技術領域

本發明涉及使用JAK1和/或JAK2的抑制劑與PI3Kδ的抑制劑的組合治療B細胞惡性腫瘤的方法。

背景

B細胞受體(BCR)在正常B細胞和大多數惡性B細胞中都存在。BCR的接合提供重要的存活信號，并且BCR信號的中斷可以導致B細胞死亡。使用siRNA進行的抑制BCR表達的研究已經表明，通過BCR進行的組成型信號傳導對人B細胞淋巴瘤的存活和增殖來說是至關重要的。BCR信號傳導在這些細胞中的主要作用似乎是脾酪氨酸激酶(Syk)的激活，這進而導致若干促進細胞存活的下游事件，包括布魯頓酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase(BTK))、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和AKT的激活。已經表明許多B細胞惡性腫瘤(包括彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL))特別依賴BCR存活信號，如通過在體外它們對BCR信號傳導元件的遺傳抑制和藥理學抑制的敏感性所證明。已經表明DLBCL細胞接合PI3K，從而增強抗凋亡NF-kB信號傳導和存活信號，并且PI3K/AKT途徑的抑制與殺傷DLBCL細胞系中的NF-kB抑制在體外協同作用。

通過產生細胞因子和生長因子，JAK的異常激活也一直與許多腫瘤類型中增加的惡性細胞增殖和存活相關聯。JAK激活許多牽涉惡性細胞的增殖和存活的下游途徑，包括為重要潛在轉錄因子家族的STAT。關于臨床相關性，已經發現與正常對照相比，通過JAK信號傳導的血清IL-10和IL-6的水平在DLBCL患者中升高(Gupta等,2012)。此外，具有高血清IL-10水平的患者顯示具有更短的無事件存活(Gupta等,2012)。在JAK激酶家族中，已經顯示JAK1與JAK2、JAK3和TYK2協作，并且在介導許多炎性細胞因子(包括IL-6、IL-10和干擾素)的信號傳導中起主導作用。

在DLBCL中，JAK途徑激活通過自分泌和旁分泌機制發生。在腫瘤細胞中，BCR信號傳導通過激活NF-kB途徑導致增加的IL-6和IL-10產生(Lam等,2008)。DLBCL的亞群已被表征為具有高STAT3、IL-6和/或IL-10表達，并且已經表明JAK抑制在這些DLBCL細胞系中是細胞毒性的且與NF-kB抑制劑協同作用。除了通過自分泌途徑激活JAK/STAT途徑，間質區室也可以旁分泌方式提供這些細胞因子的來源(Hodge等,2005)。

出于這些原因，需要開發可用于治療B細胞惡性腫瘤(諸如DLBCL)的新穎療法。本發明是針對此需要和其他需要。

附圖說明

圖1A描繪探測各種DLBCL細胞系的IL6和IL10的蛋白質印跡分析。

圖1B描繪針對用IL6或IL10處理的Pfeiffer細胞的激動蛋白和p-Stat3的蛋白質印跡分析。

圖2A描繪Pfeiffer細胞中細胞增殖測定中的抑制％，作為具有媒介物(DMSO)、DMSO+IL10和DMSO+IL10+魯索利替尼(ruxolitinib)的化合物28的濃度的函數。

圖2B描繪Pfeiffer細胞中細胞增殖測定中的抑制％，作為具有媒介物(DMSO)、DMSO+IL10和DMSO+IL10+化合物7的化合物28的濃度的函數。

圖3描繪HBL-1細胞中細胞增殖測定中的抑制％，作為具有媒介物(DMSO)、DMSO+IL10和DMSO+IL10+魯索利替尼的化合物28的濃度的函數。

圖4描繪在有或無IL10的情況下用媒介物(DMSO)、魯索利替尼、化合物28、或化合物28和魯索利替尼處理后，Pfeiffer細胞的蛋白質印跡分析。

圖5描繪在有或無IL10的情況下用媒介物(DMSO)、化合物7、化合物28、或化合物28和化合物7處理后，Pfeiffer細胞的蛋白質印跡分析。

圖6描繪Pfeiffer細胞中細胞增殖測定中的抑制％，作為具有媒介物(DMSO)、DMSO+IL10和DMSO+IL10+化合物16的化合物28的濃度的函數。

圖7描繪用化合物28+/-化合物16處理的Pfeiffer細胞的膜聯蛋白-V染色，其表明來自組合療法的協同凋亡誘導。

圖8描繪在用化合物28+/-化合物16處理之后Pfeiffer細胞的蛋白質印跡分析，其表明對STAT3和pAKT的作用。

概述

本申請提供一種治療有需要的患者中的B細胞惡性腫瘤的方法，所述方法包括向所述患者施用：(a)JAK1和/或JAK2的抑制劑；以及(b)PI3Kδ的抑制劑。

本申請還提供一種治療有需要的患者中的選自以下的疾病的方法：彌漫性大B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、套膜細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、結外邊緣區淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom's macroglobulinemia)、前淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、骨髓纖維化、粘膜相關的淋巴組織(MALT)淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、脾邊緣區淋巴瘤、原發性滲出淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、漿細胞白血病、髓外漿細胞瘤、郁結性骨髓瘤(也稱無癥狀骨髓瘤)、意義未明的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)、活化B細胞樣(ABC)彌漫性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)以及生發中心B細胞(GCB)彌漫性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)，所述方法包括向所述患者施用：(a)JAK1和/或JAK2的抑制劑；以及(b)PI3Kδ的抑制劑。

在所述方法的一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑選自：

3-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈；

3-[1-(6-氯吡啶-2-基)吡咯烷-3-基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈；

3-(1-[1,3]噁唑并[5,4-b]吡啶-2-基吡咯烷-3-基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈；

4-[(4-{3-氰基-2-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙基}哌嗪-1-基)羰基]-3-氟苯甲腈；

4-[(4-{3-氰基-2-[3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基]丙基}哌嗪-1-基)羰基]-3-氟苯甲腈；

{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異煙酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈；

4-{3-(氰甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-N-[4-氟-2-(三氟甲基)苯基]哌啶-1-甲酰胺；

[3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-1-(1-{[2-(三氟甲基)嘧啶-4-基]羰基}哌啶-4-基)氮雜環丁烷-3-基]乙腈；

[反式-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-(4-{[2-(三氟甲基)嘧啶-4-基]羰基}哌嗪-1-基)環丁基]乙腈；

{反式-3-(4-{[4-[(3-羥基氮雜環丁烷-1-基)甲基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}哌啶-1-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]環丁基}乙腈；

{反式-3-(4-{[4-{[(2S)-2-(羥甲基)吡咯烷-1-基]甲基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}哌啶-1-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]環丁基}乙腈；

{反式-3-(4-{[4-{[(2R)-2-(羥甲基)吡咯烷-1-基]甲基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}哌啶-1-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]環丁基}乙腈；

4-(4-{3-[(二甲基氨基)甲基]-5-氟苯氧基}哌啶-1-基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丁腈；

5-{3-(氰甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-N-異丙基吡嗪-2-甲酰胺；

4-{3-(氰甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺；

5-{3-(氰甲基)-3-[4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-N-異丙基吡嗪-2-甲酰胺；

{1-(順式-4-{[6-(2-羥乙基)-2-(三氟甲基)嘧啶-4-基]氧基}環己基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈；

{1-(順式-4-{[4-[(乙基氨基)甲基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}環己基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈；

{1-(順式-4-{[4-(1-羥基-1-甲基乙基)-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}環己基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈；

{1-(順式-4-{[4-{[(3R)-3-羥基吡咯烷-1-基]甲基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}環己基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈；

{1-(順式-4-{[4-{[(3S)-3-羥基吡咯烷-1-基]甲基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}環己基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈；

{反式-3-(4-{[4-({[(1S)-2-羥基-1-甲基乙基]氨基}甲基)-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}哌啶-1-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]環丁基}乙腈；

{反式-3-(4-{[4-({[(2R)-2-羥丙基]氨基}甲基)-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}哌啶-1-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]環丁基}乙腈；

{反式-3-(4-{[4-({[(2S)-2-羥丙基]氨基}甲基)-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}哌啶-1-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]環丁基}乙腈；

{反式-3-(4-{[4-(2-羥乙基)-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]氧基}哌啶-1-基)-1-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]環丁基}乙腈；

((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈；

4-[3-(氰甲基)-3-(3',5'-二甲基-1H,1'H-4,4'-雙吡唑-1-基)氮雜環丁烷-1-基]-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺；

以及上述的任一種的藥學上可接受的鹽。

在所述方法的一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑選自：

7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮；

(S)-7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮；

4-[1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-{1-[(2S)-2-羥丙基]氮雜環丁烷-3-基}-3-甲氧基苯甲腈；

4-[1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-[1-(2-羥乙基)氮雜環丁烷-3-基]-3-甲氧基苯甲腈；

5-{3-[1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氰基-2-乙氧基-5-甲基苯基}-N,N-二甲基吡啶-2-甲酰胺；

4-{3-[1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-5-氯-2-乙氧基-6-氟苯基}吡咯烷-2-酮；以及

