一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒及其制備方法和應用。納米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜堿(PCB)或聚乙二醇(PEG)的親水層，內部是至少含有pH敏感的聚合物單元的疏水核，親水層與疏水核之間是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(PDS)單元間經交聯反應形成的二硫鍵(S‐S)交聯層。在pH與氧化還原雙敏感層交聯納米粒的表面親水層上可修飾上腫瘤靶向基團，通過納米粒對腫瘤細胞的特異性靶向作用，促進納米粒在腫瘤組織的富集和腫瘤細胞的內吞。本發明提供的雙敏感層交聯納米粒，其生物相容性好，毒性低。在腫瘤細胞內谷胱甘肽作用下交聯結構解離，促進藥物釋放。制備方法簡便、穩定性良好、便于操作推廣。
【專利說明】一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒及其制備方法 和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及高分子化學和生物醫學工程領域，特別是涉及一種pH與氧化還原雙 敏感聚合物層交聯納米粒，及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 目前，癌癥（即惡性腫瘤）是世界上發病率和死亡率都比較高的疾病之一。在眾 多治療癌癥的手段中，化療是最重要的治療方法之一，但由于體循環的清除作用、腫瘤組織 低滲透性、腫瘤細胞耐藥性等問題，嚴重阻礙了抗腫瘤藥物向腫瘤細胞的遞送效率，導致療 效差。此外，現有抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細胞的同時對正常組織也產生嚴重的毒副作用，導 致臨床治療往往因毒副作用大而失敗，或因毒副作用的限制無法提高劑量而達不到理想治 療效果。可見，要提高化療效果、降低毒副作用，必須提高抗腫瘤藥物的靶向遞送效率，降低 藥物在正常組織內的聚集。納米載體與各種促進腫瘤靶向遞送手段的結合，為抗腫瘤藥物 的革巴向遞送帶來了希望。
[0003] 此外，腫瘤組織具有有別于正常組織的特異微環境，首先表現為腫瘤組織與正常 組織之間存在pH梯度：血液和正常組織的pH約為7. 4,而腫瘤組織的pH在6. 8左右，腫瘤 細胞內的內涵體及溶酶體的pH為4. 0?6. 5。其次，腫瘤細胞質內的谷胱甘肽（GSH)的濃 度（?lOmmol)遠高于血液和正常組織內的谷胱甘肽濃度（2?20 μ mol)。因此，為提高抗 腫瘤藥物的靶向遞送效率，人們設計了多種pH、氧化還原敏感的納米載體，旨在促進藥物在 腫瘤組織及腫瘤細胞內的釋放。但是，非交聯結構的pH或GSH敏感的納米載體，不僅體循 環穩定性較差，而且在正常生理環境里24h內有高于20%的藥物被釋放出來。為提高納米 粒的穩定性，人們采用pH或GSH敏感的化學鍵進行核或殼交聯。雖然單一敏感的交聯結構 能夠有效降低藥物在體循環過程中的釋放，但難以實現腫瘤細胞內的藥物快速釋放。
[0004] 本發明目的在于提供一種腫瘤靶向并響應腫瘤細胞內環境藥物釋放的納米粒，特 點是：在人體循環中結構穩定并有效抑制藥物釋放，能夠靶向腫瘤組織并在腫瘤細胞內協 同響應低pH和GSH刺激，快速釋放藥物的納米粒，解決抗腫瘤藥物腫瘤靶向遞送問題。


【發明內容】

[0005] 本發明中，以活性可逆加成鏈轉移（RAFT)聚合方法，制備結構和組成可控的兩親 性兩性離子聚合物，鍵合對惡性腫瘤具有特定靶向作用的配體，即靶向基團，構建抗腫瘤藥 物靶向遞送的納米載體。旨在通過靶向基團，親水段，二硫鍵可逆交聯殼層、pH敏感疏水內 核的協同作用，提高納米載體的靶向遞送效率，實現藥物在腫瘤細胞內的定位可控釋放，以 解決現有技術中納米藥物載體的體循環清除速率快、靶向性差、控釋效果差等諸多問題。
[0006] 首先，本發明提供了一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒，其特征在于，所 述的納米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜堿（PCB)或聚乙二醇（PEG)的親水層，內部是至少 含有pH敏感的聚合物單元的疏水核，親水層與疏水核之間是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶 二硫醚（ros)單元間經交聯反應形成的二硫鍵（s-s)交聯層。
