一種具抗腫瘤協同增效作用的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗腫瘤藥物組合物，該組合物是將基于抗體的靶向基質金屬蛋白酶融合蛋白與四環素類抗生素組合，作為靶向基質金屬蛋白酶的抑制劑，再與化療藥物聯合應用，以達到腫瘤治療的協同增效目的，研究結果表明，選用所述任何一種藥物組合，均能達到優于單獨用藥的良好效果，有望為臨床治療提供一種新的手段。
【專利說明】一種具抗腫瘤協同增效作用的藥物組合物
【技術領域】:
[0001 ] 本發明涉及一種抗腫瘤藥物組合物，尤其涉及一種治療基質金屬蛋白酶高表達腫瘤的藥物組合物及其應用。
【背景技術】:
[0002] 惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的疾病。比起普通的放療、化療、激素治療等方法，分子靶向治療藥物的先進性在于其可以針對性地殺死惡性腫瘤細胞，而不影響正常細胞的生存。
[0003]基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)是近年來備受關注的腫瘤相關抗原，它在多種腫瘤組織中大量表達，是在細胞外基質降解中發揮著重要作用的一類特異蛋白水解酶。IV型膠原酶屬于基質金屬蛋白酶的一種,包括MMP-2和MMP-9兩種組分，其能夠破壞基底膜及細胞外基質的完整性，參與腫瘤生長、侵襲和轉移。大量證據表明，抑制MMPs的表達或活化，能夠有效地抑制腫瘤的發生、發展、轉移及復發。因此，近年來開發MMPs的靶向藥物或抑制劑已成為腫瘤靶向治療的重要途徑。
[0004]本實驗室以往的研究，提供了一種靶向IV型膠原酶的雙單鏈抗體強化融合蛋白dFv-LDP-AE(中國發明專利CN101475643A，2009年7月8日)，其特征是，由連續的2個抗IV型膠原酶單抗3G11的單鏈抗體scFv、力達霉素輔基蛋白LDP和力達霉素活性發色團組成。該強化融合蛋白具有腫瘤組織親和力高、腫瘤殺傷活性強的特點。其中，未強化的融合蛋白dFv-LDP主要發揮了與腫瘤組織靶向結合的功能?？紤]融合蛋白dFv-LDP能夠與腫瘤中IV型膠原酶結合，并且在以往的研究中顯示融合蛋白dFv-LDP也有一定的抑瘤效果，其可能成為一種用于腫瘤治療的靶向藥物。但是，并沒有關于將融合蛋白dFv-LDP與其它藥物聯合用于抗腫瘤研究的報道。
[0005]強力霉素(DoXyCyCline，D0X)是一種半合成四環素類抗生素，長期以來主要用于抗菌治療。后來一些學者發現，強力霉素除了抗生素活性，它還具有抑制基質金屬蛋白酶的活性，從而用于結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤及白血病等多種抗腫瘤研究。結果表明，強力霉素可通過抑制MMPs活性產生抗腫瘤增殖效應，還具有細胞周期阻滯、誘導腫瘤細胞凋亡、降低腫瘤細胞侵襲能力和抑制腫瘤轉移的作用。同樣，至今還沒有關于聯合強力霉素與靶向基質金屬蛋白酶的融合蛋白及其應用的報道。
[0006]基質金屬蛋白酶是腫瘤治療的潛在靶點之一，本實驗室在研究中發現，將基因工程靶向抗體與小分子抑制劑聯合起來，在體內外可明顯增強抗腫瘤療效。為進一步提高抑瘤效果，該實驗還選用了抗代謝化療藥物進行組合。如吉西他濱是一種二氟核苷類抗代謝物抗癌藥，臨床上主要用于治療胰腺癌、非小細胞肺癌等。吉西他濱常與其它藥物聯用以取得更好的臨床效果。但是，依然沒有見到聯合吉西他濱與靶向基質金屬蛋白酶的融合蛋白的相關報道。
