本發(fā)明涉及用于抑制哺乳動(dòng)物(包括人類)中的毛發(fā)生成的治療。具體說來，提供用于治療和預(yù)防不必要或過度毛發(fā)生長的醫(yī)學(xué)和美容用途的多肽組合物。

背景

不必要毛發(fā)生長是一種常見問題，尤其對婦女來說，并且最通常為種族背景或遺傳的結(jié)果。在一小部分婦女中，其可能由雄激素過度產(chǎn)生、對循環(huán)雄激素的敏感性增加或其它代謝和內(nèi)分泌病癥引起。大約22％的婦女由于胡須和下巴區(qū)域上存在不必要毛發(fā)生長而受到影響，并且這可為苦惱來源，導(dǎo)致焦慮、抑郁以及降低的生活質(zhì)量。

不必要毛發(fā)生長的潛在原因可變化。大多數(shù)為種族或遺傳；然而，必須排除雄激素過量的任何跡象，例如體毛增加、不規(guī)則月經(jīng)周期、痤瘡、脫發(fā)以及皮脂溢。

多囊卵巢綜合征(PCOS)為雄激素過量的最常見原因，并且70％-80％的具有雄激素過量的患者證明了多毛癥，不過這一跡象在亞洲血統(tǒng)的婦女中可能不太普遍。關(guān)于多毛癥存在強(qiáng)烈的家族性偏好，這主要因?yàn)檫@一群體中的潛在內(nèi)分泌病癥和調(diào)節(jié)毛發(fā)生長的發(fā)育的因素具有強(qiáng)烈的遺傳組分。

患者應(yīng)被適當(dāng)?shù)亟ㄗh關(guān)于毛發(fā)去除的可用治療方式。并無單一毛發(fā)去除方法適用于所有身體位置或患者，并且所采用的方法將取決于毛發(fā)生長的特征、區(qū)域和量，以及取決于患者的年齡、潛在疾病或病況和其個(gè)人偏好以及所選擇的治療的可能副作用。

當(dāng)然，也應(yīng)認(rèn)識到健康個(gè)體可能出于純粹美容原因希望抑制其身體的所選區(qū)域上的毛發(fā)生長。

用于去除過量毛發(fā)的治療選項(xiàng)有限并且可在有效性、不適程度以及成本方面變化。當(dāng)前用于去除這種不必要毛發(fā)的方法包括如拔毛、上蠟(包括糖形式)、脫毛劑、剃須以及家庭電蝕除毛的非處方方法?？稍卺t(yī)務(wù)室進(jìn)行的毛發(fā)去除方法包括激光去除和強(qiáng)脈沖光(IPL)。額外方式為抑制毛發(fā)生長的表面乳膏：依氟鳥氨酸13.9％乳膏(Shire Pharmaceuticals)。

這些方法在介于數(shù)天至數(shù)月范圍內(nèi)的再生長時(shí)間內(nèi)為暫時(shí)的。關(guān)于與PCOS有關(guān)的多毛癥，治療包括口服避孕藥和/或抗雄激素，如螺內(nèi)酯、醋酸環(huán)丙孕酮、氟他胺以及非那雄胺。

因此，需要適用于醫(yī)學(xué)和美容應(yīng)用的用于抑制毛發(fā)生長的新的治療。

發(fā)明概述

本發(fā)明的第一方面提供一種用于抑制哺乳動(dòng)物中的毛發(fā)生成的組合物，其包含：

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段或變體或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段或變體組成的多肽

VDTYDGDISVVYGLR SEQ ID NO:1[“FOL-005”]

其保持對哺乳動(dòng)物毛發(fā)生成的抑制活性；和

(b)藥學(xué)上可接受和/或美容學(xué)上可接受的賦形劑、載體、佐劑或稀釋劑。

其中所述多肽在5個(gè)與50個(gè)氨基酸長之間

存在于本發(fā)明組合物中的多肽能夠抑制哺乳動(dòng)物中的毛發(fā)生成。

“抑制毛發(fā)生成”意指所述組合物能夠降低、削弱、預(yù)防或消除施用所述組合物的哺乳動(dòng)物中的以下毛發(fā)生成參數(shù)中的一個(gè)或多個(gè)：

(a)來自現(xiàn)有毛囊的個(gè)別毛發(fā)的生長；和/或

(b)來自現(xiàn)有毛囊的個(gè)別毛發(fā)的厚度；和/或

(c)現(xiàn)有毛囊的數(shù)目和/或密度；和/或

(d)新的毛囊的產(chǎn)生；和/或

(e)毛囊的毛發(fā)生長期的持續(xù)時(shí)間；和/或

(f)現(xiàn)有毛囊的色素沉著。

應(yīng)了解，所述抑制作用可相對于在本發(fā)明組合物不存在的情況下哺乳動(dòng)物中的毛發(fā)生成為完全或部分的。例如，所述組合物可減慢但不會(huì)完全地阻止現(xiàn)有毛囊的毛發(fā)生長。

有利的是，所述組合物能夠體內(nèi)抑制毛發(fā)的產(chǎn)生。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物能夠抑制人類毛發(fā)的生長。

在另一實(shí)施方案中，所述組合物能夠抑制健康皮膚的毛發(fā)生成。

在另一實(shí)施方案中，所述組合物能夠抑制頭皮上的毛發(fā)生成。

如上文詳述，本發(fā)明組合物對毛發(fā)生成的抑制可通過對現(xiàn)有毛囊的抑制效應(yīng)和/或通過抑制新的毛囊的形成來介導(dǎo)。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽能夠通過誘導(dǎo)以下來抑制現(xiàn)有毛囊：

(a)毛囊中毛發(fā)生長期的持續(xù)時(shí)間的降低(例如，通過誘導(dǎo)毛發(fā)生長期至退行期變化)；和/或

(b)毛囊中所述退行期的持續(xù)時(shí)間的增加；和/或

(c)毛囊中休止期的持續(xù)時(shí)間的增加。

例如，多肽可能夠通過誘導(dǎo)現(xiàn)有毛囊中從毛發(fā)生長期至退行期和/或休止期的轉(zhuǎn)變來抑制現(xiàn)有毛囊，因此終止所述毛囊的活性毛發(fā)生長)。

本發(fā)明組合物的多肽組分與天然存在的骨橋蛋白的子區(qū)共享氨基酸序列相似性。因此，至少在一些實(shí)施方案中，活性多肽組分可被視為天然存在的骨橋蛋白的活性片段或如片段的變體(即，所述多肽包含對應(yīng)于天然存在的骨橋蛋白的片段的修飾(例如突變)形式的氨基酸序列的氨基酸序列)。

骨橋蛋白還稱為骨唾液酸糖蛋白I(BSP-1或BNSP)、早期T-淋巴細(xì)胞活化(ETA-1)、分泌磷蛋白1(SPP1)、2ar和立克次氏體抵抗(Ric)，是在數(shù)種哺乳動(dòng)物物種中保守的基因產(chǎn)物。

該基因具有七種外顯子，跨5千堿基長度并且在人類中，其位于染色體4區(qū)13(4q13)的長臂上。蛋白由約300個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成并且富含酸性殘基：30-36％為天冬氨酸或谷氨酸。骨橋蛋白具有約30個(gè)附接的碳水化合物殘基，包括10個(gè)唾液酸殘基，該碳水化合物殘基在高爾基體中的翻譯后修飾期間附接于所述蛋白。

骨橋蛋白最初作為礦化骨基質(zhì)上的骨錨定破骨細(xì)胞中的新穎唾液酸糖蛋白被發(fā)現(xiàn)(Franzen和Heinegard,1985,Biochem.J.232(3)715-24)。名稱骨橋蛋白來自骨中(骨-)蛋白的存在和其在骨細(xì)胞與礦物相之間形成橋(橋-)的能力。序列分析和后續(xù)結(jié)構(gòu)研究顯示骨橋蛋白是由大約十個(gè)天冬氨酸殘基的高度酸性區(qū)域構(gòu)成的32kDa糖蛋白，該殘基被認(rèn)為介導(dǎo)骨橋蛋白的礦物結(jié)合特性。此外，在骨橋蛋白分子的中間部分中，還存在通過R-G-D序列介導(dǎo)的細(xì)胞附著結(jié)構(gòu)域(Oldberg等人,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(23):8819-23，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)。

