本發明屬于抗原表達檢測
技術領域：
，具體地說，涉及一種檢測腫瘤微環境相關抗原表達的方法。
背景技術：
：近年的研究發現各種腫瘤的微環境，尤其是實體腫瘤，對機體抗腫瘤免疫反應有著極強的抑制作用。這些抑制機制主要有以下幾個方面：第一，腫瘤細胞表面表達的PD-L1/PD-L2傳遞抑制性信號到T淋巴細胞表面的PD-1。由于PD-1是一個抑制性受體，T淋巴細胞對瘤細胞的殺傷功能受到抑制。一年來，美國FDA連續批準了抗PD-1抗體治療肺癌，腎癌，及抗PD-L1抗體治療晚期膀胱癌，表明阻斷腫瘤微環境對腫瘤免疫反應的抑制是非常有效的治療手段。第二，腫瘤中侵潤的抑制性細胞亞群，調節性T淋巴細胞(Treg)。Treg可以直接抑制抗腫瘤的效應T細胞，而近年的研究發現低劑量的環磷酰胺可以有效的清除體內的Treg，增強抗腫瘤特異免疫反應。第三，腫瘤細胞內表達的一些抑制性酶，包括環氧化酶cyclooxygenases(Cox1/Cox2/PGE2)，和吲哚胺2，3-雙加氧酶IDO-1/IDO-2/TDO-1。這些抑制性酶對機體的抗腫瘤反應都有極強的抑制作用。針對這些抑制性酶，現有的藥物如阿司匹林可以很好的抑制環氧化酶1和2的活性，預防腸癌的發生和復發。西樂葆抑制環氧化酶2的活性，在臨床中與其他藥物合用治療腫瘤。需要強調的是來自不同患者的腫瘤具有非常不同的腫瘤微環境和不同的免疫抑制機制。因此，要想取得有效的治療效果，必須對每一個患者的腫瘤微環境中的免疫抑制機制進行分析才能設計具有針對性的治療方案。腫瘤的免疫治療需要采用綜合手段，而現有技術中的免疫治療通常只檢測少數幾種腫瘤相關的抗原，無法對整個的腫瘤微環境進行全面、透徹的分析，從這樣的檢測結果出發，也很難找到針對性的治療方案。技術實現要素：針對相關技術中的上述技術問題，本發明提出一種檢測腫瘤微環境相關抗原表達的方法，能夠針對腫瘤免疫微環境相關的多種抗原，檢測結果可以成為治療腫瘤可靠的參考，可供醫生結合自身的治療經驗為患者找到更加個體化的治療方案來進行免疫干預。為實現上述技術目的，本發明的技術方案是這樣實現的：一種檢測腫瘤微環境相關抗原表達的方法，包括以下步驟：步驟一：從實體瘤組織樣品中提取樣品RNA；步驟二：檢驗樣品RNA；步驟三：以提取的檢驗合格的樣品RNA為模板，oligodT為引物進行RNA的反轉錄得到組織樣品cDNA；步驟四：設計qPCR檢測引物，通過qPCR擴增各組織樣品，采集熒光信號；其中，設計用于qPCR擴增檢測引物序列為以下9組：GAPDHF：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；GAPDHR：GTGATGGCATGGACTGTGGT；COX1F：GGAGTTTGTCAATGCCACCT；COX1R：GCAACTGCTTCTTCCCTTTG；COX2F：ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC；COX2R：TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT；PDL1F：GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG；PDL1R：CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA；PDL2F：CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA；PDL2R：GTTGCATTCCAGGGTCACATTG；IDO1F：AAAGGGGACCCGAGCAATG；IDO1R：CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG；TDOF：GGGAACTACCTGCATTTGGA；TDOR：GTGCATCCGAGAAACAACCT；FOXP3F：TGACCAAGGCTTCATCTGTG；FOXP3R：AGGAACTCTGGGAATGTGCT；PGE2F：GTACTGGCTTCGTACGCGCG；PGE2R：TAGCGCTCCAGGGCCATGGC。進一步地，本發明還提供了一種用于步驟三的組織樣品cDNA獲得反應體系，共20ul，包括10XRTBuffer，2.0ul；25XdNTPMix，0.8ul；10Xoligo(dT)，2.0ul；逆轉錄酶，1.0ul；RNA酶抑制劑，1.0ul；樣品RNA，1ug；其余部分為無核酸純水；組織樣品cDNA獲得反應條件為25℃，10min；37℃，120min；85℃，5min；得到組織樣品cDNA后在4℃下保存。進一步地，本發明還提供了一種用于步驟四的qPCR檢測反應體系，共15ul，包括組織樣品cDNA，2μl；正向引物，0.5ul；反向引物，0.5ul；2XTransStart@TopGreenqPCRSuperMix，7.5μl；雙蒸水，4.5ul；qPCR檢測反應條件為94℃，30s；94℃，5s；58℃，15s；72℃，10s；共40個循環。本發明的有益效果：發明人選取了多種腫瘤微環境相關抗原，并相應設計了對應的多種抗原引物，通過當前主流的基因表達分析方法，熒光定量PCR法特異性的檢測抗原在組織樣品的表達情況，通過本方法，得到腫瘤患者的微環境相關的多種抗原表達值，當醫生為患者提供具有針對性的治療方案時，該表達值具很強的參考性。