[0007] 優選的，所述的pH敏感的聚合物為聚甲基丙烯酸二異丙氨基乙酯（PDPA)。PDPA 在pH = 7. 4環境下疏水，即保持納米粒內核的疏水性，用于藥物負載和體循環穩定性；在 pH6. 5以下能質子化變為親水。因此，在體循環（pH7. 4)下，Η)ΡΑ為內核的納米粒保持穩 定；但被腫瘤細胞攝取后，在內涵體/溶酶體PH4. 0?6. 5條件下，PDPA鏈上的二異丙氨基 發生質子化而使內核由疏水變為親水，協同交聯層二硫鍵（S-S)的GSH響應性斷裂，促進納 米粒在腫瘤細胞內崩解并快速釋放藥物。
[0008] 優選的，pH與氧化還原雙敏感層交聯納米粒的表面親水段為兩性離子聚合物聚 羧酸甜菜堿（PCB)，其能夠通過靜電作用形成穩定的水化層，降低RES對納米粒的體循環清 除。
[0009] 優選的，在pH與氧化還原雙敏感層交聯納米粒的表面親水層上可修飾上腫瘤靶 向基團，通過納米粒對腫瘤細胞的特異性靶向作用，促進納米粒在腫瘤組織的富集和腫瘤 細胞的內吞。
[0010] 優選的，靶向基團與聚合物的摩爾比為〇. 01?1。
[0011] 優選的，腫瘤靶向基團選自多肽 RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、 CGNKRTRGC、RPARPAR，以及白細胞介素 IL-13p、葉酸等；其中的R、G、D、C、K等大寫字母是各 種氨基酸的單字符縮寫符號，如R代表精氨酸，G代表甘氨酸。
[0012] 進一步優選的，由式1所示的l)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或2) RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA與PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物共組裝形成納米粒，再經PDS的交聯反 應形成層交聯納米粒。其特征在于（如附圖1所示），該納米粒最外層為能夠與腫瘤血管內 皮細胞和腫瘤細胞表面過表達的整合素受體結合的RGD和兩性離子PCB ;內部為高度pH敏 感的Η)ΡΑ疏水核；親水層與疏水核之間為二硫鍵交聯層。該納米粒，通過親水段兩性離子 的靜電作用形成穩定的水化層，使得納米粒在血液循環中能夠穩定存在，減少RES系統的 清除，延長體循環時間；RGD靶向配體，提高納米載體在腫瘤組織的富集和滯留，增強腫瘤 細胞對納米藥物載體的攝取；二硫鍵殼層交聯，抑制藥物在正常生理條件下的釋放以降低 毒副作用，而被腫瘤細胞攝取后，在腫瘤細胞內谷胱甘肽（GSH?10mM)作用下，二硫鍵斷裂 使交聯結構快速解離；酸敏感的疏水內核在內涵體/溶酶體微酸環境中（pH4. 0?6. 5)，發 生疏水-親水轉變而使納米粒解體，促進藥物快速釋放，提高藥效。
[0013]

【權利要求】
1. 一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒，其特征在于，所述的納米粒表面是至少 含有聚羧酸甜菜堿（PCB)或聚乙二醇（PEG)的親水層，內部是至少含有pH敏感的聚合物單 元的疏水核，親水層與疏水核之間是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚（ros)單元經二硫 鍵（S-S)形成的交聯層。
2. 權利要求1所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒，其特征在于所述的pH敏 感的聚合物為聚甲基丙烯酸二異丙氨基乙酯（PDPA)。
3. 權利要求2所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒，其特征在于表面親水層帶 有腫瘤靶向基團。
4. 權利要求3所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒，其特征在于腫瘤靶向基團 選自多肽 RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、CGNKRTRGC、RPARPAR，以及白細胞 介素 IL-13p或葉酸。