N-{1-[5-氯-8-(3-氟苯基)噌啉-7-基]乙基}-9H-嘌呤-6-胺；

4-氯-3'-氟-3-甲基-6-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]聯苯基-2-甲腈；

以及上述的任一種的藥學上可接受的鹽。

本申請還提供一種用于與PI3Kδ抑制劑組合使用以治療B細胞惡性腫瘤或本文體現的任何疾病的JAK1和/或JAK2的抑制劑。

本申請還提供JAK1和/或JAK2的抑制劑和PI3Kδ抑制劑用于制備用以治療B細胞惡性腫瘤或本文體現的任何疾病的藥物的用途。

詳述

本申請尤其提供一種治療有需要的患者中的選自以下的疾病的方法：彌漫性大B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、套膜細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、結外邊緣區淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、前淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、骨髓纖維化、粘膜相關的淋巴組織(MALT)淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、脾邊緣區淋巴瘤、原發性滲出淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、漿細胞白血病、髓外漿細胞瘤、郁結性骨髓瘤(也稱無癥狀骨髓瘤)、意義未明的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)、活化B細胞樣(ABC)彌漫性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)以及生發中心B細胞(GCB)彌漫性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)，所述方法包括向所述患者施用：(a)JAK1和/或JAK2的抑制劑；以及(b)PI3Kδ的抑制劑。

在一些實施方案中，所述非霍奇金淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，為復發性或難治性NHL或復發性濾泡NHL。

在一些實施方案中，所述疾病是彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。

在一些實施方案中，所述疾病是活化B細胞樣(ABC)彌漫性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)或生發中心B細胞(GCB)彌漫性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)。

在一些實施方案中，同時施用JAK1和/或JAK2的抑制劑和PI3Kδ的抑制劑。

在一些實施方案中，順序施用JAK1和/或JAK2的抑制劑和PI3Kδ的抑制劑。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑對JAK1和JAK1的選擇性超過對JAK3和TYK2的選擇性。在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑對JAK1的選擇性超過對JAK2、JAK3和TYK2的選擇性。例如，本文所述的一些化合物或其藥學上可接受的鹽優先抑制JAK1超過對JAK2、JAK3和TYK2中的一種或多種的抑制。在一些實施方案中，所述化合物優先抑制JAK1超過對JAK2的抑制(例如JAK1/JAK2IC₅₀比率>1)。在一些實施方案中，所述化合物或鹽對JAK1的選擇性超過對JAK2的選擇性約10倍。在一些實施方案中，所述化合物或鹽對JAK1的選擇性超過對JAK2的選擇性約3倍、約5倍、約10倍、約15倍或約20倍，如通過在1mM ATP下測量IC₅₀所計算(例如參見實施例A)。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為3-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈。在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為(3R)-3-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(魯索利替尼；又稱INCB018424)。在JAK1和JAK2下在1mM ATP(測定A)下，魯索利替尼具有小于10nM的IC₅₀。3-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈和魯索利替尼可通過2006年12月12日提交的US 7,598,257(實施例67)中所描述的工序來制備，所述專利以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為(3R)-3-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈磷酸鹽。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為表1中的化合物或其藥學上可接受的鹽。表1中的化合物對JAK1抑制劑是選擇性的(選擇性超過對JAK2、JAK3和TYK2的選擇性)。在1mM ATP下通過測定A的方法獲得的IC₅₀示于表1中。

表1

+意指<10nM(關于測定條件，參見實施例A)

++意指≤100nM(關于測定條件，參見實施例A)

+++意指≤300nM(關于測定條件，參見實施例A)

^a對映異構體1的數據

^b對映異構體2的數據

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異煙酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈，或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異煙酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈己二酸鹽。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為4-{3-(氰甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺，或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑選自(R)-3-[1-(6-氯吡啶-2-基)吡咯烷-3-基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、(R)-3-(1-[1,3]噁唑并[5,4-b]吡啶-2-基吡咯烷-3-基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、(R)-4-[(4-{3-氰基-2-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙基}哌嗪-1-基)羰基]-3-氟苯甲腈、(R)-4-[(4-{3-氰基-2-[3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基]丙基}哌嗪-1-基)羰基]-3-氟苯甲腈或(R)-4-(4-{3-[(二甲基氨基)甲基]-5-氟苯氧基}哌啶-1-基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丁腈，(S)-3-[1-(6-氯吡啶-2-基)吡咯烷-3-基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、(S)-3-(1-[1,3]噁唑并[5,4-b]吡啶-2-基吡咯烷-3-基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈、(S)-4-[(4-{3-氰基-2-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙基}哌嗪-1-基)羰基]-3-氟苯甲腈、(S)-4-[(4-{3-氰基-2-[3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基]丙基}哌嗪-1-基)羰基]-3-氟苯甲腈、(S)-4-(4-{3-[(二甲基氨基)甲基]-5-氟苯氧基}哌啶-1-基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丁腈；以及上述的任一種的藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，表1中的化合物通過以下專利中所描述的合成工序來制備：2010年5月21日提交的美國專利公布號2010/0298334、2010年8月31日提交的美國專利公布號2011/0059951、2011年3月9日提交的美國專利公布號2011/0224190、2011年11月18日提交的美國專利公布號2012/0149681、2011年11月18日提交的美國專利公布號2012/0149682、2012年6月19日提交的美國專利公布號2013/0018034、2012年8月17日提交的美國專利公布號2013/0045963以及2013年5月17日提交的美國專利公布號2014/0005166，所述專利各自以引用的方式整體并入本文。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑選自以下專利的化合物：2010年5月21日提交的美國專利公布號2010/0298334、2010年8月31日提交的美國專利公布號2011/0059951、2011年3月9日提交的美國專利公布號2011/0224190、2011年11月18日提交的美國專利公布號2012/0149681、2011年11月18日提交的美國專利公布號2012/0149682、2012年6月19日提交的美國專利公布號2013/0018034、2012年8月17日提交的美國專利公布號2013/0045963以及2013年5月17日提交的美國專利公布號2014/0005166，所述專利各自以引用的方式整體并入本文。

本文所述的PI3Kδ的抑制劑可以是選擇性的。“選擇性”意指與至少一種其他激酶相比，化合物以更高親和力結合或以更高功效抑制一種激酶。在一些實施方案中，本文所述的化合物為PI3Kδ的選擇性抑制劑(例如，選擇性超過PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kγ)。在一些實施方案中，選擇性可為至少約2倍、5倍、10倍、至少約20倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或至少約1000倍。選擇性可通過本領域中的常規方法進行測量。在一些實施方案中，選擇性可在各酶的K_mATP濃度下測試。在一些實施方案中，本文所述的化合物的選擇性可通過與特定PI3K激酶活性相關的細胞測定來測定。

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑是表2中所示的化合物。表2的化合物已在測定B中進行了測試，并且顯示為PI3Kδ的抑制劑，其中IC₅₀示于表2中。

表2

+意指<50nM

++意指50nM至200nM

+++意指50nM至100nM

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑選自：

(S)-4-(3-((S)-1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氯-2-乙氧基-6-氟苯基)吡咯烷-2-酮；

(R)-4-(3-((S)-1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氯-2-乙氧基-6-氟苯基)吡咯烷-2-酮；

(S)-4-(3-((R)-1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氯-2-乙氧基-6-氟苯基)吡咯烷-2-酮；

(R)-4-(3-((R)-1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氯-2-乙氧基-6-氟苯基)吡咯烷-2-酮；

N-{(1S)-1-[5-氯-8-(3-氟苯基)噌啉-7-基]乙基}-9H-嘌呤-6-胺；

以及上述的任一種的藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑為(S)-7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮，或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑為4-[1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-{1-[(2S)-2-羥丙基]氮雜環丁烷-3-基}-3-甲氧基苯甲腈，或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑為4-[1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-[1-(2-羥乙基)氮雜環丁烷-3-基]-3-甲氧基苯甲腈，或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑為5-{3-[1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氰基-2-乙氧基-5-甲基苯基}-N,N-二甲基吡啶-2-甲酰胺，或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑選自：

4-[(R)-1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-{1-[(2S)-2-羥丙基]氮雜環丁烷-3-基}-3-甲氧基苯甲腈；

4-[1(R)-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-[1-(2-羥乙基)氮雜環丁烷-3-基]-3-甲氧基苯甲腈；

5-{3-[1(R)-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氰基-2-乙氧基-5-甲基苯基}-N,N-二甲基吡啶-2-甲酰胺；

4-[(S)-1-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-{1-[(2S)-2-羥丙基]氮雜環丁烷-3-基}-3-甲氧基苯甲腈；

4-[1(S)-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氯-2-[1-(2-羥乙基)氮雜環丁烷-3-基]-3-甲氧基苯甲腈；

5-{3-[1(S)-(4-氨基-3-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)乙基]-6-氰基-2-乙氧基-5-甲基苯基}-N,N-二甲基吡啶-2-甲酰胺；

以及上述的任一種的藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，PI3Kδ的抑制劑是以下專利的化合物：2010年6月28日提交的美國專利公布號US 2011/0015212、2013年8月31日提交的美國專利公布號2013/0059835、2010年12月17日提交的美國專利公布號2011/0183985或2011年12月19日提交的美國專利公布號2012/0157430，所述專利各自以引用的方式整體并入本文。