附圖說明圖1是根據本發明實施例所述的一種檢測腫瘤微環境相關抗原表達的方法得出的BT048病人的微環境相關抗原表達值的柱形圖。具體實施方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，該具體實施方式應理解為是為了進一步闡明本發明而不用以限制本發明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料如無特殊說明均可從商業途徑獲得。實施例一：從實體瘤組織樣品中提取樣品RNA1.1組織樣品的選取和制備：手術切下的腫瘤組織及用作陰性對照的良性腫瘤組織，切除邊緣，選取中間完好的組織塊在最短的時間內放置于RNAlater中在-80℃下保存，防止RNA降解；其中，RNAlater是一種液態的，無毒的組織保存試劑。它能迅速穩定組織，保護非冷凍細胞RNA于原位。獲得組織塊后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不會引起RNA的降解，這樣可以不必馬上處理樣品或將樣品冷凍在液氮之中以備以后處理，屬于本領域常規試劑，可從商業途徑獲得。1.2取30mgRNAlater保存樣品，加1mlTRIzol，充分研磨，使組織塊充分裂解，按200μl/mlTRIzol的比例加入氯仿，充分震蕩混勻，4℃，12000rpm離心15min；其中，TRIzol是一種總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA，屬于本領域常規試劑，可從商業途徑獲得。1.3小心吸取上層水相于另一新的EP管中，加入等體積異丙醇，沉淀RNA，4℃，12000rpm離心10min，收集沉淀的RNA；1.4用75％乙醇洗滌沉淀得到的RNA，4℃，12000rpm離心10min；1.5重復1.4步驟；1.6棄掉乙醇，待乙醇揮發殆盡，適量DEPC水溶解組織樣品RNA；其中DEPC水是用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經高溫高壓滅菌的純水，不含雜質RNA、DNA和蛋白質，通過本領域常規技術手段可得到。實施例二：檢驗樣品RNA用超微量分光光度計準確測得組織樣品RNA濃度，其中，在本實施例中所用的超微量分光光度計型號為Nanodrop2000。用生物分析儀對RNA進行質量分析，其中，在本實施例中所使用的生物分析儀型號為安捷倫2100，OD值在1.8～2.0之間且RIN值＞6的RNA樣品符合抗原表達譜檢測標準，為質量合格的RNA樣品，采用其進行下一步實驗。實施例三：以提取的檢驗合格的樣品RNA為模板，oligodT為引物進行RNA的反轉錄得到組織樣品cDNA在冰上配置好如表1所示的cDNA獲得反應體系，輕柔混勻反應體系，離心機短暫離心，再進行表2所示程序，獲得模板cDNA。表1.cDNA獲得反應體系組分體積10XRTBuffer(緩沖液)2.0ul25XdNTPMix0.8ul10Xoligo(dT)2.0ulReverseTranscriptase(逆轉錄酶)1.0ulRNaseInhibitor(RNA酶抑制劑)1.0ul樣品RNA1ugNuclease-freeH2O(無核酸純水)至20ul表2.cDNA獲得反應程序步驟1步驟2步驟3步驟4溫度25℃37℃85℃4℃時間10min120min5min∞實施例四：設計qPCR檢測引物，通過qPCR擴增各組織樣品cDNA，采集熒光信號4.1選用特異性膠質瘤相關抗原基因，設計對應引物，進行qPCR擴增，用以檢測抗原表達水平，采用人內參基因(GAPDH)進行qPCR擴增各組織樣品作為對照，以確保RNA的提取質量及獲得的cDNA質量。根據本領域常規知識可知，GAPDH是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的縮寫，這個酶的基因是看家基因，也就是在機體各組織中的表達都趨于穩定和接近，可以作為RT-PCR的內參，也就是衡量模板取樣量的一個參照物。申請人利用Primer5、DNAMAN、DNAStar、NCBI等序列分析軟件設計了8種腫瘤微環境相關抗原引物，抗原包括COX1、COX2、PDL1、PDL2、IDO1、TDO、FOXP3、PGE2。表3qPCR檢測引物4.2按照SYBRselectmasterMix試劑盒說明書嚴格在冰上配置好qPCR體系，體系如表4；輕柔混勻以上反應體系，并利用離心機短暫離心，按照表5程序進行qPCR擴增，采集熒光信號。其中，SYBRselectmasterMix試劑盒是用于實時熒光定量PCR的試劑盒，可從商業途徑獲得；TransStart@TopGreenqPCRSuperMix是用于實時熒光定量PCR的試劑，可從商業途徑獲得。表4.qPCR反應體系表5.qPCR反應程序實施例五：數據分析本申請使用目前主流的RNA提取法-TRIzol法對組織樣品的RNA進行提取，用通過對RNA進行質量分析，利用檢驗合格的RNA樣品以當前主流的基因表達分析方法-熒光定量PCR法檢測了8個常見的腫微環境瘤抗原相對癌旁正常組織的相當表達水平。腫瘤抗原表達分析使用2-ΔΔCT法.