骨橋蛋白在成骨細(xì)胞中并且在數(shù)種上皮細(xì)胞類型中組成性地表達(dá)，導(dǎo)致骨橋蛋白被分泌至多種體液中。骨是其中沉積骨橋蛋白并且可大量回收骨橋蛋白的唯一組織類型。骨橋蛋白的表達(dá)也可在血管平滑肌細(xì)胞中，在不同癌細(xì)胞類型中并且在發(fā)炎細(xì)胞(尤其巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)中誘導(dǎo)。數(shù)種重要的細(xì)胞功能已經(jīng)歸因于骨橋蛋白，如粘著、增殖、遷移、抗細(xì)胞凋亡以及化學(xué)吸引。這些功能中的一些被認(rèn)為經(jīng)由RGD細(xì)胞粘著結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，該結(jié)構(gòu)域與不同整合素，主要與αvβ3以及αvβ1和αvβ5相互作用(關(guān)于回顧，參看Scatena等人,2007,Arterio.Thromb.Vasc.Biol.27:2302-2309)。

近年來，骨橋蛋白已經(jīng)作為能夠調(diào)節(jié)發(fā)炎和免疫反應(yīng)中所牽涉的數(shù)種細(xì)胞類型的有效細(xì)胞因子出現(xiàn)。歸因于骨橋蛋白的功能的廣泛范圍已經(jīng)使人費(fèi)解并且無法全部由單細(xì)胞結(jié)合RGD序列解釋。當(dāng)骨橋蛋白中十一個(gè)氨基酸的肽R¹⁴⁵-G-D-S-L-A-Y-G-L-R-S¹⁵⁵(SEQ ID NO:135)(對應(yīng)于UniProt碼P10923的氨基酸144至154)得到鑒定并且后來進(jìn)行功能映射時(shí)，該解釋成立。除了介導(dǎo)接合至αvβ3整合素的已知R¹⁴⁵-G-D¹⁴⁷位點(diǎn)以外，還發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白分子中的兩個(gè)額外基本區(qū)域，即高度特異性凝血酶裂解位點(diǎn)(即R¹⁵⁴-S¹⁵⁵)，和隱藏整合素結(jié)合位點(diǎn)(即S¹⁴⁸-L-A-Y-G-L-R¹⁵⁴(SEQ ID NO:136))，天氣隱藏整合素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合于α9β1整合素(參看Scatena等人，同上)。也已經(jīng)鑒定關(guān)于α4β1的額外結(jié)合位點(diǎn)(參看Scatena等人，同上)。

天然存在的骨橋蛋白典型地為大約300個(gè)氨基酸長。然而，本發(fā)明組合物的多肽組分的長度顯著較短，僅為5至50個(gè)氨基酸。

因此，所述多肽小于50個(gè)氨基酸長，例如小于35、30、28、26、24、22、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個(gè)氨基酸長。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在5個(gè)與30個(gè)氨基酸長之間，例如在5個(gè)與20個(gè)氨基酸長之間、在5個(gè)與20個(gè)氨基酸長之間、在8個(gè)與20個(gè)氨基酸長之間、在8個(gè)與16個(gè)氨基酸長之間或在10個(gè)與15個(gè)氨基酸長之間。

如本文所用的術(shù)語‘氨基酸’包括標(biāo)準(zhǔn)二十種遺傳編碼氨基酸和其呈‘D’形式的對應(yīng)立體異構(gòu)體(如與天然‘L’形式相比)、ω-氨基酸和其它天然存在的氨基酸、非常規(guī)氨基酸(例如α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸等)以及化學(xué)衍生化氨基酸(參看下文)。

當(dāng)特定地列舉氨基酸，如‘丙氨酸’或‘Ala’或‘A’時(shí)，除非另外明確陳述，否則所述術(shù)語是指L-丙氨酸和D-丙氨酸。其它非常規(guī)氨基酸也可為用于本發(fā)明多肽的合適組分，只要所述多肽保持所需的功能特性。關(guān)于所示的多肽，各編碼氨基酸殘基適當(dāng)時(shí)由單字母標(biāo)識表示，對應(yīng)于常規(guī)氨基酸的俗名。

根據(jù)慣例，本文所公開的氨基酸序列沿N端至C端方向提供。

典型地，本發(fā)明組合物中所用的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸組成。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的多肽組分由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。

在一替代實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的多肽組分由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成。

VDTYDGDISVVYGLS SEQ ID NO:2

在另一實(shí)施方案中，所述多肽可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列中保持(至少部分地)對毛發(fā)生成的抑制活性的片段或由所述片段組成。

“片段”包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少5個(gè)相鄰氨基酸，例如SEQ ID NO：1的至少6、7、8、9、10、11、12、13或14個(gè)相鄰氨基酸。因此，所述片段可為14個(gè)或更少氨基酸長，例如13、12、11、10、9、8、7、6或5個(gè)氨基酸長

在示例性實(shí)施方案中，所述片段包含根據(jù)SEQ ID NO：3至65中任一個(gè)的氨基酸序列或由根據(jù)SEQ ID NO：3至65中任一個(gè)的氨基酸序列組成

(a)14個(gè)氨基酸的肽：

VDTYDGDISVVYGL SEQ ID NO：3

DTYDGDISVVYGLR SEQ ID NO：4

TYDGDISVVYGLRS SEQ ID NO：5

(b)13個(gè)氨基酸的肽：

(c)12個(gè)氨基酸的肽：

(d)11個(gè)氨基酸的肽：

(e)10個(gè)氨基酸的肽：

(f)9個(gè)氨基酸的肽：

(g)8個(gè)氨基酸的肽：

(h)7個(gè)氨基酸的肽：

(i)6個(gè)氨基酸的肽：

(j)5個(gè)氨基酸的肽：

例如，所述片段可包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列或由SEQ ID NO：26的氨基酸序列組成。

或者，本發(fā)明組合物可包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的變體或其片段或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的變體或其片段組成，其保持(至少部分地)對毛發(fā)生成的抑制活性。

“變體”意指所述多肽并未與SEQ ID NO：1共享100％氨基酸序列同一性，即SEQ ID NO：1的一個(gè)或多個(gè)氨基酸必定突變。例如，所述多肽可包含與SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％同一性、更優(yōu)選地與所述序列具有至少60％、70％或80％或85％或90％同一性并且最優(yōu)選地與所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。

百分比同一性可通過所屬領(lǐng)域中眾所周知的方法，例如在Expasy實(shí)驗(yàn)室位點(diǎn)

(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)使用LALIGN程序(Huang和Miller,Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357)使用全局比對選項(xiàng)計(jì)分矩陣BLOSUM62、開放間隙罰分–14、延伸間隙罰分–4作為參數(shù)來確定。

或者，兩種多肽之間的百分比序列同一性可使用合適的計(jì)算機(jī)程序，例如威斯康星大學(xué)遺傳計(jì)算小組的GAP程序來確定并且應(yīng)了解百分比同一性是相對于其序列已經(jīng)進(jìn)行最佳比對的多肽來計(jì)算。

“突變”意指在規(guī)定位置處的氨基酸與根據(jù)SEQ ID NO:1的多肽中的氨基酸相比發(fā)生改變。例如，在規(guī)定位置處的氨基酸可缺失、被取代或可為一種或多種氨基酸的插入/添加位點(diǎn)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，取代可為保守或非保守的。

或者或另外，在規(guī)定位置處的氨基酸可進(jìn)行化學(xué)修飾(衍生化)；參看下文。

在一個(gè)實(shí)施方案中，變體多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段組成，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被保守地取代。“保守地取代”意指一種氨基酸用具有相似特性(大小、疏水性等)的另一氨基酸取代，使得所述多肽的功能未顯著改變。因此，“保守取代”為預(yù)期組合，如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，變體多肽可包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列內(nèi)的N端和/或C端和/或內(nèi)部插入的一個(gè)或多個(gè)額外氨基酸。例如，所述多肽可包含在N端和/或C端和/或內(nèi)部的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)額外氨基酸或由在N端和/或C端和/或內(nèi)部的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)額外氨基酸組成。所述變體多肽可為天然存在或非天然存在的。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述額外氨基酸為來自野生型人類骨橋蛋白的相應(yīng)位置的氨基酸，所述野生型人類骨橋蛋白即GenBank:AAA59974.1[SEQ ID NO:66](其中與SEQ ID NO:1具有最高序列相似性的區(qū)域以斜體形式加下劃線)：