在一些實施方案中，表2的化合物通過以下專利中的方法來制備：2010年6月28日提交的美國專利公布號US 2011/0015212、2013年8月31日提交的美國專利公布號2013/0059835、2010年12月17日提交的美國專利公布號2011/0183985或2011年12月19日提交的美國專利公布號2012/0157430，所述專利各自以引用的方式整體并入本文。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為(3R)-3-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈或其藥學上可接受的鹽；以及(7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異煙酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈或其藥學上可接受的鹽；并且PI3Kδ的抑制劑為7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，JAK1和/或JAK2的抑制劑為4-{3-(氰甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺或其藥學上可接受的鹽；并且PI3Kδ的抑制劑為7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，本申請提供一種治療有需要的患者中的彌漫性大B細胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述患者施用(3R)-3-環戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈或其藥學上可接受的鹽；并且PI3Kδ的抑制劑為7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，本申請提供一種治療有需要的患者中的彌漫性大B細胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述患者施用{1-{1-[3-氟-2-(三氟甲基)異煙酰基]哌啶-4-基}-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-3-基}乙腈或其藥學上可接受的鹽；以及7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮或其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，本申請提供一種治療有需要的患者中的彌漫性大B細胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述患者施用4-{3-(氰甲基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺或其藥學上可接受的鹽；以及7-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)-6-(3-氟苯基)-3-甲基-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-5-酮或其藥學上可接受的鹽。

本文所述的化合物可為不對稱的(例如具有一個或多個立體中心)。除非另外指示，否則意指所有立體異構體，如對映異構體和非對映異構體。可以光學活性形式或消旋形式分離含有不對稱取代的碳原子的化合物。如何從非光學活性起始材料制備光學活性形式的方法為本領域中已知的，諸如通過外消旋混合物的拆分或通過立體選擇性合成。烯烴的許多幾何異構體、C＝N雙鍵等也可存在于本文所述的化合物中，并且所有此類穩定異構體均涵蓋在本發明中。描述了本發明化合物的順式幾何異構體和反式幾何異構體，并且其可作為異構體的混合物或作為分分離的異構形式分離。在一些實施方案中，化合物具有(R)-構型。在一些實施方案中，化合物具有(S)-構型。

可通過本領域中已知的眾多方法中的任一種拆分化合物的外消旋混合物。示例性方法包括使用手性拆分酸進行分級重結晶，所述手性拆分酸是光學活性的成鹽有機酸。適用于分級重結晶方法的拆分劑為，例如，光學活性酸，諸如D型和L型的酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、杏仁酸、蘋果酸、乳酸或各種光學活性樟腦磺酸諸如β-樟腦磺酸。適用于分級重結晶方法的其他拆分劑包括立體異構純形式的α-甲基-苯甲基-胺(例如，S和R形式或非對映異構純形式)、2-苯基甘氨醇、去甲麻黃堿(norephedrine)、麻黃堿、N-甲基麻黃堿、環己基乙胺、1,2-二氨基環己烷等。

外消旋混合物的拆分也可通過在裝填有光學活性拆分劑(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脫來進行。適合的洗脫溶劑組成可由本領域的技術人員確定。

本文所述的化合物還包括互變異構形式。互變異構形式由單鍵與相鄰雙鍵交換與伴隨的質子遷移共同產生。互變異構形式包括質子轉移互變異構體，其為具有相同的經驗式和總電荷的異構質子化狀態。示例性質子轉移互變異構體包括酮-烯醇對、酰胺-亞氨酸對、內酰胺-內酰亞胺對、烯胺-亞胺對、和質子可占據雜環系統的兩個或更多個位置的環形式，例如1H-咪唑和3H-咪唑、1H-1,2,4-三唑、2H-1,2,4-三唑和4H-1,2,4-三唑、1H-異吲哚和2H-異吲哚以及1H-吡唑和2H-吡唑。互變異構形式可處于平衡狀態或通過適當取代而在空間上鎖定為一種形式。

本文所述的化合物也可包括存在于中間體或最終化合物中的原子的所有同位素。同位素包括原子數相同但質量數不同的那些原子。例如，氫的同位素包括氚和氘。

如本文所用，術語“化合物”意指包括所描繪的結構的所有立體異構體、幾何異構體、互變異構體和同位素。除非另外指定，否則由名稱或結構鑒別為一種特定互變異構形式的本文化合物旨在包括其他互變異構形式。

所有化合物和其藥學上可接受的鹽可與其他物質諸如水和溶劑(例如水合物和溶劑化物)一起存在或可分離。

在一些實施方案中，本文所述的化合物或其鹽大體上是分離的。“大體上分離的”意指化合物從其形成或檢測的環境中至少部分地或大體上分離。部分分離可包括，例如，富含本文所述的化合物的組合物。大體上分離可包括含有至少約50重量％、至少約60重量％、至少約70重量％、至少約80重量％、至少約90重量％、至少約95重量％、至少約97重量％或至少約99重量％的本文所述的化合物或其鹽的組合物。分離化合物和其鹽的方法在本領域中為常規的。

本文采用短語“藥學上可接受的”指在合理醫學判斷范圍內、適用于與人類和動物組織接觸而沒有過量毒性、刺激、過敏反應或其他問題或并發癥、與合理的利益/風險比相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。

如本文所用的表述“環境溫度”和“室溫”為本領域中所了解，且通常指溫度(例如反應溫度)約為進行反應所處的房間的溫度，例如約20℃至約30℃的溫度。

本發明還包括本文所述的化合物的藥學上可接受的鹽。如本文所用，“藥學上可接受的鹽”是指公開的化合物的衍生物，其中通過將現有的酸部分或堿部分轉化為母體化合物的鹽形式來修飾母體化合物。藥學上可接受的鹽的實例包括但不限于，堿性殘基(諸如胺)的無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)的堿或有機鹽等等。本發明的藥學上可接受的鹽包括，母體化合物的例如由無毒無機酸或有機酸形成的常規無毒鹽。本發明的藥學上可接受的鹽可通過常規化學方法由含有堿性部分或酸性部分的母體化合物合成。一般來說，此類鹽可通過使這些化合物的游離酸或堿形式與化學計算量的適當堿或酸在水或有機溶劑或兩者的混合物中反應來制備；一般來說，優選非水性介質，如醚、乙酸乙酯、醇(例如甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇)或乙腈(ACN)。適合的鹽的清單見于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418頁以及Journal of Pharmaceutical Science,66,2(1977)中，其各自以引用的方式整體并入本文。

如本文所用，可互換使用的術語“個體”或“患者”是指任何動物，包括哺乳動物，優選小鼠、大鼠、其他嚙齒類動物、兔、犬、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長類動物，并且最優選人。

在一些實施方案中，所述抑制劑以治療有效量施用。如本文所用，短語“治療有效量”是指研究者、獸醫、醫學博士或其他臨床醫師在組織、系統、動物、個體或人中尋求的引起生物或醫藥響應的活性化合物或藥劑的量。在一些實施方案中，向患者或個體施用的化合物或其藥學上可接受的鹽的劑量為約1mg至約2g、約1mg至約1000mg、約1mg至約500mg、約1mg至約200mg、約1mg至約100mg、約1mg至50mg、或約50mg至約500mg。

如本文所用，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指以下中的一種或多種：(1)抑制疾病；例如，抑制正經歷或顯示疾病、病狀或病癥的病變或癥狀的個體中的疾病、病狀或病癥(即遏止病變和/或癥狀進一步發展)；和(2)改善疾病；例如，改善正經歷或顯示疾病、病狀或病癥的病變或癥狀的個體中的疾病、病狀或病癥(即逆轉病變和/或癥狀)，諸如降低疾病的嚴重性。

組合療法

一種或多種其他藥用藥劑，諸如化學治療劑、抗炎劑、類固醇、免疫抑制劑以及Bcr-Abl、Flt-3、EGFR、HER2、c-MET、VEGFR、PDGFR、cKit、IGF-1R、RAF、FAK、Akt mTOR、PIM和AKT(例如AKT1、AKT2或AKT3)激酶抑制劑(諸如，例如在WO 2006/056399中所述的那些)或其他藥劑(諸如治療性抗體)，可與本發明化合物組合用于治療PI3K相關的疾病、病癥或病狀。可同時或依序向患者施用一種或多種其他藥用藥劑。

用于組合療法中的示例性抗體包括但不限于，曲妥珠單抗(Trastuzumab)(例如抗HER2)、雷珠單抗(Ranibizumab)(例如抗VEGF-A)、貝伐單抗(Bevacizumab)(商品名阿瓦斯丁(Avastin)，例如抗VEGF)、帕尼單抗(Panitumumab)(例如抗EGFR)、西妥昔單抗(Cetuximab)(例如抗EGFR)、利妥昔(Rituxan)(抗CD20)和針對c-MET的抗體。

