重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質瘤中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質瘤中的應用。本發明分別通過尾靜脈注射方法建立了肺癌小鼠模型、皮下移植瘤方法建立了喉癌及腦膠質瘤的裸鼠動物模型研究rLZ-8的體內抗腫瘤作用，治療結果表明rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質瘤有明顯的抗腫瘤作用。
【專利說明】重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質 瘤中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及重組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8)在制備治療抗腫 瘤藥物中的應用，重點涉及重組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8)在抗肺癌、喉癌以及腦膠質瘤的 生長的治療作用，提高改善荷瘤小鼠生活狀態及提高荷瘤小鼠存活率。。

【背景技術】
[0002] 肺癌是來源于支氣管或細支氣管表皮細胞的惡性腫瘤，占肺實質惡性腫瘤的 90-95%。肺癌是肺部最常見的原發性惡性腫瘤。世界衛生組織調查報告，許多國家和地區， 肺癌的發病率占惡性腫瘤的首位。本病多在40多歲以上發病，發病年齡高峰在60-79歲 之間。男女患病率為2. 3:1。肺癌起源于支氣管粘膜上皮，局限于基底膜內者成為原位癌， 可向支氣管腔內或/和臨近的肺組織生長，并可通過淋巴血行或經支氣管轉移擴散。肺癌 主要有兩大基本類型，即小細胞肺癌（SCLC)和非小細胞肺癌（NSCLC)。其中非小細胞肺癌 (NSCLC)發生更多，約80%的肺癌患者屬于這種類型。目前小細胞肺癌患者主要用化學療法 治療，外科治療對這種類型肺癌患者并不起主要作用。外科治療主要適用于非小細胞肺癌 患者。
[0003] 肺癌的主要原因是由于外界環境危險因素暴露的逐漸增加，如吸煙和被動吸煙人 群的大范圍存在、呼吸系統疾病(肺結核、慢性阻塞性肺疾患、哮喘等）的增加、城市大氣污 染的增加、廚房油煙的不完全處理、新鮮蔬菜和水果攝入量減少等。目前肺癌治療方面尚未 做到早期發現，早期診斷及早期治療，多數病人在第一次外科診斷時病變已屬晚期。所以， 盡快開發和研究出肺癌的有效治療藥物是目前科學研究的一個重大而又艱巨的任務。
[0004] 喉癌（Laryngocarcinoma)為消化系統癌癥的一種。大多數的喉癌都是鱗狀細胞癌 (laryngealsquamouscellcarcinoma,LSCC)，所占比例約95%左右，可見喉癌主要是于喉 上皮的鱗狀上皮細胞上形成。喉癌可以在喉的任何一個位置形成，而喉癌的康復率很受癌 細胞位置的影響。喉癌主要可分為三個基本類型：聲門型(聲帶)，聲門上型(聲襞)和聲門下 型。喉癌以聲門型最為普遍，其次是聲門上型，而最少出現的就是聲門下型。據統計資料， 喉癌占全身惡性腫瘤的1. 2-1. 