[0007]本發明所述抗腫瘤協同增效藥物組合，是指在靶向基質金屬蛋白酶的融合蛋白和四環素類基質金屬蛋白酶抑制劑聯合增效的基礎上，與腫瘤抗代謝化療藥物組合，這種組合，迄今尚未見有相關報道。
[0008]本發明的目的是，提供一種具有協同增效作用，特別是對高表達基質金屬蛋白酶腫瘤的抗腫瘤藥物組合

【發明內容】
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[0009]本發明提供了一種抗腫瘤協同增效藥物組合物。所說組合物是將基于抗體的靶向基質金屬蛋白酶融合蛋白與四環素類抗生素組合，作為靶向基質金屬蛋白酶的抑制劑，再與化療藥物聯合應用，以達到腫瘤治療的協同增效目的。
[0010]本發明利用基因工程技術獲得所述靶向基質金屬蛋白酶的雙單鏈抗體融合蛋白dFv-LDP,其制備方法同中國發明專利CNlO 1475643A。
[0011]本發明所述四環素類抗生素選用具有基質金屬蛋白酶抑制作用的強力霉素，包括在藥學上可接受的衍生物或類似物。
[0012]本發明所述化療藥物選用抗代謝類抗腫瘤藥如吉西他濱。
[0013]本發明所述基質金屬蛋白酶抑制劑組合物選用雙單鏈抗體融合蛋白dFv-LDP與強力霉素組成。 [0014]本發明所述一種抗腫瘤協同增效藥物組合物包括融合蛋白dFv-LDP與強力霉素的組合、融合蛋白dFv-LDP與吉西他濱的組合以及融合蛋白dFv-LDP與強力霉素聯合吉西他濱的組合。
[0015]本發明組合物中所述強力霉素是指強力霉素標準品或鹽酸強力霉素。
[0016]本發明組合物中所述吉西他濱是指吉西他濱標準品或注射用吉西他濱。
[0017]所述藥物的劑型可以是注射劑或凍干制劑。
[0018]本發明所述腫瘤，包括但不限于肝癌或結腸癌等。
[0019]本發明所述組合物，包括所述抗腫瘤藥物為有效成分，與藥學上可接受的一種或多種載體。
[0020]所述藥學上可接受的載體，是指藥學領域常規的藥物載體，如稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑，如淀粉、蔗糖等；粘合劑，如纖維素衍生物聚乙烯吡咯烷酮等；潤滑劑，如滑石粉等。
[0021]本發明所述的組合物，可以采用藥學領域常規的方法進行制備。
[0022]發明效果:
[0023]本發明的優點與積極效果在于:兩個針對同一分子靶點基質金屬蛋白酶的蛋白/抗生素組合，有顯著的協同抑瘤作用，靶向基質金屬蛋白酶的蛋白或抗生素分別與化療藥物吉西他濱聯合使用，均可進一步提高抗腫瘤效應。將三者聯合可以產生更明顯的抗腫瘤增效作用，其效果明顯優于單獨使用所述的單個藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0024]圖1-Western blot法檢測MMP-2在腫瘤細胞中的表達情況
[0025]圖2-MTT法檢測融合蛋白dFv-LDP和強力霉素對結腸癌HCT-15細胞的增殖抑制作用，數據以均數土標準差表示，*代表⑶Kl
[0026]圖3-Transwell法檢測融合蛋白dFv-LDP和強力霉素對腫瘤細胞遷移的抑制作用，
[0027]A:人結腸癌細胞在不同藥物處理下的遷移細胞圖(200 X )，
[0028]B:遷移細胞經染色和溶解后測值，數據以均數土標準差表示，**代表P〈0.05
[0029]圖4-Western blot法檢測融合蛋白dFv-LDP和強力霉素對腫瘤細胞中MMP-2的蛋白表達抑制作用