5. 權利要求4所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒，其特征在于是由式1所 示的 l)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 或 2)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 與 PCB-b-PDS-b-PDPA 聚合 物共組裝形成納米粒，再經ros的交聯反應形成二硫鍵（S-S)層交聯；所述的嵌段聚合物 RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 或 PCB-b-PDS-b-PDPA 中，PCB 聚合度 X 為 25 ?70 的整數，PDS 聚 合度y為1?15的整數，PDPA聚合度Z為25?70的整數；
6. 權利要求5所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒的制備方法，是采用活性可 逆加成鏈轉移（RAFT)聚合方法制備，特征是步驟如下： 1) 采用三硫代十二烷基-2-異丙酸酯（CTAm)為RAFT鏈轉移劑，偶氮二異丁腈（AIBN) 為引發劑，逐步引發羧酸甜菜堿叔丁酯甲基丙烯酸甲酯（CB-tBU)、甲基丙烯酰胺乙基吡啶 二硫醚（DS)和甲基丙烯酸二異丙氨基乙酯（DPA)聚合，得到PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌 段聚合物； 2) 二甲基亞砜（DMSO)中，PCB (tBU) -b-PDS-b-PDPA與N-羥基琥珀酰亞胺（NHS) 和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC.HC1)于室溫下反應2-4h后， 加入巰基乙醇淬滅未反應的EDC. HCl，之后加入RGD，于室溫下繼續反應12-36h，得到 RGD-PCB (tBU) -b-PDS-b-PDPA 三嵌段聚合物； 3) 將 RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA 或 PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA 三嵌段聚合物在室 溫下用三氟乙酸（TFA)水解PCB (tBU)嵌段上的叔丁酯，得到RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或 PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物。
7. 權利要求1?5任意一項所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒載藥應用，其 特征是納米粒核內包載疏水藥物，其中藥物含量為納米粒質量的〇. 5-15% ;所述的納米粒 的平均粒徑優選為50-300nm。
8. 權利要求7所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒應用，其特征是所述疏水性 藥物選自阿霉素、紫杉醇、多西他賽、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春花堿、地塞米松、姜黃素或博 來霉素中的一種或多種的任意組合。
9. 權利要求7或8所述的納米粒應用方法，特征是：將疏水性藥物與嵌段共聚物如 RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或（和）PCB-b-PDS-b-PDPA溶解于二甲基亞砜中，加入二硫蘇糖 醇（DTT)，在氮氣保護下至少反應15min ;然后將有機相溶液置于薄膜透析袋中，在1000? 2000倍體積的脫氧的pH = 7. 4的0. OlM的磷酸鹽緩沖溶液中透析提純；透析結束后，透析 袋中形成的載藥納米粒溶液，在超聲作用下至少反應，完成二硫鍵層交聯，得到PH與氧化 還原雙敏感的層交聯納米粒水分散液，凍干，得到可再分散的納米粒凍干粉。
10. 權利要求1所述的PH與氧化還原雙敏感的層交聯納米粒的應用，其特征在于可用 于藥物、核酸、蛋白、多肽、多糖類大分子的體內遞送，或用于診斷試劑、熒光探針的遞送；所 述載藥雙敏感層交聯納米粒劑型為凍干粉或者為生理鹽水分散液針劑。
【文檔編號】A61K47/34GK104231193SQ201410366575
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】董岸杰, 黃平升, 鄧聯東 申請人:天津大學