MRIAVICFCLLGITCAIPVKQADSGSSEEKQLYNKYPDAVATWLNPDPSQKQNLLAPQTLPSKSNESHDHMDDMDDEDDDDHVDSQDSIDSNDSDDVDDTDDSHQSDESHHSDESDELVTDFPTDLPATEVFTPVVPTSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHMESEELNGAYKAIPVAQDLNAPSDWDSRGKDSYETSQLDDQSAETHSHKQSRLYKRKANDESNEHSDVIDSQELSKVSREFHSHEFHSHEDMLVVDPKSKEEDKHLKFRISHELDSASSEVN

SEQ ID NO:66

所述野生型人類骨橋蛋白的“相應(yīng)位置”意指所述額外氨基酸與存在于以上野生型人類骨橋蛋白中的相等位置中的那些相同(如果設(shè)想SEQ ID NO:1的氨基酸序列置換SEQ ID NO:66中以斜體形式加下劃線的序列)。例如，所述多肽可包含在SEQ ID NO:1的氨基端的三個(gè)氨基酸VPT-和/或在SEQ ID NO:1的羧基端的五個(gè)氨基酸-SKSKK。

在另一實(shí)施方案中，變體多肽序列可包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或其片段或變體或由SEQ ID NO:67的氨基酸序列或其片段或變體組成

VDTYDGRGDSVVYGLR SEQ ID NO:67

合適的片段可由SEQ ID NO:67的15個(gè)或更少的連續(xù)氨基酸，例如SEQ ID NO:67的14、13、12、11、10、9、8、7、6或5個(gè)氨基酸連續(xù)氨基酸組成。

同樣，合適變體(如上文所定義)可包含與SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少50％同一性、更優(yōu)選地與所述序列具有至少60％、70％或80％或85％或90％同一性并且最優(yōu)選地與所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或其片段或由SEQ ID NO:67的氨基酸序列或其片段組成，其中所述RGD序列被失活。

通常發(fā)現(xiàn)于天然存在的骨橋蛋白中的活性三肽序列“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”可通過多種不同策略被失活。在一個(gè)實(shí)施方案中，RGD結(jié)構(gòu)域在所述多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處突變，使得其相對于天然存在的骨橋蛋白含有一個(gè)或多個(gè)缺失、取代和/或添加或其組合。例如，RGD結(jié)構(gòu)域可至少部分地缺失，使得精氨酸和/或甘氨酸和/或天冬氨酸殘基不存在。

或者或另外，RGD結(jié)構(gòu)域可在一個(gè)或多個(gè)氨基酸處被取代。例如，精氨酸和/或甘氨酸和/或天冬氨酸殘基可用另一氨基酸取代。該取代可為保守或非保守的。

同樣，RGD結(jié)構(gòu)域可通過取代和缺失的組合被失活，該組合包括：

(a)精氨酸殘基的取代和甘氨酸和天冬氨酸殘基的缺失；

(b)精氨酸和甘氨酸殘基的取代和天冬氨酸殘基的缺失(例如，–RGD-三肽可用二肽序列-DI-置換)；

(c)精氨酸和天冬氨酸殘基的取代和甘氨酸殘基的缺失；或

(d)精氨酸和天冬氨酸殘基的缺失和甘氨酸殘基的取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，三肽–RGD-序列由二肽-DI-序列置換。

不希望受理論束縛，相信所述RGD序列的被失活可導(dǎo)致骨橋蛋白多肽(相對于相應(yīng)的天然存在的骨橋蛋白)的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致新的位點(diǎn)產(chǎn)生/暴露于周圍環(huán)境。

本發(fā)明組合物的上文定義的多肽組分源于人類骨橋蛋白的氨基酸序列和其突變變體。然而，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解所述多肽或者可為SEQ ID NO:1的氨基酸序列的物種同系物(例如，來自小鼠、牛、豬、兔、大鼠等的同系物)。

SEQ ID NO:1的所述物種同系物的氨基酸序列可由下式表示：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-I-X10-X11-X12-Y-G-X15-X16-X17

SEQ ID NO:68

其中

X1為V、E、G或K；

X2為D、E、S或P；

X3為任何氨基酸(例如T、V、P、A或L)；

X4為Y、P、N或A；

X5為D、N或E；

X6為G或I；

X8為G或不存在；

X10為S或E；

X11為V或L；

X12為V、A或T；

X15為L或I；

X16為R或K；以及

X17為R、K或不存在。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，變體多肽可包含在氨基酸序列SEQ ID NO:68內(nèi)的N端和/或C端和/或內(nèi)部添加的一個(gè)或多個(gè)額外氨基酸。例如，所述多肽可包含在N端和/或C端和/或內(nèi)部的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)額外氨基酸或由在N端和/或C端和/或內(nèi)部的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)額外氨基酸組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述額外氨基酸為來自野生型骨橋蛋白(即，來自人類、小鼠、牛、豬、兔、大鼠等)的相應(yīng)位置的氨基酸。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽為鼠類同系物，其包含SEQID NO:69或70的氨基酸序列或其片段或變體或由SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列或其片段或變體組成：

VDVPNGDISLAYGLR SEQ ID NO:69

DVPNGDISLAYGLRS SEQ ID NO:70

合適的片段可由SEQ ID NO:69或70的14個(gè)或更少的連續(xù)氨基酸，例如SEQ ID NO:69或70的13、12、11、10、9、8、7、6或5個(gè)氨基酸連續(xù)氨基酸組成。

例如，所述片段可包含根據(jù)SEQ ID NO:71至133中任一個(gè)的氨基酸序列或由根據(jù)SEQ ID NO:71至133中任一個(gè)的氨基酸序列組成：

(a)14個(gè)氨基酸的肽：

VDVPNGDISLAYGL SEQ ID NO:71

DVPNGDISLAYGLR SEQ ID NO:72

VPNGDISLAYGLRS SEQ ID NO:73

(b)13個(gè)氨基酸的肽：

(c)12個(gè)氨基酸的肽：

(d)11個(gè)氨基酸的肽：

(e)10個(gè)氨基酸的肽：

(f)9個(gè)氨基酸的肽：

(g)8個(gè)氨基酸的肽：

(h)7個(gè)氨基酸的肽：

(i)6個(gè)氨基酸的肽：

(j)5個(gè)氨基酸的肽：

在實(shí)施方案中，所述片段包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或由SEQ ID NO:94的氨基酸序列組成。

同樣，所述多肽可包含SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列的變體或其片段或由SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列的變體或其片段組成。

合適變體(如上文所定義)可包含與SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列具有至少50％同一性、更優(yōu)選地與所述序列具有至少60％、70％或80％或85％或90％同一性并且最優(yōu)選地與所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。

所述變體可包含SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列或其片段或由SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列或其片段組成，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被保守地取代。

任選地，所述多肽可包含在SEQ ID NO:69或70的氨基酸序列內(nèi)的N端和/或C端和/或內(nèi)部插入的一個(gè)或多個(gè)額外氨基酸或由所述一個(gè)或多個(gè)額外氨基酸組成。例如，所述多肽可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)額外氨基酸或由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)額外氨基酸組成，所述額外氨基酸可來自野生型鼠類骨橋蛋白的相應(yīng)位置，所述野生型鼠類骨橋蛋白即NCBI參考序列：NP_001191162.1[SEQ ID NO:134](其中與SEQ ID NO:68具有最高序列相似性的區(qū)域以斜體形式加下劃線)：

