苦丁茶在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途
【專利摘要】本發明涉及苦丁茶的新用途，即苦丁茶在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途，特別是苦丁茶提取物及苦丁茶總黃酮在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途。
【專利說明】苦丁茶在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及苦丁茶的新用途，特別是苦丁茶提取物及苦丁茶總黃酮的新用途，即 在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途。

【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（AD)和血管性癡呆（VD)是老年期癡呆中最常見的類型。《中國老 年學雜志》收載的"阿爾茨海默病發病機制中炎性反應的研宄進展"，公開了 AD占癡呆病人 總數的50%?60%，VD占15%?20%。其特征性病理學改變是大腦皮層和皮層下神經原 纖維纏結（NFT)、細胞外大量老年斑（SP)形成及神經元缺失。大量研宄認為β淀粉樣蛋白 (|3amyloidprotein，Αβ)在AD發病中起著主軸作用，Αβ的神經毒作用是多種因素導致 AD發病的共同通路。目前針對Αβ的神經毒作用的防治措施主要有以下幾方面：減少Αβ 的前體即β淀粉樣前體蛋白（0amyloidprecursorprotein，APP)的量；調節APP的裂解， 減少Αβ的產生；促進Αβ的降解和清除；防止Αβ的聚集和沉積；阻斷Αβ作用機制的關 鍵環節等（"阿爾茨海默病中β淀粉樣蛋白神經毒性作用研宄進展"，《中國神經精神疾病 雜志》）。
[0003] 《本草綱目》中記載苦丁茶煮飲能止渴、明目、除煩，令人不唾，消痰利水，通小腸， 治淋，止頭痛煩熱，噙咽，清上膈，利咽喉。《中國醫學大辭典》記載苦丁茶"散肝風，清頭目， 治耳嗚，耳聾，脖耳流膿，活血脈，涼子宮。"
[0004] 苦丁茶中含有苦丁皂甙、氨基酸、維生素 C、多酚類、黃酮類、咖啡堿、蛋白質等200 多種成分。苦丁茶中的化學成分主要為黃酮類和三萜及皂苷類。目前從大葉冬青及苦丁茶 冬青植物中分離鑒定出8種黃酮類成分，多為黃酮及黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮類化合物 及 Kaempferol、Isorhamnetin、Nicotiflorin、Quercetin。
[0005] 根據已有的苦丁茶研宄結果，認為苦丁茶具有降糖降脂、降血壓、抗菌、抗氧化、調 節免疫、減肥清脂、改善心腦系統及抗生育等多種作用。
[0006] "苦丁茶的心血管藥理作用研宄"《中藥材》公開通過大鼠實驗表明：苦丁茶水提 取液對于防治冠心病緩解心絞痛是有益的。
[0007] "苦丁茶冬青葉的降壓作用研宄"《醫學教育探索》公開苦丁茶冬青葉提取物對 2K1CH大鼠和SHR這兩種重要的研宄人類原發性高血壓發病機理不可缺少的動物模型均可 產生明顯降壓作用。
[0008] "苦丁茶降血脂的實驗及臨床研宄"《護理研宄》對苦丁茶醇溶和醇不溶兩種成分 進行了實驗和臨床研宄，結果苦丁茶醇溶和醇不溶兩種成分均有明顯地降低大鼠三酰甘油 的作用；對人的降脂總有效率為78. 57%，對血脂異常者，TC、TG降低，HDL-C升高。
[0009] "苦丁茶提取物抗氧化作用的研宄"《廣西民族學院學報》，公開苦丁茶提取物對大 鼠肝體外脂質過氧化均有一定的抑制作用。而且大葉冬青葉水煎液對大鼠腎上腺素性高血 糖有明顯抑制作用，臨床使用可顯著調節患者的各項指標和臨床癥狀，療效明顯。
[0010] "苦丁茶對豚鼠離體氣管平滑肌收縮功能的影響"《中國中藥志》表明苦丁茶可拮 抗多種介質引起的支氣管平滑肌收縮作用，可能具有非特異性氣管平滑肌Ca2+拮抗作用。 [0011] "苦丁茶對小鼠免疫功能的影響"《牡丹江醫學院學報》發現苦丁茶煎液有增強和 調節機體免疫功能作用的結論。