[0030]圖5-融合蛋白dFv-LDP和強力霉素聯合對小鼠移植瘤肝癌H22的協同治療作用
[0031]A:各治療組的腫瘤體積比較圖；
[0032]B:實驗期間小鼠體重記錄與變化圖
[0033]** 代表 Ρ〈0.05
[0034]圖6-ΜΤΤ法檢測融合蛋白dFv-LDP、強力霉素聯合吉西他濱對人結腸癌HCT-15細胞的增殖抑制作用，**代表p〈0.05
[0035]圖7-融合蛋白dFv-LDP、強力霉素及吉西他濱聯合對小鼠移植性肝癌H22的增強治療作用，**代表ρ〈0.05
[0036]圖8-融合蛋白dFv-LDP、強力霉素及吉西他濱聯合對人結腸癌HCT-15的增強治療作用，**代表ρ〈0.05
[0037]實施方式:
[0038]以下所列實施例僅為幫助本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0039]《實施例1》ΜΜΡ-2在人結腸癌細胞和人胰腺癌細胞中的表達
[0040]收取傳代培養中對數生長期的結腸癌細胞株HCT-15、HCT-116, ΗΤ-29和胰腺癌細胞株BxPC-3、PANC-UMIA PaCa-2等腫瘤細胞，細胞裂解液裂解后，用BCA試劑盒進行蛋白定量，每種細胞裂解樣品按相同上樣量(一般為30 μ g)制備，再取適量5 X上樣緩沖液混合，沸水浴中變性5分鐘后加入10%的SDS-PAGE凝膠中電泳。電泳完畢后以80V恒電壓轉膜，將蛋白轉移至PVDF膜上。經5%牛奶封閉過夜后，用TBST潤洗膜5次，每次5分鐘，用兔源抗MMP-2的單克隆抗體(用IXPBS按照1:1000稀釋使用)在4°C孵育過夜，TBST洗膜后用HRP標記的羊抗兔IgG的二抗在室溫下孵育I小時(用IXPBS按照1:5000的比例進行稀釋)，再次洗膜。 最后在膜上滴加化學發光增強劑(美國Millipore公司)顯影并用成像系統捕獲圖像。
[0041]本發明主要檢測了結腸癌細胞HCT-15、HCT-116, HT-29和胰腺癌細胞AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2中的MMP-2蛋白表達情況(圖1),各種細胞中MMP-2均有一定量的表達，但結腸癌細胞HCT-15、HCT-116、HT-29和胰腺癌細胞MIA PaCa-2中的表達相對較高。在三種結腸癌細胞中，HCT-15的MMP-2表達量最高。
[0042]《實施例2》融合蛋白dFv-LDP和強力霉素對結腸癌HCT-15細胞的增殖抑制作用
[0043]將處于對數生長期的HCT-15腫瘤細胞消化，細胞計數后鋪于96孔板，24小時后加入不同濃度的藥物，繼續培養。48小時后，加入MTT (四氮唑藍)37°C孵育4小時，加入DMSO(二甲基亞砜)溶解藍紫色顆粒，在酶標儀上測570nm處吸光值。將各測試孔的OD值減去本底OD值(無細胞孔)，共設三個平行孔，取其OD均值。細胞的存活率以T/C (%)表示，T為給藥組的OD值，C為對照組的OD值。細胞存活率T/C (%)=(給藥組OD-本底OD)/ (對照組OD-本底0D) X 100%。計算兩藥相互作用系數⑶I=AB/(AXB)。AB為兩藥聯合作用的T/C比值，A、B分別是藥物單獨作用組的T/C比值。協同作用指數⑶Kl時，兩藥有協同作用。
[0044]結果表明，人結腸癌HCT-15細胞對融合蛋白dFv-LDP和強力霉素(DOX)聯合給藥的敏感性更高，且在dFv-LDP濃度為100 μ g/ml, DOX濃度分別為2.5 μ g/ml及5 μ g/ml時聯合，其CDI值均小于1，說明融合蛋白dFv-LDP與強力霉素(DOX)聯合對腫瘤細胞的增殖有協同抑制作用(圖2)。