6%，占頭頸惡性腫瘤的3. 3-8. 1%。喉癌具有高發病率、高復 發率的特點，男性發病居多，每年新發病人為3. 5-5. 5/10萬，女性為0. 6/10萬，發達國家發 病率較高，死亡率約為2. 4/10萬，女性為0. 3/10萬。呼吸道腫瘤中，喉癌發病率居第2位。 [0005]目前喉癌的治療主要是通過手術、放療、化療、生物治療手段的合理應用，以達到 最大程度消滅腫瘤、保留喉功能、提高患者生存率。其中手術治療是喉癌的首選治療方法， 但是手術治療不可避免地造成喉部損害，同時也會影響病人的生活質量。喉癌的放療適用 于病變>lcm、表淺、無轉移的聲門上型喉癌，且全身情況差，不宜手術者。但是喉癌細胞對 輻射的靈敏度不同，有些抗輻射的細胞即使在高強度的照射下也會存活。喉癌的誘導化療 對器官保留有重要作用，目前臨床試驗結果顯示，化療可以提高保喉率，減少遠處轉移，對 患者總的生存率并無提高。
[0006] 腦膠質瘤（Glioma)是膠質瘤的一種，膠質瘤是一種始于腦部或者脊柱的腫瘤，它 被稱為膠質瘤的原因是其由膠質細胞癌變產生，其中腦部的膠質瘤是最常見的。腦部腫瘤 與中樞神經系統原發性和轉移性的異質群體有關，是一種危及生命，存活率較低的疾病。原 發性惡性腦瘤的年發病率大約是24000例。惡性神經膠質瘤是發生于神經膠質部位的腫 瘤，發生率占腦瘤的70%。
[0007]目前腦膠質瘤的治療方法主要包括手術治療、放療和化療。腦膠質瘤的特點是呈 彌漫性、侵襲性向周圍腦組織浸潤生長，與周圍組織無明顯界限，故手術不能完全切除腫 瘤，還可能激活處于休眠期的瘤細胞，使之迅速浸入增殖期，導致切除后易復發，多于瘤床 2cm范圍內復發，治療效果較差。放療在治療腦膠質瘤方面，作用十分有限，當放射劑量達 到73-80Gy時，才能對膠質瘤細胞形成有效殺傷，而正常腦組織所能耐受劑量僅有60Gy，而 且部分惡性腦瘤需進行大范圍腦部放射線治療或全顱及脊椎放射治療，故放療對病人學習 和記憶能力均會造成一定的損傷。目前由于腦膠質瘤對化療藥物產生一定的耐藥性并且大 部分治療腦膠質瘤的化療藥物具有較強的毒副作用，故腦膠質瘤的化療藥物的療效較低。
[0008] 靈芝（Ganodermalucidum)是一種藥用真菌，作為中藥材已有數千年的藥用歷 史，據報道，靈芝有免疫調節以及抗腫瘤作用。靈芝中的活性成分之一靈芝免疫調節蛋 白（LZ-8)是從赤靈芝中提取的真菌免疫調節蛋白，本論文提供的重組靈芝免疫調節蛋白 (RecombinantGanodermalucidumimmunoregulatoryprotein,rLZ_8)是重新設計編石馬并 全合成LZ-8基因，并通過畢赤酵母表達系統重組表達并純化獲得的蛋白樣品，以往研究表 明，rLZ-8也具有一定的抗腫瘤活性，例如，rLZ-8可有效殺傷人肺腺癌腫瘤細胞(A549)，人 胃腺癌細胞（SGC7901)等腫瘤細胞株，但關于rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質瘤的治療作用尚 未見報道。本發明提出rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質瘤均有顯著的治療效果。