MRLAVICFCLFGIASSLPVKVTDSGSSEEKLYSLHPDPIATWLVPDPSQKQNLLAPQNAVSSEEKDDFKQETLPSNSNESHDHMDDDDDDDDDDGDHAESEDSVDSDESDESHHSDESDETVTASTQADTFTPIVPTSKSRSFQVSDEQYPDATDEDLTSHMKSGESKESLDVIPVAQLLSMPSDQDNNGKGSHESSQLDEPSLETHRLEHSKESQESADQSDVIDSQASSKASLEHQSHKFHSHKDKLVLDPKSKEDDRYLKFRISHELESSSSEVN SEQ ID NO:134

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列或其片段或變體或由SEQ ID NO:135的氨基酸序列或其片段或變體組成

VDVPNGRGDSLAYGLR SEQ ID NO:135

合適的片段可由SEQ ID NO:135的15個(gè)或更少的連續(xù)氨基酸，例如SEQ ID NO:135的14、13、12、11、10、9、8、7、6或5個(gè)氨基酸連續(xù)氨基酸組成。

同樣，合適變體(如上文所定義)可包含與SEQ ID NO:135的氨基酸序列具有至少50％同一性、更優(yōu)選地與所述序列具有至少60％、70％或80％或85％或90％同一性并且最優(yōu)選地與所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變體包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列或其片段或由SEQ ID NO:135的氨基酸序列或其片段組成，其中所述RGD序列被失活。

在本發(fā)明組合物的另一實(shí)施方案中，所述多肽包含串聯(lián)重復(fù)序列或由串聯(lián)重復(fù)序列組成。

因此，所述串聯(lián)重復(fù)序列可包含SEQ ID NO:1至65中任一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1至65中任一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列組成(例如，所述串聯(lián)重復(fù)序列可包含SEQ ID NO:1或26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1或26的氨基酸序列組成)。

或者，所述串聯(lián)重復(fù)序列可包含SEQ ID NO:69至133中任一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列或由SEQ ID NO:69至133中任一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列組成(例如，所述串聯(lián)重復(fù)序列可包含SEQ ID NO:69和/或94的氨基酸序列或由SEQ ID NO:69和/或94的氨基酸序列組成)。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明組合物的多肽組分可在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處進(jìn)行修飾或衍生化。

一個(gè)或多個(gè)氨基酸的化學(xué)衍生物可通過與功能性側(cè)基反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。所述衍生化分子包括例如其中自由氨基已經(jīng)衍生化以形成胺鹽酸鹽、對甲苯磺酰基、羧基苯甲酰氧基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。自由羧基可衍生化以形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯和酰肼。自由羥基可衍生化以形成O-?；騉-烷基衍生物。還包括含有二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽作為化學(xué)衍生物。例如：4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸可取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸并且鳥氨酸可取代賴氨酸。衍生物還包括含有一種或多種添加或缺失的肽，只要維持必要活性。其它包括的修飾為酰胺化、氨基端?；?例如乙?；驇€基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如使用氨或甲胺)和類似的末端修飾。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)一步了解，肽模擬物化合物也可適用，其模擬上文詳述的多肽的構(gòu)象和所需特征。因此，‘多肽’包括具有SEQ ID NO:1的多肽的毛發(fā)生長抑制活性的肽模擬物化合物。

例如，本發(fā)明的多肽不僅包括其中氨基酸殘基通過肽(-CO-NH-)鍵接合的分子，而且包括其中所述肽鍵倒轉(zhuǎn)的分子。此逆轉(zhuǎn)-反向肽模擬物可使用所屬領(lǐng)域中已知的方法，例如Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237(其以引用的方式并入本文)中所述的那些制得。這種方法涉及制得含有涉及骨架而非側(cè)鏈的定向的變化的偽肽。含有NH-CO鍵而非CO-NH肽鍵的逆轉(zhuǎn)-反向肽更加抵抗蛋白水解。或者，本發(fā)明的多肽可為其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基通過代替常規(guī)酰胺鍵的-y(CH₂NH)-鍵鍵聯(lián)的肽模擬物化合物。

在另一替代方案中，所述肽鍵可分配于整體，限制條件是使用在所述氨基酸殘基的碳原子之間保持間距的適當(dāng)連接體部分；所述連接體部分可有利地具有與肽鍵大致相同的電荷分布和大致相同的平面性。

應(yīng)了解，所述多肽可便利地在其N或C端封端以便幫助降低對外蛋白水解消化的易感性。

如D-氨基酸和N-甲基氨基酸的多種未編碼或經(jīng)過修飾的氨基酸也已經(jīng)用于修飾哺乳動(dòng)物多肽。另外，推測的生物活性構(gòu)象可通過共價(jià)修飾，如環(huán)化或通過并入內(nèi)酰胺或其它類型的橋而穩(wěn)定化，例如參看Veber等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2636和Thursell等人,1983,Biochem.Biophys.Res.Comm.111:166，其以引用的方式并入本文。

多種合成策略中的常見主題是將一些環(huán)狀部分引入基于肽的構(gòu)架中。所述環(huán)狀部分限制肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)象空間并且這頻繁地導(dǎo)致所述肽對特定生物受體的特異性增加。這種策略的附加優(yōu)勢是將環(huán)狀部分引入肽中也可導(dǎo)致所述肽對細(xì)胞肽酶的敏感性減弱。

因此，本發(fā)明的多肽可包含末端半胱氨酸氨基酸。所述多肽可通過所述末端半胱氨酸氨基酸中硫醇鹽基團(tuán)的二硫鍵形成以雜環(huán)形式存在或通過所述末端胺基酸之間的酰胺肽鍵形成以純形式存在。如上文所指示，通過N端和C端區(qū)半胱氨酸之間的二硫鍵或酰胺鍵環(huán)化小肽可通過降低蛋白水解并且增加結(jié)構(gòu)的剛性而回避有時(shí)用線性肽觀察到的特異性和半衰期問題，由此可產(chǎn)生較高特異性化合物。通過二硫鍵環(huán)化的多肽具有自由氨基和羧基端，所述自由氨基和羧基端仍可易感蛋白水解降解，而通過在N端胺與C端羧基之間形成酰胺鍵環(huán)化的肽因此不再含有自由氨基或羧基端。因此，本發(fā)明的肽可通過C-N鍵或二硫鍵鍵聯(lián)。

本發(fā)明不以任何方式受肽的環(huán)化方法限制，但涵蓋可通過任何合適的合成方法實(shí)現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽。因此，雜鍵可包括但不限于經(jīng)由二硫橋、亞烷基橋或硫橋形成。環(huán)狀純肽和環(huán)狀雜肽的合成方法(包括二硫橋、硫橋和亞烷基橋)公開于以引用的方式并入本文的US 5,643,872中。環(huán)化方法的其它實(shí)例包括通過點(diǎn)擊化學(xué)、環(huán)氧化物、醛-胺反應(yīng)環(huán)化，以及以引用的方式并入本文的US 6,008,058中公開的方法。

眾所周知，所述末端修飾適用于降低蛋白酶消化的易感性并且因此適用于延長溶液中、尤其其中可存在蛋白酶的生物流體中所述肽的半衰期。多肽環(huán)化也由于通過環(huán)化形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并且鑒于關(guān)于環(huán)肽所觀察到的生物活性為適用的修飾。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一方面的多肽為環(huán)狀。

然而，在一替代實(shí)施方案中，所述多肽為線性。

然而，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含通過PEG化、酰胺化、酯化、?；⒁阴；?或烷基化修飾或衍生化的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，所述多肽可在一個(gè)或多個(gè)氨基酸處糖基化。例如，所述多肽可保持相應(yīng)(‘親本’)骨橋蛋白的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，碳水化合物基團(tuán)可附接于所述位點(diǎn)。

在另一實(shí)施方案中，所述多肽包含例如SEQ ID NO:1、26、69或94的氨基酸序列或其片段或變體的融合物或由例如SEQ ID NO:1、26、69或94的氨基酸序列或其片段或變體的融合物組成。

例如，所述多肽可包含SEQ ID NO:1或26的氨基酸序列的融合物

多肽的‘融合物’包括對應(yīng)于例如融合于任何其它多肽的SEQ ID NO:1或26(或其片段或變體)的氨基酸序列。例如，所述多肽可融合于如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或蛋白A的多肽以便促進(jìn)所述多肽的純化。所述融合物的實(shí)例是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。同樣，所述多肽可融合于如His6的寡聚組氨酸標(biāo)簽，或通過抗體識別的表位，如眾所周知的Myc標(biāo)簽表位。所述多肽的任何變體或衍生物的融合物也包括于本發(fā)明的范圍中。