[0045]《實施例3》融合蛋白dFv-LDP和強力霉素對腫瘤細胞的遷移抑制作用
[0046]Transwell實驗技術是一種在體外模擬細胞遷移或者侵襲的裝置。將Transwell小室轉移至新的24孔板中，在小室和外室中分別加入100 μ L和600 μ L的無血清細胞培養基，靜置于37°C培養箱預先平衡1-2小時。將傳代培養的腫瘤細胞消化后得到細胞沉淀，用無血清培養基重懸細胞后計數，調整細胞密度為I X IO6個/mL。棄去小室和外室的平衡液，將調整好密度的細胞懸液分別取100 μ L至小室內，外室中加入含20%血清的細胞培養基。分別將融合蛋白dFv-LDP (100 μ g/ml)和強力霉素(I μ g/ml)分別加入各組中，并輕搖混勻，靜置于細胞培養箱中培養。48小時后取出小室，把嵌套膜浸在IXPBS中洗一次后，放入預冷的甲醇中固定10分鐘。IXPBS洗三次后放入0.1%結晶紫染色液在室溫下染色30分鐘。IXPBS洗三次后，用棉簽拭去嵌套膜小室內側的液體和未遷移的細胞，保留外室側表面的細胞(為發生遷移的細胞)擦干后于鏡下觀察并拍照。為更客觀評價轉移情況，用刀片沿著嵌套膜邊緣環切下膜，放入96孔板的小孔內，加入配制好的33%醋酸溶液(每孔150 μ L)溶解結晶紫，溶液變藍色，在室溫搖床上輕搖10分鐘充分溶解后小心取出膜。將溶解液置于酶標儀上在0D570處測值。[0047]實驗結果表明，與對照組相比，靶向融合蛋白dF_LDP(100y g/ml)能夠抑制腫瘤細胞HCT-15的遷移能力，其抑制率為67.7%?；|金屬蛋白酶抑制劑強力霉素DOX對腫瘤細胞的遷移抑制更明顯，在DOX (I μ g/ml)時，其抑制率為58.5%。而將兩者聯合，其抑制細胞遷移效果增加(圖3A)，抑制率為39.8% (圖3B)。這說明，聯合靶向MMPs的融合蛋白dFv-LDP和小分子抑制劑DOX比單獨使用更能有效抑制高表達MMP-2的腫瘤細胞的遷移。
[0048]《實施例4》融合蛋白dFv-LDP和強力霉素對腫瘤細胞中MMP-2的蛋白表達抑制作用
[0049]將傳代培養的人結腸癌HCT-15細胞鋪于6孔板中，鋪板的細胞數控制在48小時長滿為佳。培養24小時待貼壁后加入蛋白及藥物處理細胞，培養24小時后收集細胞。用細胞裂解液將其裂解后，制備樣品，用Western blot檢測每個樣品中MMP-2的表達情況，具體步驟同實施例1。
[0050]實驗結果表明，與對照組相比，用融合蛋白dF-LDP(100y g/ml)處理過的細胞中MMP-2降低，用DOX (20 μ g/ml)處理后的細胞中MMP-2表達量明顯減少，而兩者聯合處理細胞24小時后，MMP-2水平降低更加明顯(圖4)。這說明，聯合靶向融合蛋白dFv-LDP和DOX比單獨使用更能抑制人結腸癌HCT-15細胞中MMP-2的表達，從而達到抑制細胞遷移和生長的作用。
[0051]《實施例5》融合蛋白dFv-LDP和強力霉素聯合對肝移植瘤的協同治療作用
