一種抑制癌細胞生長的短肽及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抑制癌細胞生長的短肽及其編碼基因。本發明提供的多肽是如下（a）或（b）的多肽：（a）由序列表中SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列組成的多肽；（b）將序列表中SEQ?ID?No：2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的由（a）衍生的多肽。實驗證明，本發明提供的多肽能夠造成人類子宮頸癌細胞HeLa細胞的凋亡，因此該短肽可能成為良好的低副作用的抗癌藥物。
【專利說明】—種抑制癌細胞生長的短肽及其編碼基因
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種抑制癌細胞生長的短肽及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002]癌癥是一種由于細胞增殖與凋亡的調控機制失常所引起的疾病。癌細胞生長失控，消耗人體過多營養，擠壓正常器官，妨礙正常器官作用，還會局部侵入周遭正常組織甚至經由體內循環系統擴散或轉移到身體其他器官，引起器官功能衰竭。癌癥已經成為全球人類健康的首要殺手之一，近年來我國癌癥發病更是逐漸趨于低齡化。發現并發展新的癌癥治療的藥物，對于社會的穩定，人民健康生活質量的提高，社會經濟發展都具有良好的推動作用。 [0003]目前對于癌癥的治療主要有以下幾種:手術治療，對于良性腫瘤療效較好，但是對于沒有包膜包裹的癌癥組織和擴散性腫瘤難以完全根除；放射性治療，是利用某些腫瘤對射線敏感的特點選擇性地殺死癌細胞，但是對于不敏感型以及易擴散型癌細胞療效較差，而且在治療過程中也會造成正常細胞的死亡；化學治療，是將對細胞有毒、有害的藥物經由循環系統帶到全身，雖然對于擴散型癌細胞也有一定療效，但是這種治療方法對于全身的正常細胞也會造成極大傷害，使癌癥病人在治療癌癥過程中承受巨大的生理和心理的折磨。因此開發出一種療效好、應用范圍廣、副作用小的抗癌藥物是癌癥患者和醫學工作者的共同心愿。
[0004]癌癥細胞的調控機制失常往往是由于一些重要調控基因的失活造成的。目前，已經發現的抑癌基因根據其在細胞中的失活機理可簡單的分為兩類。I型抑癌基因是指其在DNA層面上，基因發生突變而喪失抑制細胞生長作用的基因。II型抑癌基因是一種新穎的抑癌基因，它們在正常細胞中存在一定水平的表達，具有一定的功能，在腫瘤細胞中其基因的轉錄和翻譯在不同程度上下調，從而喪失抑制細胞生長的作用，但其DNA并沒有發生改變。正因如此，II型抑癌基因對于正常細胞沒有生長抑制或誘導凋亡的作用，而對于大多數癌癥細胞則具有很明顯的抑制和誘導細胞凋亡的作用。因此，II型抑癌基因中具有抑癌作用的短肽將有望成為新型的抗癌新藥。
[0005]由人類基因組片段翻譯得到的短肽在細胞中能夠被多種酶降解代謝為天然氨基酸，對人體沒有毒性，也不會造成累計效應。由于II型抑癌基因的自身特點，對正常細胞不產生抑制作用，來自II型抑癌基因的短肽將不會對正常細胞或人體正常器官組織產生副作用，減少治療過程對癌癥病人造成的痛苦。因此，來自II型抑癌基因的抑癌短肽有望成為一種新型的綠色仿生藥物。
【發明內容】
[0006]本發明的一個目的是提供一種具有抑癌作用的多肽。
[0007]本發明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽:[0008](a)由序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序列組成的多肽；
[0009](b)將序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
[0010]所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0011]本發明還提供了上述多肽的編碼基因。
[0012]所述多肽的編碼基因為如下I)~3)中任一所述的DNA分子:
[0013]I)序列表中的SEQ ID No:1所示的DNA分子；
[0014]2)在嚴格條件下能與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的多肽的DNA分子；
[0015]3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的多肽的DNA分子。
[0016]含有所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也在本發明保護的范圍內。
[0017]在本發明的一個具體實例中，所述重組載體為將所述多肽的編碼基因插入BFP-1inker-pcDNA3.1中，得到表達所述多肽的重組載體。
[0018]所述BFP-1inker_pcDNA3.1按照如下方法制備:
[0019]I)在pcDNA3.1載體的NotI和ClaI酶切位點間插入Tag BFP編碼基因(SEQ IDNo:3)，得到重組載體 BFP-pcDNA3.1 ；
[0020]2)在步驟I)得到的重組載體BFP-pcDNA3.1的ClaI和BspEI酶切位點間插入Linker 基因的 DNA 片段(SEQ ID No:6)，得到載體 BFP_linker-pcDNA3.1。
[0021]所述轉基因細胞系是將所述的重組載體導入到宿主細胞中得到的轉基因細胞系，所述宿主細胞具體可以為子宮頸癌細胞，所述子宮頸癌細胞尤其優選為HeLa細胞。