所述融合物可包含在本發(fā)明的所述多肽上賦予所需特征的另一部分；例如，所述部分可適用于增強(qiáng)或延長毛發(fā)生長抑制效應(yīng)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合物包含人類血清白蛋白或相似蛋白(如US 2009/0005312中所公開，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)。

或者，融合的部分可為能夠促進(jìn)所述多肽的細(xì)胞攝取的親脂性分子或多肽結(jié)構(gòu)域，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。

適用于本發(fā)明組合物中的多肽可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的體外基于細(xì)胞的表達(dá)方法制得(例如參看Green和Sambrook,2012,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第四版,Cold Spring Harbor,New York，所述文獻(xiàn)中的相關(guān)公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)。欲使用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的選擇可取決于多種因素。例如，如果所述多肽欲糖基化，那么將需要哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。

合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可在市面上購自多種來源。

或者，所述多肽可通過已知方式，如液相和固相合成(例如t-Boc固相肽合成和BOP-SPPS)合成。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明還包括上述多肽的藥學(xué)上和/或美容學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽的用途。用于制備適用于本發(fā)明的上述堿化合物的藥學(xué)上和/或美容學(xué)上可接受的酸加成鹽的酸為形成無毒酸加成鹽的那些，所述鹽即含有藥學(xué)上和/或美容學(xué)上可接受的陰離子的鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、酒石酸氫鹽、丁二酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、糖酸鹽、苯甲酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽[即1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3萘甲酸鹽)]等。

藥學(xué)上和/或美容學(xué)上可接受的堿加成鹽也可用于制造所述多肽的藥學(xué)上和/或美容學(xué)上可接受的鹽形式?？捎米髦苽浔举|(zhì)上呈酸性的本發(fā)明化合物的藥學(xué)上和/或美容學(xué)上可接受的堿鹽的試劑的化學(xué)堿為與所述化合物形成無毒堿鹽的那些。所述無毒堿鹽包括但不限于源于所述藥學(xué)上和/或美容學(xué)上可接受的陽離子(如堿金屬陽離子(例如鉀和鈉)和堿土金屬陽離子(例如鈣和鎂))的那些、銨或水溶性胺加成鹽(如N-甲基葡糖胺-(甲葡胺))以及低碳烷醇銨和藥學(xué)上可接受的有機(jī)胺的其它堿鹽等。

應(yīng)進(jìn)一步了解，所述多肽可凍干進(jìn)行存儲(chǔ)并且在使用之前在合適載體中復(fù)原。任何合適的凍干方法(例如噴霧干燥、濾餅干燥)和/或復(fù)原技術(shù)均可使用。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，凍干和復(fù)原可導(dǎo)致變化程度的活性損失并且用量可必須向上調(diào)節(jié)以進(jìn)行補(bǔ)償。優(yōu)選地，凍干(冷凍干燥)的多肽在再水合時(shí)損失其活性(在凍干之前)的僅約20％，或僅約25％，或僅約30％，或僅約35％，或僅約40％，或僅約45％，或僅約50％。

所述多肽以包含所述多肽和關(guān)于預(yù)期施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)或美容學(xué)規(guī)范選擇的藥學(xué)上可接受和/或美容學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的組合物的形式提供(參看例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995,Alfonso Gennaro編,Mack Publishing Company,Pennsylvania,USA，其以引用的方式并入本文)。

“藥學(xué)上可接受”包括所述制劑是無菌并且無熱原質(zhì)的。合適的藥學(xué)載體為藥學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的。載體必須在與本發(fā)明化合物可相容并且對其接受者無害的意義上為“可接受的”。典型地，所述載體將為水或生理鹽水，其將為無菌并且無熱原質(zhì)的；然而，可使用其它可接受的載體。因此，“藥學(xué)上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括用于形成所述制劑的一部分的任何化合物，其預(yù)期僅僅充當(dāng)載體，即不預(yù)期具有其生物活性。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑一般為安全、無毒并且在生物學(xué)或其它方面均合乎需要。如本文所用的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括一種和超過一種所述載體或賦形劑。

同樣，術(shù)語“美容學(xué)上可接受”用于指示適用作美容產(chǎn)品的制劑。合適的美容載體為所屬領(lǐng)域中眾所周知的，如通常用于洗發(fā)劑、洗液、乳膏和其它所述產(chǎn)品中的那些。

所述賦形劑可為碳水化合物、聚合物、脂質(zhì)和礦物中的一個(gè)或多個(gè)。碳水化合物的實(shí)例包括乳糖、蔗糖、甘露醇和環(huán)糊精，其添加至所述組合物中，例如用于促進(jìn)凍干。聚合物的實(shí)例為淀粉、纖維素醚、纖維素羧甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥基乙基纖維素、乙基羥基乙基纖維素、海藻酸鹽、角叉菜膠、透明質(zhì)酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸鹽、聚乙二醇/聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧乙烷/聚環(huán)氧丙烷共聚物、具有不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮(均具有不同分子量)，其添加至所述組合物中，例如用于粘度控制，用于實(shí)現(xiàn)生物粘著，或用于保護(hù)脂質(zhì)免于化學(xué)和蛋白水解降解。脂質(zhì)的實(shí)例為脂肪酸、磷脂、單甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯、神經(jīng)酰胺、鞘脂和糖脂(均具有不同?；滈L和飽和度)、卵磷酯、大豆卵磷脂、氫化卵磷脂和大豆卵磷脂，其出于類似于關(guān)于聚合物的那些的原因添加至所述組合物中。礦物的實(shí)例為滑石、氧化鎂、氧化鋅和氧化鈦，其添加至所述組合物中，以獲得益處，如液體積存的減少或有利的色素特性。

術(shù)語“稀釋劑”預(yù)期意指目的在于稀釋藥物制劑中的所述肽的水溶液或非水溶液。稀釋劑可為生理鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(如紅花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中的一個(gè)或多個(gè)。

稀釋劑也可充當(dāng)緩沖液。術(shù)語“緩沖液”預(yù)期意指目的在于穩(wěn)定化pH的含有酸-堿混合物的水溶液。緩沖液的實(shí)例為Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、硼酸鹽、ACES、ADA、酒石酸鹽、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲胂酸鹽、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

任選地，所述組合物可包含佐劑。術(shù)語“佐劑”預(yù)期意指添加至所述制劑中以增加所述肽的生物效應(yīng)的任何化合物。佐劑可為具有不同陰離子的鋅、銅或銀鹽中的一個(gè)或多個(gè)，例如但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸鹽、亞硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、乙醇酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、酒石酸鹽和具有不同酰基組成的乙酸鹽。

本發(fā)明的藥物組合物也可呈生物可降解的微球形式。脂族聚酯已經(jīng)廣泛用作微球的制造中的生物可降解聚合物，如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己內(nèi)酯)(PCL)和聚酐。所述微球的制劑可發(fā)現(xiàn)于US 5,851,451和EP0213303中。

本發(fā)明的藥物組合物也可呈聚合物凝膠的形式，其中聚合物如淀粉、纖維素醚、纖維素羧甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥基乙基纖維素、乙基羥基乙基纖維素、海藻酸鹽、角叉菜膠、透明質(zhì)酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸鹽，

所述多肽可以各種濃度配制，取決于正在使用的特定多肽的功效/毒性。優(yōu)選地，所述組合物包含在1nM與1M之間，例如0.1μM與1mM、1μM與100μM之間、5μM與50μM之間、10μM與50μM之間、20μM與40μM之間和任選地約30μM的濃度下的多肽。關(guān)于離體和體外應(yīng)用，組合物可包含較低濃度的多肽，例如0.0025μM與1μM之間、10nM與300nM之間或15nM與150nM之間。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明組合物可通過多種途徑，例如表面、經(jīng)皮、腸胃外或口服施用來施用。