表達倍數差異＝2-ΔΔCT。ΔΔCT＝[(CT目的基因-CT內參基因)腫瘤樣品-(CT目的基因-CT內參基因)癌旁樣品].每個樣品投入的起始模板量使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)進行均一化。對于沒有檢測到的腫瘤抗原，以CT為40來計算表達差異。申請人通過上述具體實施例一至四所描述的具體步驟檢測了在一例膠質母細胞瘤(臨床編號BT048)腫瘤微環境相關抗原的擴增Ct值及對于正常腦組織(N)的表達值，即Cq值，并用實施例五中所述的數據分析方法對檢測結果進行了分析，得出的結果分別用表6及圖1進行表示。其中，表達倍數差異最高的抗原為COXl，為環氧化酶，是腫瘤細胞內表達的一種抑制性酶，對機體的抗腫瘤反應都有極強的抑制作用。現有的藥物如阿司匹林可以很好的抑制COX1的活性，預防腸癌的發生和復發。由于來自不同患者的腫瘤具有非常不同的腫瘤微環境和不同的免疫抑制機制。因此，要想取得有效的治療效果，必須對每一個患者的腫瘤微環境中的免疫抑制機制進行分析才能設計具有針對性的治療方案。醫生可以通過本發明所述的方法，以病人腫瘤微環境相關抗原表達情況的匯總為基礎進行分析，從而找出最適合病人的用藥方式和治療方法。表6.BT048病人腫瘤微環境相關抗原表達情況匯總序列表<110>暨南大學<120>一種檢測腫瘤微環境相關抗原表達的方法<160>18<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>GAPDH正向引物<400>AGGTCGGAGTCAACGGATTTG21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>GAPDH反向引物<400>GTGATGGCATGGACTGTGGT20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>COX1正向引物<400>GGAGTTTGTCAATGCCACCT20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>COX1反向引物<400>GCAACTGCTTCTTCCCTTTG20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>COX2正向引物<400>ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>COX2反向引物<400>TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT26<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>PDL1正向引物<400>GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG23<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>PDL1反向引物<400>CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA25<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>PDL2正向引物<400>CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>PDL2反向引物<400>GTTGCATTCCAGGGTCACATTG22<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>IDO1正向引物<400>AAAGGGGACCCGAGCAATG19<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>IDO1反向引物<400>CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>TDO正向引物<400>GGGAACTACCTGCATTTGGA<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>TDO反向引物<400>GTGCATCCGAGAAACAACCT20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>FOXP3正向引物<400>TGACCAAGGCTTCATCTGTG20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>FOXP3反向引物<400>AGGAACTCTGGGAATGTGCT<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>PGE2正向引物<400>GTACTGGCTTCGTACGCGCG20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>PGE2反向引物<400>TAGCGCTCCAGGGCCATGGC20當前第1頁1 2 3