一種或多種下列藥劑可與本發明化合物組合使用并且以非限制性清單呈現：細胞生長抑制劑、順鉑(cisplatin)、阿霉素(doxorubicin)、泰索帝(taxotere)、紫杉酚(taxol)、依托泊苷(etoposide)、伊立替康(irinotecan)、開普拓(camptostar)、拓撲替康(topotecan)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、埃博霉素(epothilones)、他莫昔芬(tamoxifen)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、甲氨蝶呤(methoxtrexate)、替莫唑胺(temozolomide)、環磷酰胺(cyclophosphamide)、SCH 66336、R115777、L778,123、BMS 214662、易瑞沙(Iressa)、特羅凱(Tarceva)、EGFR的抗體、Gleevec^TM、甘樂能(intron)、阿糖胞苷(ara-C)、阿霉素(adriamycin)、癌得星(cytoxan)、吉西他濱(gemcitabine)、尿嘧啶氮芥(Uracil mustard)、氮芥(Chlormethine)、異環磷酰胺(Ifosfamide)、美法侖(Melphalan)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、哌泊溴烷(Pipobroman)、三亞乙基密胺(Triethylenemelamine)、三亞乙基硫磷酰胺(Triethylenethiophosphoramine)、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲霉素(Streptozocin)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巰基嘌呤(6-Mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-Thioguanine)、磷酸氟達拉濱(Fludarabine phosphate)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、亞葉酸鈣(leucovirin)、ELOXATIN^TM、噴司他丁(Pentostatine)、長春花堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)、長春地辛(Vindesine)、博萊霉素(Bleomycin)、放線菌素(Dactinomycin)、道諾霉素(Daunorubicin)、阿霉素、表阿霉素(Epirubicin)、伊達比星(Idarubicin)、光神霉素(Mithramycin)、脫氧助間型霉素(Deoxycoformycin)、絲裂霉素-C(Mitomycin-C)、L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase)、替尼泊苷(Teniposide)、17α-炔雌醇(17.alpha.-Ethinylestradiol)、二乙基己烯雌酚(Diethylstilbestrol)、睪酮(Testosterone)、潑尼松(Prednisone)、氟甲睪酮(Fluoxymesterone)、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、睪內酯(Testolactone)、醋酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、甲潑尼龍(Methylprednisolone)、甲睪酮(Methyltestosterone)、潑尼松龍(Prednisolone)、曲安西龍(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羥孕酮(Hydroxyprogesterone)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、雌莫司汀(Estramustine)、醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、亮丙瑞林(Leuprolide)、氟他米特(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、戈舍瑞林(goserelin)、順鉑、卡鉑(Carboplatin)、羥基脲(Hydroxyurea)、安吖啶(Amsacrine)、甲基芐肼(Procarbazine)、米托坦(Mitotane)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、左旋咪唑(Levamisole)、諾維本(Navelbene)、阿那曲唑(Anastrazole)、來曲唑(Letrazole)、卡培他濱(Capecitabine)、雷洛昔芬(Reloxafine)、屈洛昔芬(Droloxafine)、六甲密胺(Hexamethylmelamine)、阿瓦斯丁、赫賽汀(herceptin)、百克沙(Bexxar)、萬珂(Velcade)、澤娃靈(Zevalin)、萃克森(Trisenox)、希羅達(Xeloda)、長春瑞濱(Vinorelbine)、卟吩姆(Porfimer)、愛必妥(Erbitux)、脂質體、噻替派(Thiotepa)、六甲密胺(Altretamine)、美法侖、曲妥珠單抗、來曲唑(Lerozole)、氟維司群(Fulvestrant)、依西美坦(Exemestane)、氟維司群(Fulvestrant)、異環磷酰胺(Ifosfomide)、利妥昔單抗(Rituximab)、C225、坎帕斯(Campath)、氯法拉濱(Clofarabine)、克拉屈濱(cladribine)、艾菲地可寧(aphidicolon)、利妥昔、舒尼替尼(sunitinib)、達沙替尼(dasatinib)、替扎他濱(tezacitabine)、Sml1、氟達拉濱(fludarabine)、噴司他丁(pentostatin)、triapine、didox、trimidox、amidox、3-AP、MDL-101、731、苯達莫司汀((bendamustine)(Treanda))、奧法木單抗(ofatumumab)或GS-1101(也稱為CAL-101)。

示例性化學治療劑包括蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib))、沙利度胺(thalidomide)、雷利米德(revlimid)和DNA破壞劑(諸如美法侖、阿霉素、環磷酰胺、長春新堿、依托泊苷、卡莫司汀等)。

示例性類固醇包括皮質類固醇，諸如地塞米松或潑尼松。

示例性Bcr-Abl抑制劑包括美國專利號5,521,184、WO 04/005281和美國序列號60/578,491中公開的屬類和種類的化合物和其藥學上可接受的鹽。

示例性適合的Flt-3抑制劑包括如WO 03/037347、WO 03/099771和WO 04/046120中公開的化合物和其藥學上可接受的鹽。

示例性適合RAF抑制劑包括如WO 00/09495和WO 05/028444中公開的化合物和其藥學上可接受的鹽。

示例性適合FAK抑制劑包括如WO 04/080980、WO 04/056786、WO 03/024967、WO 01/064655、WO 00/053595和WO 01/014402中公開的化合物和其藥學上可接受的鹽。

示例性適合mTOR抑制劑包括如WO 2011/025889中公開的化合物和其藥學上可接受的鹽。

在一些實施方案中，本發明化合物可與一種或多種其他激酶抑制劑(包括伊馬替尼)組合使用，具體來說用于治療對伊馬替尼或其他激酶抑制劑抵抗的患者。

在一些實施方案中，本發明化合物可與化學治療劑組合用于治療癌癥(如多發性骨髓瘤)，且相較于對單獨化學治療劑的反應，可改善治療反應而不加劇其毒性作用。用于治療多發性骨髓瘤的其他藥用藥劑的實例例如，可包括但不限于美法侖、美法侖加潑尼松[MP]、阿霉素、地塞米松和萬珂(硼替佐米)。用于治療多發性骨髓瘤的其他另外的藥劑包括Bcr-Abl、Flt-3、RAF和FAK激酶抑制劑。累加作用或協同作用是組合本發明的PI3K抑制劑與另一藥劑的所要結果。此外，多發性骨髓瘤細胞對藥劑(諸如地塞米松)的抗性可在用本發明PI3K抑制劑治療后逆轉。藥劑可與本發明化合物組合于單一劑型或連續劑型中，或者藥劑可作為單獨劑型同時或依序施用。

在一些實施方案中，皮質類固醇(諸如地塞米松)與本發明化合物組合施用給患者，其中與連續施用相反，間歇地施用地塞米松。

在一些其他實施方案中，本發明化合物與其他治療劑的組合可在骨髓移植或干細胞移植之前、期間和/或之后施用給患者。

藥用制劑和劑型

當用作藥劑時，本文所述的化合物可以藥用組合物形式施用。這些組合物可以制藥領域中熟知的方式制備，并且可根據是需要局部治療還是全身性治療以及待治療的區域而通過多種途徑施用。施用可以是局部(包括透皮、表皮、眼部以及施用到粘膜，包括鼻內、陰道和直腸遞送)、肺部(例如通過吸入或吹入散劑或氣霧劑，包括使用噴霧器；氣管內或鼻內)、口服或腸胃外施用。腸胃外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；或顱內(例如鞘內或腦室內)施用。腸胃外施用可以單一團式劑量形式，或可例如通過連續灌注泵。用于局部施用的藥用組合物和制劑可包括透皮貼片、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和散劑。常規藥用載劑、水性、粉末狀或油性基質、增稠劑等可為必需或期望的。本發明還包括含有作為活性成分的本文所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，與一種或多種藥學上可接受的載劑(賦形劑)組合的藥用組合物。在一些實施方案中，組合物適合于局部施用。在制作本發明組合物時，活性成分通常與賦形劑混合，由賦形劑稀釋或封閉在這種載劑內呈例如膠囊、藥囊、紙或其他容器形式。當賦形劑充當稀釋劑時，它可為充當活性成分的媒介物、載劑或介質的固體、半固體或液體材料。因此，所述組合物可呈片劑、丸劑、散劑、含片、藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣霧劑(呈固體形式或于液體介質中)、含有例如多達10重量％活性化合物的軟膏劑、軟質和硬質明膠膠囊、栓劑、無菌可注射溶液和無菌包裝散劑的形式。

在制備制劑時，活性化合物可在與其他成分組合之前進行研磨以提供適當粒度。如果活性化合物大體上不可溶，那么其可被研磨成小于200目的粒度。如果活性化合物大體上是水溶性的，那么可通過研磨調整粒度以在制劑中提供大體上均一分布，例如約40目。

可使用已知研磨工序(諸如濕磨)來研磨本文所述的化合物以獲得適于形成片劑和其他制劑類型的粒度。本文所述的化合物的細碎(納米微粒)制劑可通過本領域中已知的方法制備，例如參見國際申請號WO 2002/000196。

適合賦形劑的一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿和甲基纖維素。所述制劑可另外包括：潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，諸如羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；和調味劑。本發明的組合物可通過采用本領域中已知的工序配制，以便在向患者施用之后提供活性成分的快速、持續或延遲釋放。

組合物可配制成單位劑型，各劑量含有約5至約1000mg(1g)、更通常約100至約500mg的活性成分。術語“單位劑型”是指適合用作人受試者和其他哺乳動物的單位劑量的物理離散單位，各單位均含有經計算結合適合的藥物賦形劑可產生所需治療作用的預定量的活性材料。

在一些實施方案中，本發明的組合物含有約5至約50mg的活性成分。本領域的普通技術人員應了解這體現了含有約5至約10、約10至約15、約15至約20、約20至約25、約25至約30、約30至約35、約35至約40、約40至約45、或約45至約50mg的活性成分的組合物。

在一些實施方案中，本發明的組合物含有約50至約500mg的活性成分。本領域的普通技術人員應了解這體現了含有約50至約100、約100至約150、約150至約200、約200至約250、約250至約300、約350至約400、或約450至約500mg的活性成分的組合物。

在一些實施方案中，本發明的組合物含有約500至約1000mg的活性成分。本領域的普通技術人員應了解這體現了含有約500至約550、約550至約600、約600至約650、約650至約700、約700至約750、約750至約800、約800至約850、約850至約900、約900至約950、或約950至約1000mg的活性成分的組合物。

本文所述的化合物的類似劑量可用于本發明的方法和用途中。

活性化合物可在廣泛劑量范圍內有效并且通常以藥用有效量施用。然而，應了解實際施用的化合物的量將通常由醫師根據相關情形來確定，所述情形包括待治療的病狀、所選的施用途徑、施用的實際化合物、個別患者的年齡、體重和反應、患者癥狀的嚴重性等。