有利地，本發(fā)明組合物適用于局部施用或皮內(nèi)施用。

因此，本發(fā)明組合物可局部施用于皮膚(例如面部、腿部等)。例如，所述組合物可以含有活性多肽的軟膏的形式提供，所述活性多肽懸浮或溶解于例如具有以下一個(gè)或多個(gè)的混合物中：礦物油、液體礦脂、白礦脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?；蛘?，所述多肽可配制為合適的洗液或乳膏，其懸浮或溶解于例如以下一個(gè)或多個(gè)的混合物中：礦物油、脫水山梨醇單硬脂酸酯、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

任選地，用于局部施用的組合物可包含滲透增強(qiáng)劑(例如，如Osborne和Henke,1997,Pharmaceutical Technology,November:58-82和Pathan和Setty,2009,Tropical Journal of Pharmaceutical Research 8(2):173-179中所述，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)。

或者，本發(fā)明組合物可腸胃外，例如皮內(nèi)施用。所述組合物最好以無菌水溶液的形式使用，所述無菌水溶液可含有其它物質(zhì)，例如充足的鹽或葡萄糖以制得與血液等張的溶液。必要時(shí)，所述水溶液應(yīng)適當(dāng)?shù)鼐彌_(優(yōu)選地至3至9的pH)。在無菌條件下合適的腸胃外制劑的制備容易通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)藥物技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

適用于腸胃外施用的組合物包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得所述制劑與預(yù)期接受者的血液等張的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可在單位劑量或多劑量容器，例如密封的安瓿和小瓶中呈遞，并且可存儲(chǔ)于冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在使用之前即刻添加無菌液體載體，例如注射用水。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可由先前所述種類的無菌散劑、顆粒和片劑制備。

使用如微球制劑的持續(xù)釋放系統(tǒng)來遞送所述多肽可為有益的。

使用微針和其它器件來遞送所述多肽也可適用。合適的微針的實(shí)例包括Hollow Microneedle Technology(來自3M)和Micro-Trans Microneedle Array Patch(來自Valeris)。用于遞送所述多肽的器件的其它形式包括經(jīng)皮貼片和經(jīng)皮凝膠。合適的經(jīng)皮貼片的實(shí)例包括可獲自Dow Corning的那些粘著劑。經(jīng)皮凝膠的實(shí)例包括用于激素的經(jīng)皮施用的那些。還參看Prausnitz和Langer,2008,Nature Biotechnology26:1261-1268；Jain等人,2014,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.31(3):219-72，和Wu等人,2012,Curr Pharm Biotechnol.13(7):1292-8(其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)。

或者，組合物可通過手術(shù)植入的器件施用，所述手術(shù)植入的器件直接釋放活性多肽至所需位點(diǎn)(即表皮)。

本發(fā)明組合物也可通過經(jīng)皮方法遞送。

例如，電穿孔療法(EPT)和/或離子導(dǎo)入系統(tǒng)可用于施用蛋白和多肽。在所述方法中，使用器件來遞送脈沖電場至細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膜至藥物的滲透性增加和細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的顯著增強(qiáng)。

替代的經(jīng)皮方法電并入在體驗(yàn)等于或類似于用于電穿孔的那些的電脈沖的皮膚表面上利用直徑高達(dá)30微米的小粒子。所述粒子被驅(qū)動(dòng)通過角質(zhì)層并且進(jìn)入皮膚的較深層中。所述粒子可裝載或涂布有藥物或基因或可簡單地用作在所述藥物可進(jìn)入的皮膚中產(chǎn)生孔隙的“子彈”。

額外經(jīng)皮方法也已經(jīng)由PowderJect Pharmaceuticals(由Novartis AG擁有)開發(fā)。

用于本發(fā)明的多肽和組合物的施用的合適方法為所屬領(lǐng)域中眾所周知的，例如參看Therapeutic Protein and Peptide Formulation and Delivery,Zahra Shahrokh等人(編),1997,American Chemical Society,ISBN13:9780841235281。

本發(fā)明組合物用于抑制哺乳動(dòng)物中的毛發(fā)生成。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，所述用途可本質(zhì)上為醫(yī)學(xué)和/或美容的(如下文詳細(xì)描述)。例如，欲抑制的毛發(fā)生長可與疾病或病癥有關(guān)或替代地可為出于美容原因不需要的正常毛發(fā)生長(在健康個(gè)體中)。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，如上文所定義的組合物用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與不必要和/或過度毛發(fā)生長有關(guān)的疾病或病癥，如多毛癥。

例如，所述與不必要和/或過度毛發(fā)生成有關(guān)的疾病或病癥可選自由多囊卵巢綜合征(PCOS)(最常見原因先天性腎上腺增生)、庫欣氏病、生長激素過量(肢端肥大癥)、卵巢中的腫瘤、腎上腺癌、希佩爾-林道病(Von Hippel–Lindau disease)、胰島素抗性、間質(zhì)泡膜增殖癥(stromal hyperthecosis，SH)、肥胖、遲發(fā)性皮膚卟啉病、藥物(如四氫孕三烯酮、苯妥英、米諾地爾)的副作用、激素治療以及激素病癥組成的組。

在另一實(shí)施方案中，所述組合物用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的內(nèi)生毛發(fā)(例如與剃須、上蠟和/或痤瘡有關(guān))。

本發(fā)明的另一相關(guān)方面提供如上文所定義的組合物，其用于制備用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與不必要和/或過度毛發(fā)生成有關(guān)的疾病或病癥(如多毛癥)的藥劑。

例如，所述與不必要和/或過度毛發(fā)生成有關(guān)的疾病或病癥可選自由多囊卵巢綜合征(PCOS)(最常見原因先天性腎上腺增生)、庫欣氏病、生長激素過量(肢端肥大癥)、卵巢中的腫瘤、腎上腺癌、希佩爾-林道病、胰島素抗性、間質(zhì)泡膜增殖癥(SH)、肥胖、遲發(fā)性皮膚卟啉病、藥物(如四氫孕三烯酮、苯妥英、米諾地爾)的副作用、激素治療以及激素病癥組成的組。

在另一實(shí)施方案中，所述藥劑用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的內(nèi)生毛發(fā)(例如與剃須、上蠟和/或痤瘡有關(guān))。

有利地，所述哺乳動(dòng)物為人類。

所述哺乳動(dòng)物(例如人類)可為雄性或雌性。

本發(fā)明的另一相關(guān)方面提供用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中與不必要和/或過度毛發(fā)生成有關(guān)的疾病或病癥(如多毛癥)的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的如上文所定義的組合物。

例如，所述與不必要和/或過度毛發(fā)生成有關(guān)的疾病或病癥可選自由多囊卵巢綜合征(PCOS)(最常見原因先天性腎上腺增生)、庫欣氏病、生長激素過量(肢端肥大癥)、卵巢中的腫瘤、腎上腺癌、希佩爾-林道病、胰島素抗性、間質(zhì)泡膜增殖癥(SH)、肥胖、遲發(fā)性皮膚卟啉病、藥物(如四氫孕三烯酮、苯妥英、米諾地爾)的副作用、激素治療以及激素病癥組成的組。

在另一實(shí)施方案中，所述方法用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的內(nèi)生毛發(fā)(例如與剃須、上蠟和/或痤瘡有關(guān))。

本發(fā)明的多肽組合物以有效量施用于患者。如本文所用的‘治療有效量’或‘有效量’或‘治療有效’是指對毛發(fā)生長提供抑制效應(yīng)的所述量。這是經(jīng)過計(jì)算來產(chǎn)生所需治療效應(yīng)的活性材料的預(yù)定量。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，化合物的所述量可視其比活性而變化。合適的劑量可含有經(jīng)過計(jì)算來產(chǎn)生與所需稀釋劑有關(guān)的所需治療效應(yīng)的活性組合物的預(yù)定量。在本發(fā)明組合物的制造方法和用途中，提供治療有效量的活性組分。治療有效量可由一般技術(shù)的醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)工人基于患者特征，如年齡、重量、性別、健康狀況、并發(fā)癥、其它疾病等來確定，如所屬領(lǐng)域中眾所周知。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的第一方面的組合物不限于醫(yī)學(xué)用途，而且可用作美容劑(在其并未因而提供任何身體健康改進(jìn)，而是僅僅向哺乳動(dòng)物提供美學(xué)益處的意義上)。