[0012] "苦丁湯治療慢性前列腺80例療效觀察"《廣西中藥》發現自擬苦丁茶湯對慢性前 列腺炎的主要癥狀具有良好的改善作用，其中對局部疼痛不適和尿道癥狀改善尤為明顯。
[0013] "苦丁茶提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶的影響"《中國老年學雜志》發現 苦丁茶提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶力具有促進作用。
[0014] 此外，還有一些文獻公開了苦丁茶冬青具有提高小鼠耐缺氧，耐低溫，增加運動能 力的作用；對胃癌患者化療后靜脈炎、血管硬化有一定治療作用；有一定的抗腫瘤活性，而 其中老葉乙醇提取物和鮮葉揮發油抗腫瘤活性最高。
[0015] 目前從冬青科苦丁茶中分離鑒定出8種黃酮類成分，多為黃酮及黃酮醇，二氫黃 酮，二氫黃酮類化合物及Kaempferol (山奈酷）、Isorhamnetin (異鼠李素）、Nicotiflorin、 Quercetin (槲皮素）。與苦丁茶總黃酮相關的研宄如下：
[0016] "苦丁茶抗氧化成分及抗氧化性能研宄"《廣西植物》公開了從大葉冬青中分離的 多酚、多糖、生物堿、黃酮類物質在不同油脂，不同溫度下，都具有明顯抗氧化性能。
[0017] "大葉冬青葉若干生化指標測定及抗菌活性研宄"《揚州大學學報（農業與生命科 學版）》公開了大葉冬青微波干燥葉中總黃酮甙元、總黃酮甙總生物堿等具有一定抗菌活 性。
[0018] 目前沒有文獻資料提到冬青科苦丁茶或苦丁茶總黃酮可用于治療阿爾茲海默病。


【發明內容】

[0019] 本發明的目的是提供苦丁茶在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途；
[0020] 本發明的另一目的是提供苦丁茶提取物在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新 用途；
[0021] 本發明的另一目的是提供苦丁茶總黃酮在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新 用途；
[0022] 本發明的另一目的是提供苦丁茶提取物的制備方法；
[0023] 本發明的另一目的是提供苦丁茶總黃酮的制備方法。
[0024] 本發明的目的是通過下列的技術方案實現的：
[0025] 本發明原料來源：
[0026] 苦丁茶：冬青科植物苦丁茶IlexkudingchaC. J. Tseng的干燥葉。收載在《廣西中 藥材標準》1990年版第63頁。【性味】苦、甘，涼。【功能與主治】散風熱，清頭目，除煩渴。 用于頭痛，齒痛，目赤，耳鳴，耳中流膿，熱病煩渴，痢疾。
[0027] 發明人在研宄阿爾茲海默病的治療過程中發現，冬青科植物苦丁茶特別是苦丁茶 所含總黃酮表現出能減少神經細胞內β -淀粉樣多肽的聚集，同時還具有神經保護作用， 實現了對阿爾茲海默氏病病理進程的干預和病理癥狀的顯著改善，從而有效治療阿爾茲海 默病。
[0028] AD等神經元退行性疾病發病機理復雜，其中氧自由基引起的過氧化損傷是AD等 老年疾病發病的重要因素。SOD是機體清除自由基的重要酶類，其作用主要是催化生物氧化 產生超氧自由基，清除并阻止由氧自由基引發的自由基連鎖反應。MDA是自由基對生物細胞 膜損傷的主要代謝產物，能使生物膜變性、壞死，使DNA發生突變、交鏈，同時使SOD活性降 低，而造成自由基連鎖反應的惡性循環。腦老化過程中，神經細胞膜不飽和脂肪酸被氧化產 生大量自由基，損傷細胞膜、細胞器，產生炎癥反應，最終引起細胞凋亡、退行性病變、學習 記憶能力下降，最終導致AD等眾多老年病的發生。在研宄中發現，苦丁茶及苦丁茶總黃酮 的給予明顯減少了大鼠腦組織MDA含量的增加，而同時能夠提供大鼠腦組織的SOD活性，這 些數據表明苦丁茶總黃酮對AD大鼠腦組織氧自由基的清除具有明顯的改善作用。