【發明內容】

[0009] 本發明涉及rLZ-8在制備治療肺癌、喉癌及腦膠質瘤藥物中的應用，通過一系列 的實驗手段及結果表明rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質瘤均具有顯著的抑制作用，具體發明 內容如下： ⑴采用健康靈活C57BL/6小鼠建立了肺癌轉移瘤模型。設計了rLZ-8體內抗肺癌實驗 分組，其中包括正常對照組、模型組、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組在內 的5個實驗組，各組給藥劑量與給藥方式以及治療時間詳見實施例3,以荷瘤小鼠肺轉移瘤 結節數與生存時間作為考察對象，分別給藥30天與給藥60天后，統計各組小鼠肺結節數與 生存情況，計算出rLZ-8對荷瘤小鼠腫瘤抑制率以及荷瘤小鼠存活率。
[0010] ⑵采用健康靈活的BALB/c-nude裸鼠建立了喉癌裸鼠皮下移植瘤模型。設計了包 括模型對照組(生理鹽水)、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組在內的4個實 驗組，其中rLZ-8低、中、高劑量組的劑量分別為125μ8/1^、250yg/kgjOOyg/kg，給藥 時間為60天與90天。治療效果指標主要記錄體重、瘤重、瘤體積并以瘤重為依據計算腫瘤 抑制率等。分別將數據進行了統計學分析得出rLZ-8在治療喉癌的效果顯著。
[0011] ⑶采用健康靈活的BALB/c-nude裸鼠建立了腦膠質瘤裸鼠皮下移植瘤模型。設計 了包括模型對照組(生理鹽水)、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組在內的4 個實驗組，其中，rLZ-8低、中、高劑量組的劑量分別為125μg/kg、250μg/kg、500μg/kg。 給藥天數為60天與90天。治療效果指標主要記錄體重、瘤重、瘤體積并以瘤重為依據計算 腫瘤抑制率等。分別將數據進行了統計學分析得出rLZ-8具有體內抗腦膠質瘤的治療效果 顯著。
[0012] 經過一系列rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質瘤皮下移植瘤小鼠實驗動物模型的藥效 學實驗結果表明，rLZ-8能夠改善荷瘤小鼠的生存狀態，抗腫瘤效果顯著。
[0013] 本發明有益效果：本發明采用體內試驗方式驗證rLZ-8在治療肺癌、喉癌及腦膠 質瘤的應用，通過一系列的藥效學實驗，結果表明，rLZ-8治療肺癌、喉癌及腦膠質瘤效果顯 著，其中，rLZ-8在肺癌的治療過程中不僅挺高了腫瘤抑制率延長荷瘤小鼠的存活時間，而 且出現了一定比例的肺癌結節數消失的荷瘤小鼠模型，這是發明人意想不到的；同時在治 療喉癌及腦膠質瘤的應用同樣出現了皮下實體瘤消失的治療效果。

【具體實施方式】
[0014] 實施例1rLZ-8對肺轉移小鼠（LLC)腫瘤抑制率及其荷瘤存活率的影響 1藥物配制 將rLZ-8蛋白原液的濃度為lmg/ml分別配置成rLZ-8低劑量（250μg/kg) 31. 25μg/ml溶液，rLZ-8 中劑量（500μg/kg) 62. 5μg/ml溶液，為rLZ-8 高劑量（1000μg/kg) 125μg/ml溶液。
[0015] 肺癌小鼠模型的建立 收集對數生長期的LLC細胞，1000r/min離心5min，除去上清液，將細胞懸浮于生理鹽 水溶液中，調整細胞濃度為8. 5X106/ml。取細胞懸液尾靜脈接種于小鼠體內，接種細胞數 為1. 7X106個/只，接種體積為0. 2ml/只。
[0016] 實驗分組及給藥方法 健康靈活C57BL/6小鼠126只隨機分為7組，每組18只，每組選出9只作為30天給藥 組，剩余9只作為60天給藥組。第1天小鼠造模結束后開始給藥，分別給藥治療30天與給 藥60天，考察給藥周期對治療效果的影響。具體分組及給藥方式見表1。
[0017]表1實驗分組及給藥方法(包括給藥30天與給藥60天）

【權利要求】
1. 重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質瘤中的應用。
2. 如權利要求1所述肺癌，其特征在于肺癌包括小細胞肺癌（SCLC)和非小細胞肺癌 (NSCLC)。
3. 如權利要求1所述喉癌，其特征在于喉癌包括聲門型(聲帶)，聲門上型(聲襞）和聲 門下型。
4. 如權利要求1所述腦膠質瘤，其特征在于腦膠質瘤的發生部位包括腦部或者脊柱。
5. 如權利要求1所述應用，其特征在于該藥物制劑核心成分是由權利要求1所述的重 組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8)和任選的藥學可接受的輔劑組成。
6. 如權利要求1所述應用，其特征在于給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括 口服液，片劑，丸劑和膠囊；非腸道給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號】A61K38/16GK104043105SQ201410270401
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非