因此，本發(fā)明的第四方面提供如上文所定義的組合物用于人類中的美容毛發(fā)去除的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人類為男性。例如，所述毛發(fā)可從身體中選自由面部(例如面頰、下巴以及在上唇上方)、胸部、肩部、頸部和背部組成的組的區(qū)域去除。

在一替代實(shí)施方案中，所述人類為女性。例如，所述毛發(fā)可從身體中選自由面部(例如面頰、下巴以及在上唇上方)、背部、腿、臂、手指、腳、腳趾和恥骨組成的組的區(qū)域去除。

本發(fā)明的另一相關(guān)方面提供一種用于人類中的美容毛發(fā)去除的方法，其包括向所述人類施用有效量的如上文所定義的組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人類為男性。例如，所述毛發(fā)可從身體中選自由面部(例如面頰、下巴以及在上唇上方)、胸部、肩部、頸部和背部組成的組的區(qū)域去除。

在一替代實(shí)施方案中，所述人類為女性。例如，所述毛發(fā)可從身體中選自由面部(例如面頰、下巴以及在上唇上方)、背部、腿、臂、手指、腳、腳趾和恥骨組成的組的區(qū)域去除。

本發(fā)明組合物可單獨(dú)或與其它治療或美容治療組合使用。例如，本發(fā)明組合物可在與一種或多種以下毛發(fā)去除/預(yù)防治療的組合療法中使用：

-剃須、拔毛、脫毛、熱蠟、激光毛發(fā)去除、電蝕除毛(電或熱分解)、表面乳膏(如依氟鳥氨酸)和/或口服藥物治療(如用于婦女的口服避孕藥、抗雄激素、非那雄胺和促性腺激素釋放激素)。

熟練人員應(yīng)進(jìn)一步了解，本發(fā)明組合物可體內(nèi)、離體或體外使用。

因此，除了直接應(yīng)用或施用于哺乳動(dòng)物以外，所述組合物還可用于離體抑制毛發(fā)生成，例如在將皮膚移植至哺乳動(dòng)物上之前用于皮膚外植體中。

或者，所述多肽可用于體外抑制生長毛囊(或其干細(xì)胞前體)。

現(xiàn)將參考以下圖式描述體現(xiàn)本發(fā)明的某些方面的優(yōu)選的非限制性實(shí)施例：

除非本文另外指示，否則關(guān)于本發(fā)明的給定方面、特征或參數(shù)的偏好和選項(xiàng)應(yīng)被視為已經(jīng)與關(guān)于本發(fā)明的所有其它方面、特征和參數(shù)的任何偏好和選項(xiàng)組合公開。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO:1的多肽的表面組合物以治療與藥物的副作用有關(guān)的不必要毛發(fā)生長。

本說明書中明顯先前公開的文獻(xiàn)的列表或討論不應(yīng)必定被視為承認(rèn)該文獻(xiàn)是技術(shù)發(fā)展水平的一部分或是公知常識。

在權(quán)利要求書和/或本說明書中當(dāng)與術(shù)語“包含(comprising)”聯(lián)合使用時(shí)，措辭“一(a)”或“一(an)”的使用可意指“一個(gè)(one)”，但其也與“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或超過一個(gè)”的含義一致。

本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案在聯(lián)合以上描述和附圖考慮時(shí)將更好地了解和理解。然而，應(yīng)理解，以上描述雖然指示本發(fā)明的各種實(shí)施方案和其眾多特定詳情，但作為說明而非限制給出。多種取代、修飾、添加和/或重排可在本發(fā)明的范圍內(nèi)制得，而不偏離其精神，并且本發(fā)明包括所有所述取代、修飾、添加和/或重排。

以下圖式形成本說明書的一部分并且包括在內(nèi)以進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。本發(fā)明可通過與本文提供的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述組合參考這些圖式中的一個(gè)或多個(gè)來更好地理解。

圖(1)。通過本發(fā)明的示例性多肽“FOL-005”(SEQ ID NO:1；來自匯集的3名患者的數(shù)據(jù))在培養(yǎng)的分離人類毛囊中誘導(dǎo)毛發(fā)生長期至退行期轉(zhuǎn)變。分析的毛囊的數(shù)目在每組32-45之間。

圖(2)。代表性冷凍切片照片，展示FOL-005誘導(dǎo)從毛發(fā)生長期轉(zhuǎn)變至退行期

A：代表性毛干的照片

B：球區(qū)的放大

C：球區(qū)的染色，證明對真皮乳頭的強(qiáng)烈效應(yīng)

圖(3)。FOL-005對培養(yǎng)的分離人類毛囊中的褪黑激素含量的效應(yīng)。使用各組織切片的Masson Fontana組織化學(xué)和形態(tài)測量評估執(zhí)行分析。結(jié)果作為平均值+/-SEM呈遞，n＝各組中評估的26-47個(gè)毛囊。單因子ANOVA和邦費(fèi)羅尼氏事后測試(Bonferroni’s post-hoc test)，^*p<0.05

圖(4)。代表性冷凍切片照片(在放大率x200下拍攝)，展示FOL-005對培養(yǎng)的分離人類毛囊中的黑色素沉著的效應(yīng)。左圖中的黑色正方形指示形態(tài)測量學(xué)參考區(qū)域并且形態(tài)測量學(xué)數(shù)據(jù)在圖3中呈遞。

圖(5)。通過FOL-005在完整人類頭皮皮膚中誘導(dǎo)毛發(fā)生長期至退行期轉(zhuǎn)變。

圖(6)。確認(rèn)FOL-005在較高濃度(2名患者的平均值)下在完整人類頭皮皮膚中誘導(dǎo)退行期。

圖(7)。FOL-005對完整人類頭皮皮膚中的Ki67陽性細(xì)胞的增殖的效應(yīng)。FOL-005的濃度為60nM，平均值+/-SEM，n＝評估6-17張照片/摳圖?！癉3”＝處理后3天。

圖(8)。FOL-005對完整人類頭皮皮膚中的褪黑激素含量的效應(yīng)。使用各組織切片的Masson Fontana組織化學(xué)和形態(tài)測量評估執(zhí)行分析。結(jié)果作為平均值+/-SEM呈遞。單因子ANOVA和邦費(fèi)羅尼氏事后測試，^**p<0.01，^*p<0.05?！癉3”＝處理后3天。

圖(9)。FOL-005對個(gè)別代表性患者中的黑色素沉著的效應(yīng)。^***p<0.001。

圖(10)。代表性冷凍切片照片(在放大率x200下拍攝)，展示FOL-005對完整人類頭皮皮膚中的黑色素沉著的效應(yīng)。評估對乳頭層拍攝的照片，2-5張照片/摳圖。

圖(11)。FOL-005對真皮乳頭(DP)細(xì)胞的遷出的效應(yīng)。僅分析毛發(fā)生長期毛囊(HF)。結(jié)果基于由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。在用FOL-005處理的HF中遷出的DP細(xì)胞的數(shù)目無顯著變化。平均值+/-SEM，n＝評估的18-22個(gè)HF，曼-惠特尼測試(Mann-Whitney test)，ns

圖(12)。FOL-005對真皮乳頭(DP)細(xì)胞的遷出的效應(yīng)。僅分析毛發(fā)生長期毛囊(HF)。結(jié)果基于由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。在用FOL-005處理的HF中遷出的DP細(xì)胞的數(shù)目無顯著變化。平均值+/-SEM，n＝評估的18-22個(gè)HF，曼-惠特尼測試，ns

圖(13)。毛發(fā)周期分級。用FOL-005處理HF始終在人類頭皮皮膚中誘導(dǎo)毛發(fā)生長期HF在所測試的所有六名患者中過早地進(jìn)入退行期(在各直條中，頂部區(qū)域?qū)?yīng)于退行期中期，中間區(qū)域?qū)?yīng)于早期退行期并且底部區(qū)域?qū)?yīng)于退行期)。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。

圖(14)。毛發(fā)周期分級。用FOL-005處理HF始終在人類頭皮皮膚中誘導(dǎo)毛發(fā)生長期HF在所測試的所有六名患者中過早地進(jìn)入退行期。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。