對于制備固體組合物(諸如片劑)，將主要活性成分與藥用賦形劑混合以形成含有本發明化合物的均質混合物的固體預配制組合物。當稱這些預配制組合物為均質時，所述活性成分通常均勻分散在整個組合物中以使得組合物可易于再分成等效單位劑型，諸如片劑、丸劑和膠囊。然后將此固體預制劑再分成含有例如約0.1至約1000mg本發明活性成分的上述類型的單位劑型。

本發明的片劑或丸劑可包覆或以其他方式混配以提供給予延長作用的優勢的劑型。例如，片劑或丸劑可包含內部劑量組分和外部劑量組分，后者呈位于前者之上的包膜形式。兩種組分可由腸溶層分開，所述腸溶層用于抵抗胃中的崩解并且允許內部組分完整進入十二指腸或延遲釋放。多種材料可用于此類腸溶層或包衣，此類材料包括許多聚合酸和聚合酸與如蟲膠、十六醇和乙酸纖維素的材料的混合物。

可包含本發明的化合物和組合物以便口服或通過注射施用的液體形式包括水溶液，適合調味的糖漿，水性或油性懸浮液，和具有可食用油(諸如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的調味乳液，以及酏劑和類似的藥用媒介物。

用于吸入或吹入的組合物包括藥學上可接受的水性或有機溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液，以及散劑。液體或固體組合物可含有如上所述的適合的藥學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，組合物通過口服或鼻部呼吸途徑施用以達成局部或全身性作用。組合物可通過使用惰性氣體進行霧化。可直接從霧化裝置中呼吸霧化溶液或可將霧化裝置附接至面罩(face mask，tent)、或間歇式正壓呼吸機。溶液、懸浮液或散劑組合物可口服施用或通過鼻部從以適當方式遞送制劑的裝置中施用。

局部制劑可含有一種或多種常規載劑。在一些實施方案中，軟膏劑可含有水和一種或多種疏水性載劑，所述疏水性載劑選自例如液體石蠟、聚氧乙烯烷基醚、丙二醇、白凡士林等。乳膏劑的載劑組合物可以是基于水與甘油和一種或多種其他組分(例如單硬脂酸甘油酯、PEG-單硬脂酸甘油酯和十六基硬脂醇)的組合。可使用異丙醇和水適當地與其他組分(例如像甘油、羥乙基纖維素等)組合來配制凝膠劑。在一些實施方案中，局部制劑含有至少約0.1、至少約0.25、至少約0.5、至少約1、至少約2或至少約5wt％本文所述的化合物。所述局部制劑可適當地包裝于例如100g的管中，所述管任選地與用于治療所選適應癥(例如銀屑病或其他皮膚病狀)的說明書結合。

施用給患者的化合物或組合物的量將根據所施用物、施用目的(諸如預防或治療)、患者狀態、施用方式等變化。在治療應用中，組合物可以足以治愈或至少部分遏止疾病的癥狀和并發癥的量施用給已經罹患所述疾病的患者。有效劑量將取決于待治療的疾病病狀，以及主治臨床醫師根據諸如疾病嚴重性、患者年齡、體重和一般病狀等因素所作的判斷。

施用給患者的組合物可呈上述藥用組合物的形式。這些組合物可通過常規滅菌技術滅菌，或可進行無菌過濾。可包裝水性溶液以用于按原樣使用或凍干，其中凍干制劑在施用之前與無菌水性載劑組合。化合物制劑的pH值通常將在3與11之間、更優選為5至9并且最優選為7至8。應了解使用某些前述賦形劑、載劑或穩定劑將導致形成藥用鹽。

本發明化合物的治療劑量可根據，例如，治療所欲達成的特定用途、化合物的施用方式、患者的健康和狀況以及處方醫師的判斷而變化。本文所述的化合物在藥用組合物中的比例或濃度可根據許多因素(包括劑量、化學特征(例如疏水性)和施用途徑)而變化。例如，本文所述的化合物可以含有約0.1％至約10％w/v化合物的生理緩沖水溶液提供以用于腸胃外施用。一些典型的劑量范圍為每日每公斤體重約1μg至約1g。在一些實施方案中，劑量范圍為每日每公斤體重約0.01mg至約100mg。劑量可能取決于此類變量，如疾病或病癥的類型和進展程度、特定患者的總體健康狀態、所選化合物的相對生物功效、賦形劑的配方以及其施用途徑。有效劑量可從由體外或動物模型測試系統獲得的劑量-反應曲線外推而來。

本發明的組合物還可包含一種或多種其他藥用藥劑，諸如化學治療劑、類固醇、抗炎化合物或免疫抑制劑，其實例列于本文中。

試劑盒

本發明還包括適用于例如治療或預防PI3K相關性疾病或病癥(諸如癌癥)的藥用試劑盒，其包括一個或多個含有包含治療有效量的本文所述的化合物的藥用組合物的容器。此類試劑盒必要時還可包括各種常規藥用試劑盒組分中的一種或多種，例如像具有一種或多種藥學上可接受的載劑的容器、其他容器等，這些對本領域的技術人員是顯而易知的。呈插頁或標簽形式的指示待施用的組分的量、施用準則、和/或組分混合準則的說明書也可包括在試劑盒中。

實施例

實施例1.((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈

步驟1.(4S)-2,2-二甲基-4-乙烯基-1,3-噁唑烷-3-甲酸叔丁酯

向甲基三苯基溴化鏻(5.63g，15.8mmol)于四氫呋喃(140mL)中的混懸液中添加含2.5M正丁基鋰的己烷(7.35mL，18.4mmol)。將深紅色的溶液在0℃下攪拌1小時。然后在0℃下逐滴添加(4R)-4-甲酰基-2,2-二甲基-1,3-噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(來自Aldrich，3.01g，13.1mmol)于四氫呋喃(7.3mL)中的溶液。將紅色溶液升溫到室溫并攪拌12小時。以4:1(v/v)比例向反應混合物中添加己烷。混懸液經硅藻土過濾并且濃縮濾液。將所得殘余物通過快速層析純化(用含10％乙酸乙酯的己烷洗脫)以得到呈無色油狀的所需化合物(1.92g，64％)。

步驟2.[(1S)-1-(羥甲基)丙-2-烯-1-基]氨基甲酸叔丁酯

在0℃下向(4S)-2,2-二甲基-4-乙烯基-1,3-噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(1.90g，8.36mmol)于甲醇(83mL)中的溶液中添加對甲苯磺酸單水合物(0.80g，4.2mmol)。使混合物緩慢升溫到室溫過夜。將反應混合物用飽和NaHCO₃溶液稀釋，濃縮，并且接著用乙酸乙酯稀釋。將有機層用飽和NaHCO₃(2x)和鹽水洗滌，經Na₂SO₄干燥，過濾并濃縮以得到呈無色油狀的所需產物(1.187g，76％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.81(1H,m),5.25(2H,m),4.90(1H,m),4.25(1H,br s),3.67(2H,m),1.45(9H,s)ppm。

步驟3.[(1S)-1-({[1-(羥甲基)丙-2-烯-1-基]氧基}甲基)丙-2-烯-1-基]氨基甲酸叔丁酯

向燒瓶中裝入[(1S)-1-(羥甲基)丙-2-烯-1-基]氨基甲酸叔丁酯(0.401g，2.14mmol)、三(二苯亞甲基丙酮)二鈀(0)(59mg，0.064mmol)、N,N'-(1S,2S)-環己烷-1,2-二基雙[2-(二苯基膦基)-1-萘甲酰胺](150mg，0.19mmol)和4-二甲基氨基吡啶(78mg，0.64mmol)。將反應混合物用N₂凈化三次，并且接著依序添加二氯甲烷(21.3mL)和含1.0M三乙基硼烷的THF(130μL，0.13mmol)。在攪拌10分鐘之后，添加2-乙烯基環氧乙烷(0.150g，2.14mmol)并且將所得混合物攪拌過夜。將反應用二氯甲烷和飽和NaHCO₃溶液稀釋。將有機層分離并且經Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮。將粗殘余物用快速層析純化(用0％-50％乙酸乙酯/己烷洗脫)以得到所需產物(0.271g，49％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ5.85(1H,m),5.67(1H,m),5.84～5.17(4H,m),4.83(1H,m),4.30(1H,br s),3.83(1H,m),3.69(1H,dd,J＝4.5和6.9Hz),3.54(2H,m),3.36(1H,dd,J＝4.5和6.9Hz),1.45(9H,s)ppm。

步驟4.乙酸2-({(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁-3-烯-1-基}氧基)丁-3-烯-1-基酯

向[(1S)-1-({[1-(羥甲基)丙-2-烯-1-基]氧基}甲基)丙-2-烯-1-基]氨基甲酸叔丁酯(268mg，1.04mmol)于二氯甲烷(10mL)中的混合物中添加三乙胺(435μL，3.12mmol)。將混合物冷卻至0℃，且逐滴添加乙酰氯(150μL，2.1mmol)。在室溫下攪拌反應2小時，接著用水淬滅。濃縮有機層并且將所得殘余物在硅膠上純化(用20％乙酸乙酯/己烷洗脫)以得到所需產物(0.26g，85％)。C₁₀H₁₈NO₃(M-100+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝200.1；實測值：200.1。

步驟5.乙酸{(5S)-5-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5,6-二氫-2H-吡喃-2-基}甲酯