[0052]小鼠肝癌H22細胞在小鼠腹腔培養擴增，取生長期的細胞計數，用生理鹽水稀釋成7.5 X 107ml細胞懸液，取200微升直接接種于昆明小鼠右側腋窩皮下，次日開始給藥。融合蛋白dFv-LDP經尾部靜脈注射給藥，于第I天和第6天給藥，共兩次。強力霉素DOX經小鼠腹腔注射給藥，隔天一次，共5次。實驗共設8組，每組10只雌性昆明小鼠，即對照組(生理鹽水)、dFv-LDP 組(dFv-LDP20mg/kg)、DOX 組 I (D0X20mg/kg)、DOX 組 2 (D0X40mg/kg)、DOX 組 3 (D0X60mg/kg)、聯合組 I (dFv_LDP20mg/kg+D0X20mg/kg)、聯合組 2 (dFv_LDP20mg/kg+D0X40mg/kg)和聯合組3 (dFv-LDP20mg/kg+D0X60mg/kg)o實驗期間記錄小鼠體重，于接種腫瘤后第10天結束實驗。按下列公式計算腫瘤存活率(T/C%)并對各組瘤體積進行統計學處理。T/C(%)=Vt/VcX100%，其中Vt為治療組的瘤體積，Vc為對照組的瘤體積。抑瘤率計算公式為(1-T/C)X 100%。各聯合組劑量間的協同作用指數⑶I=AB/ (AXB), A=Vdpwiip/V對照，B=VD0X/V對照，AB=V聯合/V對照，CDI指數>1為拮抗，=1為相加，〈I為協同，CDI≤0.7時，協同作用非常顯著。
[0053]實驗結果表明，將動物實驗第10天的瘤體積進行統計學分析，顯示融合蛋白dFv-LDP (20mg/kg)對小鼠肝癌的抑瘤率為23.1%，三種劑量(20、40、60mg/kg)的強力霉素DOX的抑瘤率分別為4.8%,32.8%和34.9%。融合蛋白dFv-LDP與三種劑量(20、40、60mg/kg)的強力霉素聯合給藥時，抑瘤率分別為71.2%,67.9%及80.4%，其⑶I值分別為0.39,0.62和0.39 (圖5A)，這說明融合蛋白dFv-LDP與強力霉素聯合給藥時，對小鼠肝癌的抑瘤率明顯增高，且具有協同抑瘤效應。在整個實驗治療期間，監測小鼠體重(圖5B)顯示，各給藥組的小鼠體重無明顯下降，表明小鼠能耐受所用的劑量。
[0054]《實施例6》融合蛋白dFv-LDP、強力霉素聯合吉西他濱對結腸癌HCT-15細胞的增殖抑制作用
[0055]按照實施例2的操作步驟，用MTT法檢測融合蛋白dFv-LDP、強力霉素及吉西他濱單獨或聯合對人結腸癌HCT-15細胞的增殖抑制作用。
[0056]實驗結果再一次驗證,融合蛋白dFv-LDP聯合強力霉素能協同抑制結腸癌HCT-15細胞的增殖，其CDI值為0.9 (圖6)。在此基礎上，聯合化療藥物吉西他濱能進一步提高抑制細胞增殖效果(P〈0.05)。
[0057]《實施例7》融合蛋白dFv-LDP、強力霉素及吉西他濱聯合對小鼠移植性肝癌H22的增強治療作用
[0058]本實驗中，小鼠肝癌H22細胞的傳代與接種以及統計學分析方法與實施例5相同。于小鼠皮下接種肝癌H22細胞，接種次日(第I天)開始給藥，融合蛋白dFv-LDP經尾部靜脈注射給藥，于第I天和第6天給藥，共兩次。吉西他濱(GEM)經小鼠腹腔注射給藥，于第I天和第6天給藥，共兩次。強力霉素(DOX)經小鼠腹腔注射給藥，隔天一次，共5次。實驗共設6組，每組10只雌性昆明小鼠，即對照組(生理鹽水)、dFv-LDP組(dFv-LDP20mg/kg)、DOX 組(D0X20mg/kg)、GEM 組(GEM40mg/kg)、聯合組 I (dFv-LDP20mg/kg+D0X20mg/kg)和聯合組2 (dFv-LDP20mg/kg+D0X20mg/kg+GEM40mg/kg)o實驗期間記錄小鼠體重和瘤體積，于接種腫瘤后第10天結束實驗。