[0029] 目前已有大量的研宄證實了抗自由基在治療AD的重要作用。苦丁茶總黃酮作為 抗自由基作用機制可能是：用于脂質過氧化物，打斷鏈鎖反應，抑制不飽和脂肪酸過氧化， 抑制磷脂酶A2及脂化酶活性，減少自由基形成。當然，苦丁茶總黃酮對AD大鼠的保護作 用可能是一個復雜的機制，其具體機制還需做進一步研宄。雖然目前對其具體作用機制還 不完全明了，但苦丁茶總黃酮對AD等模型動物腦損傷、神經元退變都具有較好的治療及保 護作用，其對AD等神經元退變疾病的防治提供了另一種啟示：即抗自由基在AD等神經元退 行性疾病中可能扮演著重要角色，而通過抗自由基的使用對神經元退行性疾病可能取得不 錯的療效。
[0030] 本發明專利臨床應用的安全性較高，在治療阿爾茲海默病的藥物治療中不失為一 種好藥，其拓寬了治療阿爾茲海默病的新方法，同時為患者解決了現有技術治療阿爾茲海 默病時出現的不良反應。
[0031] 因此， 申請人:提供苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶總黃酮能夠用于治療阿爾茲海默 病藥物方面的新用途。
[0032] 本發明還公開了苦丁茶提取物在制備治療阿爾茲海默病藥物的應用，所述苦丁茶 提取物的制備包括以下步驟：
[0033] 苦丁茶粉碎，加入濃度為40-80%的乙醇加熱回流提取三次，每次乙醇用量為藥材 總重量10-20倍量，每次提取時間為30-60分鐘，提取溫度為60-80 °C，合并提取液，濃縮，過 濾，得苦丁茶提取物。
[0034] 本發明還公開了苦丁茶總黃酮在制備治療阿爾茲海默病藥物的應用，所述苦丁茶 總黃酮的制備包括以下步驟：
[0035] 苦丁茶粉碎后，加入濃度為40-80%的乙醇微波提取三次，每次乙醇用量為藥材總 重量10-20倍量，每次提取時間為3-10分鐘，提取溫度為50-90°C，合并提取液，濃縮，過濾， 過弱酸性陽離子交換樹脂吸附，用濃度為70-90%的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，得 苦丁茶總黃酮。
[0036] 本發明公開的苦丁茶總黃酮在制備治療阿爾茲海默病藥物的應用，所述苦丁茶總 黃酮的制備還可以通過以下步驟：
[0037] 苦丁茶粉碎，過80目過篩，加入濃度為70%的乙醇780W微波提取三次，每次乙醇 用量為藥材總重量15倍量，每次提取時間為5分鐘，提取溫度為80°C，合并提取液，濃縮，加 硅藻土過濾，過ADS-17樹脂吸附，用濃度為90 %的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，得苦 丁茶總黃酮。
[0038] 本發明提供的苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶總黃酮用于治療阿爾茲海默病藥物 方面的新用途具有以下優點：
[0039] 1、苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶總黃酮從冬青科植物苦丁茶中而得，安全無毒， 可長期服用。
[0040] 2、空間學習記憶能力測定顯示，苦丁茶提取物及苦丁茶總黃酮組大鼠分別在不同 程度上減少了大鼠的尋臺潛伏期，這些數據表明苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶總黃酮對大 鼠記憶力具有明顯的改善作用。
[0041] 3、在"對AD大鼠記憶能力的影響"實驗中發現，苦丁茶提取物及苦丁茶總黃酮明 顯減少了大鼠腦組織MDA含量的增加，而同時能夠提高大鼠腦組織的SOD活性，這些數據表 明苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶總黃酮對AD大鼠腦組織氧自由基的清除具有明顯的改善 作用。

【具體實施方式】
[0042] 下面通過實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明的實施例是用于說明 本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進都屬于本發明 要求保護的范圍。除非另有說明，本發明中的乙醇量的百分數是體積百分數，v/v表示溶液 的體積比。
