)與 100 μ I 效應細胞 CTLs (106cells/1000 μ 1)1:I在37°C，5%C02培養8h，1200rpm離心5min,每孔取100 μ I上清液用于ELISA測定T細胞受抗原刺激產生并釋放IFN-Y的量(IFN-Y測定試劑盒)。釋放IFN-Y的量與T細胞的活性成正比，如圖6所示。
[0045]細胞表型:細胞的表型反應了細胞的狀態，與細胞的活性及在體內的存活有關。⑶28，⑶27，⑶62L以及CCR7的表達常被用來推測CTL細胞形態和表型以及記憶狀態。I X IO6的CTL用緩沖液(PBS/2%FCS/0.02%NaN3)洗滌，懸浮在100 μ I同一緩沖液中，加抗CD8-PerCP-Cy5-5 抗體，并分別加入抗 CD28-FITC，CD27-FITC，CD62L-FITC 和 CCR7-FITC 抗體，4C，30min.，緩沖液洗滌后，懸浮細胞在0.5毫升的緩沖液中，用流式細胞儀分析CTL上CD28, CD27, CD62L和CCR7的表達，如圖7所示。
【權利要求】
1.一種用于治療肺癌的CD8毒性T淋巴細胞的制備方法，其特征在于用人工抗原提呈細胞負載抗原肽后在體外高效活化用磁珠法分選HLA-A2陽性腫瘤患者外周血而來的CD8T細胞，CD8T細胞經激活，分化成具為具有殺傷腫瘤細胞的CD8毒性T淋巴細胞。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于通過果蠅細胞制備所述的人工抗原提呈細胞，通過在果蠅細胞表面共表達MHC I和T細胞共刺激分子，使果蠅細胞具有抗原遞呈的功能。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的人工抗原提呈細胞是由編碼HLA-A2和兩個共刺激分子CD80和CD54的cDNA轉染原始果蠅細胞株S2而得到的穩定表達HLA-A2、CD80和CD54分子的細胞株。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于通過紅細胞制備所述的人工抗原提呈細胞，將可溶性的MHC I類分子和微球蛋白包被在其表面，使其具有抗原遞呈的功能。
5.如權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所述的抗原肽是與MHCI類分子具有高親和結合的多肽分子。
6.如權利要求5所述的其特征在于所述的抗原肽為MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1、SSX-2、WT-1 和 hTERT。
7.一種通過權利要求1至6中任一所述制備方法制得的⑶8毒性T淋巴細胞。
8.—種權利要求7所述CD8毒性T淋巴細胞在肺癌治療藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103667189SQ201310439121
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】施煒星, 楊春霞, 房永生 申請人:上海宇研生物技術有限公司