向500mL 2-頸圓底燒瓶中添加苯亞甲基(二氯)(1,3-二(三甲苯基)咪唑烷-2-亞-2-基)(三環己基正膦基)釕(38mg，0.044mmol)。在用氮氣凈化3次之后，依次添加二氯甲烷(無水，8mL)以及乙酸2-({(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁-3-烯-1-基}氧基)丁-3-烯-1-基酯(265mg，0.885mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌15小時。將混合物真空濃縮。將殘余物經由快速層析純化(用己烷至含25％EtOAc的己烷洗脫)以得到呈棕色油狀的所需產物(0.205g，85％)。C₉H₁₄NO₅(M+H-Bu+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝216.1；實測值：216.1。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ5.94(0.17H,m),5.84(0.83H,m),5.69(1H,m),4.89(0.13H,m),4.70(0.83H,m),4.25(1H,m),4.05(4H,m),3.56(0.13H,m),3.38(0.87H,m),2.04(2.49H,s),2.03(0.51H,m),1.38(9H,s)ppm(產物為反式異構體與順式異構體的約5:1混合物)。

步驟6.乙酸[(5S)-5-氨基-5,6-二氫-2H-吡喃-2-基]甲酯

向乙酸{(5S)-5-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5,6-二氫-2H-吡喃-2-基}甲酯(205mg，0.756mmol)于二氯甲烷(5.2mL)中的溶液中添加含4.0M氯化氫的二噁烷(1.5mL，6.0mmol)。將反應溶液在室溫下攪拌6小時。在減壓下去除溶劑以得到呈白色固體的所需產物。C₈H₁₄NO₃(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝172.1；實測值：172.1。

步驟7.乙酸{(5S)-5-[(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基]-5,6-二氫-2H-吡喃-2-基}甲酯

將7-氯-6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶(156mg，0.727mmol)、乙酸[(5S)-5-氨基-5,6-二氫-2H-吡喃-2-基]甲酯(129mg，0.754mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.26mL，1.5mmol)在異丙醇(1.7mL)中的混合物在90℃下加熱2小時。將反應混合物濃縮并使用快速層析純化以得到所需產物(0.21g，83％)。C₁₅H₁₆N₃O₅S(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝350.1；實測值：350.0。

步驟8.乙酸{(5S)-5-[(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基]四氫-2H-吡喃-2-基}甲酯

在室溫下使乙酸{(5S)-5-[(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基]-5,6-二氫-2H-吡喃-2-基}甲酯(210mg，0.600mmol)及10％鈀/碳(0.21g)于甲醇(4.0mL)中的混合物經受H₂氣球壓力2小時。過濾混合物，并且濃縮濾液并用快速層析純化(用含15％甲醇的二氯甲烷洗脫)以得到所需產物(145mg，75％)。C₁₅H₂₀N₃O₃S(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝322.1；實測值：322.0。

步驟9.(1R)-1-{1-[(3S)-6-(羥甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基}乙醇

在室溫下攪拌(2R)-2-羥基丙酰胺(131mg，1.47mmol)和三乙基氧鎓四氟硼酸鹽(263mg，1.38mmol)于THF(2mL)中的混合物2小時。去除溶劑并且將殘余物溶解于乙醇(0.85mL)中并添加至乙酸{(5S)-5-[(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基]四氫-2H-吡喃-2-基}甲酯(145mg，0.451mmol)于乙醇(3.1mL)中的混懸液中。在80℃下攪拌混合物1小時。將反應冷卻至室溫并且用水(1.0mL)稀釋。添加氫氧化鋰(32.4mg，1.35mmol)，并且攪拌混合物2小時。將反應混合物用甲醇稀釋并且用制備型LCMS(XBridge C18柱，用乙腈/含0.1％氫氧化銨的水的梯度在流速60mL/分鐘下洗脫)純化以得到呈白色固體狀的所需產物(95mg，63％)。C₁₆H₂₀N₃O₃S(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝334.1；實測值：334.0。

步驟10：4-甲基苯磺酸((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)甲酯和4-甲基苯磺酸((2S,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)甲酯

在0℃下向(1R)-1-{1-[(3S)-6-(羥甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-2-基}乙醇(100mg，0.300mmol)(先前步驟)于二氯甲烷(3.4mL)和吡啶(0.146mL，1.80mmol)中的溶液中添加對甲苯磺酰氯(57.2mg，0.300mmol)和4-二甲基氨基吡啶(1.8mg，0.015mmol)。將反應混合物升溫至室溫過夜。濃縮反應混合物，用甲醇稀釋，并且用制備型LCMS(XBridge C18柱，用乙腈/含有0.1％氫氧化銨的水的梯度在流速60mL/分鐘下洗脫)純化以得到兩個峰。在分析型HPLC(Waters SunFire C18，2.1x50mm，5μM；流速3mL/分鐘；注射體積2μL；在3分鐘內自2％至80％B的梯度下(A＝含0.025％TFA的水，B＝乙腈))上：第一峰(45.3mg，31％)滯留時間1.81分鐘，C₂₃H₂₆N₃O₅S₂(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝488.1；實測值：488.1。第二峰(8.5mg，5.8％)滯留時間1.88分鐘，C₂₃H₂₆N₃O₅S₂(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝488.1；實測值：488.1。

步驟11.((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈

在50℃下攪拌4-甲基苯磺酸((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)甲酯(來自先前步驟的第1峰，27mg，0.055mmol)和氰化鈉(4.5mg，0.092mmol)于二甲亞砜(0.4mL)中的混合物4小時。在冷卻之后，將混合物用甲醇稀釋并且用制備型LCMS(XBridge C18柱，用乙腈/含0.1％氫氧化銨的水的梯度在流速30mL/分鐘下洗脫)純化以得到所需產物(14.5mg,76％)。C₁₇H₁₉N₄O₂S(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝343.1；實測值：343.0。¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ9.51(1H,s),8.45(1H,d,J＝5.5Hz),7.97(1H,d,J＝5..5Hz),5.31(1H,m),5.20(1H,m),4.31(1H,m),4.23(1H,m),4.02(1H,m),2.96(1H,dd,J＝17.0和4.5Hz),2.85(1H,dd,J＝17.0和4.5Hz),2.66(1H,m),2.26(1H,m),2.09(1H,m),1.73(1H,m),1.69(3H,d,J＝6.5Hz)ppm。

實施例1a.((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈水合物

從乙腈(8mL)與水(4mL)的混合物中結晶來自實施例25的((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(52mg，0.15mmol)。收集的所得無色棱形晶體適于X-射線晶體結構分析。

晶體數據顯示：約0.520x0.180x0.100mm，斜方晶，P212121，Z＝4，T＝-100.℃，分子量＝359.42，密度＝1.430g/cm³，μ(Mo)＝0.22mm^-1。

數據收集在布魯克Bruker SMART APEX-II CCD系統上進行，MoKalpha輻射，標準聚焦管，陽極功率＝50kVx42mA，晶體到板的距離＝5.0cm，512x512像素/幀，光束中心＝(256.13，253.14)，總幀數＝1151，振蕩/幀＝0.50°，曝光/幀＝10.1秒/幀，SAINT整合，hkl最小值/最大值＝(-9、9、-15、15、-27、27)，數據輸入到shelx＝17025，唯一數據(unique data)＝3975，2-θ范圍＝3.92至55.72°，2-θ55.72的完整性＝99.80％，R(int-xl)＝0.0681，應用SADABS校正。

使用XS(Shelxtl)拆分結構，使用shelxtl軟件包細化，通過F²全矩陣最小平方實現細化，散射因子來自Int.Tab.Vol C表4.2.6.8及6.1.1.4，數據數目＝3975，約束數目＝0，參數數目＝235，數據/參數比率＝16.91，F²擬合優度＝1.04，R指數[I>4Σ(I)]R1＝0.0505，wR2＝0.1242，R指數(所有數據)R1＝0.0769，wR2＝0.1401，最大差異峰及孔＝0.724及細化flack參數＝-0.12(13)，所有CH氫原子都使用騎式模型細化。從差異圖得到OH氫且進行充分細化。

結果顯示不對稱單元含有如所示的一個分子及一個水，其中熱橢球體接近50％機率度。確認三個立體中心的每一個處的立體化學(如以上在化合物的名稱及結構中所指示)。細化至0.28(24)的flack參數指示對映異構設置正確。

實施例2.4-[3-(氰甲基)-3-(3',5'-二甲基-1H,1'H-4,4'-雙吡唑-1-基)氮雜環丁烷-1-基]-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺

步驟1：2,4,5-三氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺

向2,4,5-三氟乙酸(5.00g，28.4mmol)于乙腈(50mL)中的溶液中添加N,N-二甲基甲酰胺(40μL)，接著添加草酰氯(3.60mL，42.6mmol)。90分鐘后，在減壓下去除揮發性物質。將殘余物與乙腈(50mL)共同蒸發。然后將殘余物溶解于二氯甲烷(50mL)中。將此溶液逐滴添加至(2S)-1,1,1-三氟丙烷-2-胺鹽酸鹽(5.52g，36.9mmol)(來自Synquest，98％ee)于甲苯(100mL)和0.5M氫氧化鈉水溶液(142mL,71.0mmol)中的冷卻(冰浴)混合物中。添加后，將冰浴移開，并且使反應升溫至室溫。將反應攪拌過夜。分離有機層。將水層用二氯甲烷(50mL)萃取。合并的有機層用20％鹽水(75mL)和水(2x75mL)洗滌，經MgSO₄干燥，過濾并且在減壓下濃縮以提供所需產物(6.49g,84％)，其不經進一步純化直接用于下一步驟中。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.01(d,J＝7.6Hz,1H),7.92–7.50(m,2H),4.76(m,1H),1.31(d,J＝7.0Hz,3H)ppm。C₁₀H₈F₆NO(M+1)⁺的LCMS計算值：m/z＝272.0；實測值：272.0。