[0043] 實施例1 :
[0044] 取IOkg苦丁茶粉碎，加入濃度為40%的乙醇加熱回流提取三次，每次乙醇用量為 藥材總重量10倍量，每次提取時間為60分鐘，提取溫度為60°C，合并提取液，濃縮，過濾，得 苦丁茶提取物。
[0045] 實施例2 :
[0046] 取IOkg苦丁茶粉碎，加入濃度為40%的乙醇微波提取三次，每次乙醇用量為藥 材總重量10倍量，每次提取時間為10分鐘，提取溫度為50°C，合并提取液，濃縮，過濾，過 ADS-17樹脂吸附，用濃度為90%的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，得苦丁茶總黃酮。
[0047] 以蘆丁作對照品，測苦丁茶總黃酮得率為2. 91%。
[0048] 實施例3 :
[0049] 取IOkg苦丁茶粉碎，過80目過篩，加入濃度為70 %的乙醇780W微波提取三次，每 次乙醇用量為藥材總重量15倍量，每次提取時間為5分鐘，提取溫度為80°C，合并提取液， 濃縮，加硅藻土過濾，過ADS-17樹脂吸附，用濃度為90%的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干 燥，得苦丁茶總黃酮。
[0050] 以蘆丁作對照品。測苦丁茶總黃酮得率為3. 67%。
[0051] 實施例4:
[0052] 取IOkg苦丁茶粉碎，加入濃度為80%的乙醇加熱回流提取三次，每次乙醇用量為 藥材總重量20倍量，每次提取時間為30分鐘，提取溫度為60°C，合并提取液，濃縮，過濾，得 苦丁茶提取物。
[0053] 實施例5 :
[0054] 取IOkg苦丁茶粉碎后，加入濃度為80%的乙醇微波提取三次，每次乙醇用量為藥 材總重量20倍量，每次提取時間為3分鐘，提取溫度為90°C，合并提取液，濃縮，過濾，過 ADS-17樹脂吸附，用濃度為70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，得苦丁茶總黃酮。
[0055] 以蘆丁作對照品，測苦丁茶總黃酮得率為3. 26%。
[0056] 藥效實驗：對AD大鼠記憶能力的影響
[0057] 1實驗材料
[0058] L 1 動物
[0059] SD大鼠清潔級，2月齡，?，質量180?220g，購買自廣西醫科大學實驗動物中心 (生產許可證號：SCXK桂2009-0002)。
[0060] L 2 儀器
[0061] Morris水迷宮XR-XM(aze)和BI2000圖像分析系統（上海欣軟信息科技有限公 司
[0062] 1. 3 試劑
[0063] AlCl3 · 6H20(國產分析純），羧甲基纖維素鈉（國產分析純），超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛（MDA)試劑盒，由南京建成生物工程研宄所提供。
[0064] 2.方法
[0065] 2. 1溶液配制
[0066] AlCl3 ·6Η20和羧甲基纖維素鈉臨用前用蒸餾水配制；苦丁茶提取物及苦丁茶總黃 酮在臨用前用質量濃度為〇. 2%羧甲基纖維素鈉配制成濃度為15mg/ml。
[0067] 2. 2AD動物模型的建立（慢性鋁過負荷建立老年癡呆（AD)大鼠模型）
[0068] 大鼠按質量隨機分成5組，每組12只，即：
[0069] 空白對照：0· 2%羧甲基纖維素鈉
[0070] 模型組：A1C13溶液 200mg/kg ;
[0071] 實施例1組：造模后大鼠給予實施例1苦丁茶提取物，給藥量按生藥量l〇〇mg/kg 計；
[0072] 實施例2組：給予實施例2苦丁茶總黃酮，給藥量按生藥量100mg/kg計；
[0073] 實施例3組：給予實施例3苦丁茶總黃酮，給藥量按生藥量100mg/kg計；
[0074] 實施例1、2、3組在灌胃鋁Ih后給藥，灌胃容積按照lml/lOOg大鼠體重計算，每周 5d，連續20周。
[0075] 2. 3空間學習記憶能力測試