[0022]擴增所述基因的全長或其任一片段的引物對也在本發明保護的范圍內。這樣的引物對的核苷酸序列例如序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示。
[0023]本發明的保護范圍還包括:所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉基因細胞系在抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡中的應用；所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉基因細胞系在制備抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡的產品中的應用。
[0024]在本發明的實施例中，所述腫瘤細胞具體為子宮頸癌細胞，所述子宮頸癌細胞尤其優選為HeLa細胞；
[0025]所述抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡的產品為藥物。
[0026]本發明的另一個目的是提供一種抑制腫瘤生長的產品。
[0027]本發明提供的產品，其活性成分為所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉基因細胞系。
[0028]本發明通過對II型抑癌基因功能區域的研究，發現一種可以抑制人類癌細胞的生長并誘導細胞凋亡的三十七肽，通過對HeLa細胞的施用實驗，發現該短肽能夠造成人類子宮頸癌細胞HeLa細胞的凋亡，因此該短肽可能成為良好的低副作用的抗癌藥物。【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1顯示了本發明短肽誘導細胞死亡的死亡率統計結果。
【具體實施方式】
[0030]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0031]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0032]實施例1、短肽的獲得
[0033]本發明所用短肽序列來自一種人類第二類腫瘤抑制因子，其DNA片段可以通過以人類肝臟cDNA文庫(購自武漢三鷹生物技術有限公司)為模板的PCR (聚合酶鏈式反應)擴
增獲得。
[0034]以人類肝臟cDNA文庫為模板，以Tl-N和T2_C為引物，進行PCR擴增，得到該短肽基因片段的DNA編碼序列，該基因片段兩端分別帶有BspEI和XbaI酶切位點。
[0035]Tl-N:5，-CAAGTCCGGAATGCGCTGTAAACAGGTGG-3’ (SEQ ID No:4)；
[0036]T2-C:5，-CTAGTCTAGATTAGGCTGTCGCTTTTTTTTG-3’(SEQ ID No:5)。
[0037]具體PCR反應體系如下:
【權利要求】
1.一種多肽，是如下(a)或(b)的多肽: Ca)由序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序列組成的多肽； (b)將序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
2.權利要求1所述多肽的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因為如下I)~3)中任一所述的DNA分子: 1)序列表中的SEQID No:1所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下能與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的多肽的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的多肽的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權利要求1所述多肽的編碼基因插入BFP-1inker-pcDNA3.1中，得到的表達所述多肽的重組載體。
6.根據權利要求4所述的轉基因細胞系，其特征在于:所述轉基因細胞系是將權利要求5所述的重組載體導入到宿主`細胞中得到的轉基因細胞系，其中所述宿主細胞為子宮頸癌細胞。
7.權利要求1所述多肽、權利要求2或3所述多肽的編碼基因或者權利要求4所述重組載體或轉基因細胞系在抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡中的應用；或 權利要求1所述多肽、權利要求2或3所述多肽的編碼基因、權利要求4所述重組載體或轉基因細胞系在制備抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡產品中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述腫瘤細胞為子宮頸癌細胞。
9.一種抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡的產品，其活性成分為權利要求1所述多肽、權利要求2或3所述多肽的編碼基因或者權利要求4所述重組載體或轉基因細胞系。
10.根據權利要求9所述的產品，其特征在于:所述腫瘤細胞為子宮頸癌細胞。
【文檔編號】A61K48/00GK103626863SQ201310580998
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】夏斌, 王磊, 魏賀佳 申請人:北京大學