步驟2：2,5-二氟-4-(3-羥基氮雜環丁烷-1-基)-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺

將2,4,5-三氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺(6.39g，23.6mmol)、氮雜環丁烷-3-醇鹽酸鹽(3.19g，28.3mmol)和1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯(8.81mL，58.9mmol)于乙腈(25mL)中的混合物在80℃下攪拌2小時。將反應混合物用EtOAc(75mL)稀釋并用1N HCl(50mL)、1N NaHCO₃(60mL)、20％鹽水(50mL)和水(75mL)洗滌。將水層用EtOAc(100mL)萃取。將有機層合并，經MgSO₄干燥，過濾并在減壓下濃縮以得到所需產物(7.59g，91.8％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.38(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H),7.27(dd,J＝12.8,6.5Hz,1H),6.38(dd,J＝12.3,7.5Hz,1H),5.71(d,J＝6.4Hz,1H),4.74(dp,J＝15.3,7.6Hz,1H),4.62–4.46(m,1H),4.30–4.15(m,2H),3.71(m,2H),1.29(d,J＝7.1Hz,3H)ppm。C₁₃H₁₄F₅N₂O₂(M+1)⁺的LCMS計算值：m/z＝325.1；實測值：325.1。

步驟3：2,5-二氟-4-(3-氧代氮雜環丁烷-1-基)-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺

在室溫下向2,5-二氟-4-(3-羥基氮雜環丁烷-1-基)-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺(7.57g，23.3mmol)于二氯甲烷(93mL)中的溶液中添加二乙酸碘苯(9.40g，29.2mmol)和2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基自由基(1.82g，11.7mmol)(TEMPO)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物用EtOAc(100mL)稀釋，用0.5N NaHCO₃(2x80mL)、20％鹽水(100mL)和水(100mL)洗滌。將水層用乙酸乙酯(75mL)萃取。將有機層合并，經MgSO₄干燥，過濾并在減壓下濃縮。將殘余物通過快速層析在用含0％至5％乙酸乙酯的二氯甲烷洗脫的硅膠柱上純化以提供粗產物，將粗產物由MTBE(50mL)和庚烷(100mL)重結晶以得到呈無色固體的所需產物(5.44g，72％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.36(dd,J＝12.5,6.5Hz,1H),6.63(dd,J＝12.1,7.6Hz,1H),4.90(d,J＝2.1Hz,4H),4.86–4.68(m,1H),1.31(d,J＝7.1Hz,3H)ppm。C₁₃H₁₂F₅N₂O₂(M+1)⁺的LCMS計算值：m/z＝323.1；實測值：323.0。

步驟4：4-[3-(氰亞甲基)氮雜環丁烷-1-基]-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺

將氰甲基膦酸二乙酯(1.95mL，11.8mmol)逐滴添加至1.0M叔丁醇鉀于THF(11.8mL，11.8mmol)中的冷卻(冰浴)溶液中，將所述溶液用四氫呋喃(12mL)稀釋。將浴移除并且使反應升溫至室溫，并攪拌90分鐘。將反應溶液用冰浴再次冷卻。然后，將以上制備的溶液經12分鐘添加至2,5-二氟-4-(3-氧代氮雜環丁烷-1-基)-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺(4.00g，12.4mmol)于四氫呋喃(50mL)中的冷卻(冰浴)溶液中。攪拌反應混合物30分鐘。將冰浴移除并，并且將反應在室溫下攪拌過夜，然后通過添加20％鹽水(75mL)和乙酸乙酯(75mL)淬滅。分離有機層。將水層用乙酸乙酯(50mL)萃取。將合并的有機層經MgSO₄干燥，過濾并且在減壓下濃縮。將殘余物通過快速層析在用含乙酸乙酯的己烷(0％至30％)洗脫的硅膠柱上純化以產生所需產物(2.6g)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.59–8.37(m,1H),7.33(dd,J＝12.5,6.4Hz,1H),6.59(dd,J＝12.0,7.4Hz,1H),5.88(m,1H),4.94–4.75(m,4H),4.76(m,1H),1.31(d,J＝7.1Hz,3H)ppm。C₁₅H₁₃F₅N₃O(M+1)⁺的LCMS計算值：m/z＝346.1；實測值：346.1。

步驟5：4-{3-(氰甲基)-3-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺

將4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1H-吡唑(1.00g，5.15mmol)、4-[3-(氰亞甲基)氮雜環丁烷-1-基]-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺(1.78g，5.15mmol)和1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯(0.31mL，2.1mmol)于乙腈(20.2mL)中的混合物在50℃下加熱過夜。冷卻后，在減壓下去除溶劑。殘余物不經進一步純化即用于下一步驟中。C₂₄H₂₈BF₅N₅O₃(M+1)⁺的LCMS計算值：m/z＝540.2；實測值：540.1。

步驟6：4-[3-(氰甲基)-3-(3',5'-二甲基-1H,1'H-4,4'-雙吡唑-1-基)氮雜環丁烷-1-基]-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺

將4-{3-(氰甲基)-3-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1H-吡唑-1-基]氮雜環丁烷-1-基}-2,5-二氟-N-[(1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基]苯甲酰胺(329mg，0.610mmol)、4-溴代-3,5-二甲基-1H-吡唑(206mg，1.18mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(110mg，0.098mmol)和碳酸鈉(320mg，3.0mmol)于1,4-二噁烷(10mL)/水(5mL)中的混合物用氮氣凈化，并在110℃下攪拌1小時。將反應混合物用EtOAc稀釋，用水和鹽水洗滌，濃縮。殘余物首先用硅膠(依次用0％-100％EtOAc/己烷和10％甲醇/二氯甲烷洗脫)純化，且接著用制備型LCMS(XBridge C18柱，用乙腈/含有0.1％氫氧化銨的水的梯度在流速60mL/分鐘下洗脫)純化以得到所需產物(30mg，9.7％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.17(1H,s),8.45(1H,d,J＝8.0Hz),8.10(1H,s),7.70(1H,s),7.34(1H,m),6.61(1H,s),4.77(1H,m),4.62(2H,d,J＝9.0Hz),4.39(1H,d,J＝9.0Hz),3.64(2H,s),2.22(6H,s),1.31(6H,d,J＝7.0Hz)ppm.C₂₃H₂₃F₅N₇O(M+H)⁺的LCMS計算值：m/z＝508.2；實測值：508.0。

實施例A：體外JAK激酶測定

根據Park等,Analytical Biochemistry 1999,269,94-104中所述的以下體外測定測試本文化合物對JAK目標的抑制活性。使用桿狀病毒在昆蟲細胞中表達人JAK1(a.a.837-1142)、JAK2(a.a.828-1132)及JAK3(a.a.781-1124)的催化結構域且加以純化。通過測量生物素化肽的磷酸化來測定JAK1、JAK2或JAK3的催化活性。通過均相時間分辨熒光(homogenous time resolved fluorescence；HTRF)檢測磷酸化肽。在含有酶、ATP和500nM肽的50mM Tris(pH 7.8)緩沖液的40μL反應中測量化合物針對各激酶的IC₅₀s，所述緩沖液具有100mM NaCl、5mM DTT和0.1mg/mL(0.01％)BSA。對于1mM IC₅₀測量，反應中的ATP濃度為1mM。在室溫下進行反應1小時，并且接著用20μL含45mM EDTA、300nM SA-APC、6nM Eu-Py20的測定緩沖液(Perkin Elmer,Boston,MA)終止。與銪標記抗體的結合進行40分鐘并且在PHERA star盤讀取器(BMG,Cary,NC)上測量HTRF信號。通過在1mM ATP下在實施例A測定中測試化合物而獲得JAK1和/或JAK2抑制劑的數據。

實施例B：PI3Kδ閃爍親近測定

材料

[γ-³³P]ATP(10mCi/mL)購自Perkin-Elmer(Waltham,MA)。脂質激酶底物D(+)-sn-1,2-二-O-辛酰基甘油基、3-O-磷酸基連接的D-肌-磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸(PtdIns(4,5)P2)(PIP2)，CAS 204858-53-7購自Echelon Biosciences(Salt Lake City,UT)。PI3Kδ(p110δ/p85α)購自Millipore(Bedford,MA)。ATP、MgCl₂、DTT、EDTA、MOPS和CHAPS購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。麥胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin，WGA)YSi SPA閃爍珠粒購自GE healthcare life sciences(Piscataway,NJ)。

激酶反應在來自Thermo Fisher Scientific的聚苯乙烯384孔基質白色盤中以最終體積25μL進行。抑制劑首先在DMSO中連續稀釋，并且在添加其他反應組分之前添加至盤孔中。DMSO在測定中的最終濃度為0.5％。在室溫下在20mM MOPS(pH 6.7)、10mM MgCl₂、5mM DTT和0.03％CHAPS中進行PI3K測定。通過添加ATP起始反應，最終反應混合物由20μM PIP2、20μM ATP、0.2μCi[γ-³³P]ATP、4nM PI3Kδ組成。將反應孵育210分鐘，并且通過添加40μL懸浮在淬滅緩沖液：150mM磷酸鉀(pH 8.0)、20％甘油、25mM EDTA、400μM ATP中的SPA珠粒終止。SPA珠粒的最終濃度為1.0mg/mL。在密封盤之后，將盤在室溫下振蕩過夜并且在1800rpm下離心10分鐘，通過在Topcount(Perkin-Elmer)上進行閃爍計數來測定產物的放射性。通過使用GraphPad Prism 3.0軟件相對于抑制劑濃度的對數擬合對照活性百分比曲線來執行IC₅₀確定。通過在實施例B測定中測試化合物而獲得PI3Kδ抑制劑的數據。