[0076] 使用Morris水迷宮對大鼠空間學習記憶能力進行測試，水溫控制在24?25°C。 測試分為2個階段：第1階段，第一次訓練時將大鼠放到平臺上適應60s，然后讓其自由游 泳至平臺，3min內未找到平臺者，實驗者協助將其引至平臺，從第2天起，每天訓練4次，每 次訓練時選擇1個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠進行定向航行，持續訓練4d ; 第2階段，即在第5天時進行測試，撤去平臺，并任意將大鼠從最后一次訓練時的入水方位 放入，電腦記錄大鼠第一次跨越原平臺的時間即尋臺潛伏期，以尋臺潛伏期作為大鼠的空 間定向能力成績，超過180s以180s計算。
[0077] 2. 4腦組織SOD和MDA含量測定
[0078] 空間學習記憶能力測試后，處死全部大鼠，取大鼠腦組織并分離出海馬組織，用生 理鹽水配制成質量濃度為l〇〇g/L的勻漿，測定SOD活性及大鼠腦組織MDA含量，具體測定 方法及步驟按照相應試劑盒說明書進行。
[0079] 2. 5統計學處理
[0080] 實驗數據用x±s表示，采用SPSS 16. 0統計軟件包進行方差分析，P〈0. 05為有顯 著性差異，P〈〇. Ol為有極顯著性差異。
[0081] 3.實驗結果
[0082] 3. 1對AD模型大鼠空間學習記憶能力的影響
[0083] 空間學習記憶能力測定顯示，AD模型組大鼠尋找平臺的時間在第1、2、3、4天分別 比空白組明顯延長（P〈〇.〇l)，這表明AD模型組大鼠的學習能力明顯降低。而實施例2、3組 大鼠在第1、2、3、4天尋臺潛伏期相比AD模型組大鼠明顯縮短（P〈0.01，P〈0.05)，實施例1 組大鼠在前4d的尋臺潛伏期也比AD模型組大鼠有不同程度的縮短，但縮短程度明顯不如 實施例2、3組，結果見表1。
[0084] 表1對AD大鼠空間學習能力的影響（η = 12, X土s)
[0085]

【權利要求】
1. 苦丁茶在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途。
2. 苦丁茶提取物在制備治療阿爾茲海默病藥物方面的新用途。
3. 根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述苦丁茶提取物通過以下步驟制備而 得：苦丁茶粉碎，加入濃度為40-80%的乙醇加熱回流提取三次，每次乙醇用量為藥材總重 量10-20倍量，每次提取時間為30-60分鐘，提取溫度為60-80°C，合并提取液，濃縮，過濾， 得苦丁茶提取物。
4. 苦丁茶總黃酮在制備治療阿爾茲海默病方面的新用途。
5. 根據權利要求4所述的用途，其特征在于所述苦丁茶總黃酮通過以下步驟制備而 得：苦丁茶粉碎后，加入濃度為40-80%的乙醇微波提取三次，每次乙醇用量為藥材總重量 10-20倍量，每次提取時間為3-10分鐘，提取溫度為50-90°C，合并提取液，濃縮，過濾，過弱 酸性陽離子交換樹脂吸附，用濃度為70-90%的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，得苦丁 茶總黃酮。
6. 根據權利要求4所述的用途，其特征在于所述苦丁茶總黃酮通過以下步驟制備而 得：苦丁茶粉碎，過80目過篩，加入濃度為70%的乙醇780W微波提取三次，每次乙醇用量 為藥材總重量15倍量，每次提取時間為5分鐘，提取溫度為80°C，合并提取液，濃縮，加硅藻 土過濾，過ADS-17樹脂吸附，用濃度為90 %的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，得苦丁茶 總黃酮。
7. 苦丁茶提取物與醫藥學上可接受的載體配合成在制備治療阿爾茲海默病藥物方面 的新用途。
8. 苦丁茶總黃酮與醫藥學上可接受的載體配合成在制備治療阿爾茲海默病藥物方面 的新用途。
【文檔編號】A61K36/185GK104435025SQ201410833147
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優先權日:2014年12月29日
【發明者】劉冠萍, 賢明華, 陳瑛, 張栩顏 申請人:廣西梧州制藥（集團）股份有限公司