[0059]實驗結果顯示，將動物實驗第10天的瘤體積進行統計學分析，融合蛋白dFv-LDP、D0X、GEM對小鼠肝癌H22的抑瘤率分別為59.1%、26.7%,85.1%。聯合組I (即dFv-LDP+DOX聯合)的抑瘤率為78.7%，其協同指數⑶I值為0.71，再次驗證dFv-LDP與DOX聯合有協同抑瘤效果。聯合組2 (即聯合組1+GEM聯合)抑瘤率可達到91.1%，與聯合組I及單獨使用GEM組相比，其抑瘤率都有顯著提高(P〈0.05)(圖7A)。在整個實驗治療期間，監測小鼠體重(圖7B)，顯示各給藥組致使小鼠體重下降不明顯，小鼠能夠耐受所給的劑量。[0060]《實施例8》融合蛋白dFv-LDP、強力霉素及吉西他濱聯合對人結腸癌裸鼠移植瘤的增強治療作用
[0061]人結腸癌HCT-15細胞在體外培養擴增，取對數生長期細胞計數，稀釋成2X107/ml的細胞懸液，每只200微升接種于BALB/c雌性裸鼠右側腋窩皮下，待瘤塊在BALB/c裸鼠皮下長至黃豆大小時，在無菌操作臺內，解剖分離出瘤塊，浸于無菌生理鹽水中，選擇半透明無壞死的腫瘤組織剪成直徑為2mm的小塊接種于裸鼠右側腋窩皮下。待腫瘤生長至.50-100mm3時對動物進行分組并開始給藥。融合蛋白dFv-LDP經尾靜脈注射給藥,分別于腫瘤移植后第10天和第17天給藥，共兩次。吉西他濱(GEM)經小鼠腹腔注射給藥，分別于第.10天和第17天給藥，共兩次。強力霉素(DOX)經小鼠腹腔注射給藥，隔天一次，共8次。實驗共設6組，每組6只雌性裸鼠，即對照組(生理鹽水)、dFv-LDP組(dFv-LDP20mg/kg)、DOX組(D0X20mg/kg)、GEM 組(GEM40mg/kg)、聯合組 I (dFv_LDP20mg/kg+GEM40mg/kg)和聯合組.2 (dFv-LDP20mg/kg+GEM40mg/k+D0X20mg/kg g)。實驗期間記錄小鼠體重和腫瘤體積，于接種腫瘤后第25天結束實驗。統計學分析方法與實施例5相同。
[0062]實驗結果顯示，將記錄的動物瘤體積進行統計學分析，融合蛋白dFv-LDP、DOX、GEM對人結腸癌裸鼠移植瘤的抑瘤率分別為47.8%,27.2%,25.3%。聯合組I (即dFv_LDP+GEM聯合)抑瘤率為66.3%，聯合組2 (即dFv-LDP+GEM+DOX聯合)抑瘤率可達到85.5%，與聯合組I或與單獨使用GEM組相比，其抑瘤率均有顯著提高(P〈0.05)，并且其協同指數⑶I值為
.0.55，說明dFv-LDP、DOX與GEM聯合，對人結腸癌HCT-15移植瘤有明顯協同抑瘤效果(圖.8A)。在整個實驗治療期間，監測小鼠體重顯示，各給藥組小鼠的體重下降不明顯(圖SB)，表明所使用的劑量為可耐受劑量。
【權利要求】
1.一種具有協同增效作用的抗腫瘤藥物組合物，其特征是，所述藥物組合物含有基于抗體靶向基質金屬蛋白酶的融合蛋白、四環素類抗生素以及抗腫瘤化療藥。
2.權利要求1所述藥物組合物，其基于抗體靶向基質金屬蛋白酶的融合蛋白選自dFv-LDPo
3.權利要求1所述藥物組合物，其四環素類抗生素選自具有MMP抑制作用的抗生素強力霉素。
4.權利要求1所述藥物組合物，其抗腫瘤化療藥選自抗代謝物抗腫瘤化療藥吉西他濱。
5.權利要求1、2、3或4所述組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/7068GK103948923SQ201410136443
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】秦燁, 劉秀均, 甄永蘇, 高瑞娟, 李毅, 李良, 劉旭杰 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所