實施例C：Pfeiffer淋巴瘤模型

方法：

雌性SCID小鼠(5至8周齡，Charles River Laboratories,Wilmington,MA)用含1×107個腫瘤細胞(Pfeiffer，ATCC#CRL-2632,Manassas,VA)和基質膠(BD Biosciences#354234)的0.2mL無菌生理鹽水接種。接種是在側腹上以皮下方式執行。在培養細胞接種之后3至6周收集腫瘤組織片段(約3mm×3mm)，并且代替細胞接種以皮下方式植入。使用鈍頭鑷以固體碎片形式植入組織片段。根據腫瘤尺寸，在腫瘤接種之后15至25天開始對攜帶腫瘤的小鼠進行治療。對動物進行揀選以使各組中的平均腫瘤體積大致相等。在治療第一天，所有組中的最小平均腫瘤體積為150mm3，并且各組由7個動物組成。通過口服(PO)向小鼠施用實驗治療劑實施例347。治療頻率為每天2次，持續最少14日以達成功效。使用數碼測徑規每周2至3次測量皮下腫瘤的尺寸。通過在2個維度中測量腫瘤以及利用等式：體積＝[長度×(寬度2)]/2來計算腫瘤體積；其中較大數值為長度，而較小數值為寬度。如果形成多個腫瘤，那么最終體積是服從同一等式的個體腫瘤的總和：例如2個腫瘤；體積＝{[L1×W1)2]/2}+{[L2×W2)2]/2}。對腫瘤生長的作用報道為腫瘤生長抑制百分比(％TGI)。TGI百分比用等式：(1-(Tx體積/對照體積))*100計算，其中對照體積為在既定日的媒介物或未治療的腫瘤體積，且Tx體積為在同日的任何治療組的腫瘤體積。使用ANOVA：單因子試驗來評估治療與媒介物對照之間的統計差異。

結果:

化合物32c(上表2)作為單一藥劑在彌漫性大B細胞淋巴瘤(NHL的亞型)的Pfeiffer人類腫瘤異種移植物模型中加以評價。在體外，Pfeiffer癌細胞顯示對實施例347的抗增殖作用敏感。因此，基于將腫瘤細胞皮下接種至免疫損害的SCID小鼠中來建立腫瘤模型，并且攜帶腫瘤的小鼠持續14日接受每日兩次口服劑量的在0.3、1、3或10mg/kg下的媒介物或化合物32c。隨著劑量增加，化合物32c治療使腫瘤生長抑制22％、24％、36％和58％(腫瘤生長抑制百分比)。

實施例D.蛋白質印跡分析

在下文的蛋白質印跡分析中使用下列材料和方法。將細胞(5百萬)溶解于300μl體積的裂解緩沖液中。通過離心收集可溶性級分。將25μl細胞溶解產物負載至Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠中，并進行電泳。將蛋白質轉移到硝化纖維素膜上，并用來自Cell Signaling Technology的的抗體針對下列蛋白質進行探測：磷酸-Stat3Y705、磷酸-Akt S473、pim1、pim2、pim3、c-myc、磷酸-p70S6K、磷酸-S6、磷酸-Bad S112和肌動蛋白。

實施例E：細胞系中IL6和IL10的水平

在多種DLBCL細胞系中觀察到高水平的IL6和IL10(圖1A)。IL6和IL10也顯示激活JAK/STAT信號傳導，其中在一組DLBCL細胞系中IL10是比IL6更強的JAK/STAT信號傳導激活物(圖1B)。高水平的IL6和IL10存在于DLBCL患者的血清中，并且與更短的無事件存活和更高的國際預后指數得分相關。

實施例F：IL10使Pfeiffer細胞對PI3Kδ抑制具有抗性并且可通過JAK1/2或JAK1阻斷逆轉

細胞增殖測定

將彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞以2000個細胞/孔接種在存在或不存在10ng/ml IL10的96孔培養板中。首先在DMSO中稀釋后，向這些細胞中添加化合物，接著在培養基中稀釋(4x濃度)。在具有5％CO₂的孵育箱中培養細胞3天。使用Cell titer-glow測定(Promega,Madison,WI)評估細胞增殖。細胞增殖測定首先在Pfeiffer細胞(生發中心B細胞(GCB)彌漫性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)細胞)和HBL-1細胞(活化B細胞樣(ABC)彌漫性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)細胞)中進行。

圖2A描繪Pfeiffer細胞中細胞增殖測定中的抑制％，作為具有媒介物(DMSO)、DMSO+IL10和DMSO+IL10+魯索利替尼(JAK1/JAK2抑制劑)的化合物28(PI3Kδ抑制劑)的濃度的函數。圖2B描繪Pfeiffer細胞中細胞增殖測定中的抑制％，作為具有媒介物(DMSO)、DMSO+IL10和DMSO+IL10+化合物7(選擇性JAK1抑制劑)的化合物28(PI3Kδ抑制劑)的濃度的函數。結果表明IL10使Pfeiffer細胞對PI3Kδ抑制具有抗性，但這種抗性可通過阻斷JAK1和/或JAK2信號傳導逆轉。因此，當PI3Kδ抑制劑與JAK1和/或JAK2抑制劑組合使用時對Pfeiffer細胞增殖具有協同作用。在無IL10的情況下也觀察到協同。使用此組合還觀察到凋亡的誘導。

使用魯索利替尼在HBL-1細胞中觀察到相似的結果。因此，圖3描繪HBL-1細胞中細胞增殖測定中的抑制％，作為具有媒介物(DMSO)、DMSO+IL10和DMSO+IL10+魯索利替尼(JAK1/JAK2抑制劑)的化合物28(PI3Kδ抑制劑)的濃度的函數。

實施例G：IL10誘導的Pim2表達被JAK1/2抑制劑阻斷

將Pfeiffer細胞在有或無IL10的情況下用媒介物(DMSO)、魯索利替尼(18424)、化合物28或化合物28和魯索利替尼(18424)處理24小時，并且接著經受蛋白質印記分析以探測下列蛋白質：磷酸-Stat3Y705、磷酸-Akt S473、Pim2、c-myc、磷酸-p70S6K、磷酸-S6、磷酸-Bad S112和肌動蛋白。圖4示出IL10誘導的Pim2表達被魯索利替尼(JAK1/JAK2抑制劑)阻斷。IL6和IL10通過Pim2的表達促進細胞存活，Pim2的表達依賴于JAK1的活性。圖4還示出在組合的化合物28和魯索利替尼處理存在下c-Myc和P-S6的協同減少。c-Myc蛋白的減少可能是組合處理的協同作用的原因。

實施例H：IL10誘導的Pim2表達被選擇性JAK1抑制劑阻斷

將Pfeiffer細胞在有或無IL10的情況下用媒介物(DMSO)、化合物7、化合物28或化合物28和化合物7處理24小時，并且接著經受蛋白質印記分析以探測下列蛋白質：磷酸-Stat3 Y705、磷酸-Akt S473、pim2、c-myc、磷酸-p70S6K、磷酸-S6、磷酸-Bad S112和肌動蛋白。圖5示出IL10誘導的Pim2表達被選擇性JAK1抑制劑(化合物7)阻斷。

實施例I：通過選擇性JAK1抑制劑增加PI3Kδ抑制劑的功效

為了測試IL-10對細胞生長的作用和對BCR途徑抑制的敏感性，將Pfeiffer細胞系用作DLBCL模型系統。Pfeiffer細胞是DLBCL的生發中心B細胞(GCB)亞型，已經顯示Pfeiffer細胞表達PI3Kδ，對PI3Kδ抑制敏感，并且響應于如上所示的多種細胞因子激活JAK/STAT途徑。在IL-10和1μM的化合物16存在或不存在下用多種濃度的化合物28處理Pfeiffer細胞3天，并且使用ATP讀出測量細胞生長(參見下表)。如圖6中所示，IL-10的存在使化合物28的功效改變約10倍(IC₅₀＝0.67μM，-IL-10；IC₅₀＝6.36μM，+IL-10)。JAK1抑制劑、化合物16的添加逆轉了此作用，以使得所述組合更有效約50倍。在此系統中，單獨JAK1抑制劑沒有作用(IC₅₀>1μM)。而且，如圖7中所示(示出在10％FBS+IL10中處理3天的Pfeiffer細胞的膜聯蛋白-V染色；化合物16在1μM下進行測試)，PI3Kδ的抑制與JAK1信號傳導一起導致凋亡增加，而單獨試劑都沒有顯著作用。

實施例J：組合的JAK1和PI3Kδ處理對STAT3磷酸化和pAKT抑制的作用

為了評估對下游信號傳導途徑的作用，將Pfeiffer細胞用化合物28+/-化合物16處理4小時，并且接著用IL-10刺激15分鐘。通過蛋白質印跡針對pAKT和pSTAT3分析提取物。如圖8中所示，AKT途徑在Pfeiffer細胞中持續性激活。PI3Kδ信號傳導的阻斷導致pAKT的完全抑制，而用JAK1抑制劑處理沒有作用。相比之下，化合物16導致STAT3磷酸化的抑制，而PI3Kδ抑制劑不能。阻斷兩種途徑需要兩種化合物的組合。

上文提及的所有專利、專利申請和期刊文章以引用的方式整體并入本文。