圖(15)。Masson Fontana染色。在用FOL-005處理的HF中HF色素沉著無顯著變化。分析毛發(fā)生長期和退行期毛囊。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。平均值+/-SEM，n＝評估的41-51個(gè)HF，未配對Student氏t測試，ns

圖(16)。Masson Fontana染色。在用FOL-005處理的HF中HF色素沉著無顯著變化。分析毛發(fā)生長期和退行期毛囊。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。平均值+/-SEM，n＝評估的41-51個(gè)HF，未配對Student氏t測試，ns

圖(17)。Masson Fontana染色。在用FOL-005處理的HF中HF色素沉著無顯著變化。分析毛發(fā)生長期HF。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。平均值+/-SEM，n＝評估的13-22個(gè)HF，未配對Student氏t測試，ns

圖(18)。Masson Fontana染色。在用FOL-005處理的HF中HF色素沉著無顯著變化。分析毛發(fā)生長期HF。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。平均值+/-SEM，n＝評估的13-22個(gè)HF，未配對Student氏t測試，ns

圖(19)。在用FOL-005處理的毛囊中基底膜的形態(tài)無可觀察的差異(PAS染色)。

圖(20)。Ki67/TUNEL。在用15nM FOL-005處理的HF中凋亡細(xì)胞的數(shù)目顯著增加(參看中間對的右手條)。在用FOL-005處理的HF中增殖細(xì)胞的數(shù)目未確定顯著變化(參看各對的左手列)。分析毛發(fā)生長期和退行期HF。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。平均值+/-SEM，n＝評估的48-59個(gè)HF，曼-惠特尼測試，^*p<0.02。為了減少異常值引起的數(shù)據(jù)失真，執(zhí)行Grubb氏測試并且從分析中消除異常值。

圖(21)。Ki67/TUNEL。在用15nM FOL-005處理的HF中凋亡細(xì)胞的數(shù)目顯著增加。在用FOL-005處理的HF中增殖細(xì)胞的數(shù)目未確定顯著變化。分析毛發(fā)生長期和退行期HF。由6名患者匯集的數(shù)據(jù)。平均值+/-SEM，n＝評估的48-59個(gè)HF，曼-惠特尼測試，^*p<0.02。為了減少異常值引起的數(shù)據(jù)失真，執(zhí)行Grubb氏測試并且從分析中消除異常值。

圖(22)。用于檢測肥大細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色。組織化學(xué)可檢測的毛囊周肥大細(xì)胞的數(shù)目無顯著差異。

圖(23)。MHCII染色HS 14-061(間接免疫熒光。來自DAKO的小鼠抗人類Ab HLA–DP-DQ-DR)。免疫組織學(xué)可檢測的毛囊周MHCII+類細(xì)胞的數(shù)目無顯著差異。這些MHCII+細(xì)胞最可能是巨噬細(xì)胞。

圖(24)。CD31染色HS14-061(間接免疫熒光，來自DAKO的小鼠抗人類CD31Ab)。CD31+細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞)的數(shù)目無顯著差異。

圖(25)。K15染色HS14-087(間接免疫熒光，來自Chemikon的小鼠抗人類CK15Ab)。K15+細(xì)胞的數(shù)目無顯著差異。人類毛囊(HF)上皮干細(xì)胞未受不利影響。保存HF干細(xì)胞池并且因此分析FOL-005的再生潛力。

圖(26)。在人類毛囊的移植之后三次拍攝的移植物的代表性照片。(A)媒介物處理的動(dòng)物，(B)FOL-005處理的動(dòng)物，(C)米諾地爾處理的動(dòng)物和(D)FOL-005加米諾地爾處理的動(dòng)物。

圖(27)。在移植之后對人類毛囊的平均數(shù)的效應(yīng)。(A)媒介物處理的組，(B)FOL-005處理的組，(C)米諾地爾處理的組和(D)FOL-005加米諾地爾處理的組。

實(shí)施例

實(shí)施例A：示例性肽FOL-005[SEQ ID NO:1]對分離人類毛囊的效應(yīng)

(i)FOL-005誘導(dǎo)毛發(fā)生長期至退行期變化

材料和方法

從正常人類頭皮皮膚顯微解剖毛發(fā)生長期VI毛囊(參看Kloepper等人,2010，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)，所述正常人類頭皮皮膚由來自經(jīng)歷常規(guī)面部拉皮美容手術(shù)的三個(gè)健康成年女性的知情患者同意書獲得。

分離毛囊根據(jù)Philpott等人(參看Philpott等人,1990；Bodó等人,2009；Gáspár等人,2010，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)在補(bǔ)充胰島素和氫化可的松的威廉姆斯E培養(yǎng)基(William’s E medium)中進(jìn)行器官培養(yǎng)持續(xù)6-10天。

在培養(yǎng)所述毛囊后即刻起始用示例性多肽FOL-005處理，并且持續(xù)7至10天。

在器官培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，包埋毛囊并且針對縱向冷凍切片進(jìn)行加工(Bodó等人,2009；Gáspár等人,2010)。

結(jié)果

本發(fā)明的示例性肽FOL-005(SEQ ID NO:1；15nM、60nM和300nM)在分離人類毛囊中誘導(dǎo)毛發(fā)生長期至退行期的劑量依賴性轉(zhuǎn)變(參看圖1)。

對冷凍切片的分析披露了FOL-005促進(jìn)毛囊衰退，其指示FOL-005為體外人類毛發(fā)生長的強(qiáng)烈抑制劑(參看圖2)。

(ii)FOL-005誘導(dǎo)色素沉著變化

材料和方法

Masson Fontana染色：冷凍切片風(fēng)干并且在乙醇-乙酸中固定。該切片在tris緩沖生理鹽水(TBS)和蒸餾水中洗滌數(shù)次。冷凍切片在56℃下在暗處用氨銀溶液(Fluka,Seelze,Germany)處理40min。在蒸餾水中洗滌之后，該切片用5％硫代硫酸鈉水溶液(Merck,Darmstadt,Germany)處理1min。接著，該切片在流動(dòng)自來水中洗滌3min并且在0.5％中性紅水溶液(Sigma)中復(fù)染。在蒸餾水中洗滌之后，切片脫水并且安裝于Eukitt(O.Kindler,Freiburg,Germany)中。

免疫組織化學(xué)：為了比較不同毛發(fā)周期階段中HF的增殖和細(xì)胞凋亡，如先前所述(參看Kloepper等人,2010,Experimental Dermatology 19:305-12，其相關(guān)公開內(nèi)容以引用的方式并入)執(zhí)行Ki-67小鼠抗Ki-67抗血清(DAKO,Hamburg,Denmark)和TUNEL(ApopTag熒光素原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒；Millipore,Berlin,Germany)的雙重免疫標(biāo)記。

結(jié)果

黑色素沉著分析結(jié)果展示于圖3中。

在60nM FOL-005的劑量下，可檢測到色素沉著的顯著減少，確認(rèn)在分離毛囊中誘導(dǎo)的毛發(fā)生長期至退行期的轉(zhuǎn)變。

展示FOL-005對一名個(gè)體中的黑色素沉著的效應(yīng)的代表性冷凍切片照片展示于圖4中。在媒介物處理的對照組中，接近真皮乳頭觀察到更致密色素沉著，而在暴露于15nM并且尤其60nM FOL-005之后，在圖的右側(cè)可見更多色素沉著(與在真皮乳頭附近無更多黑色素合成時(shí)毛干的移動(dòng)一致)。

實(shí)施例B：示例性肽FOL-005[SEQ ID NO:1]對人類皮膚片的效應(yīng)

(i)FOL-005誘導(dǎo)毛發(fā)生長期至退行期變化

材料和方法

在如(Lu等人,2007，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)所述的無血清條件下執(zhí)行全層人類頭皮皮膚器官培養(yǎng)持續(xù)六天。

簡單地說，女性患者的頭皮皮膚在知情同意書之后獲自常規(guī)面部拉皮手術(shù)。人類頭皮皮膚在補(bǔ)充有100IU/ml青霉素G(Sigma,St Louis,MO,USA)、10μg/ml鏈霉素(Sigma)、0.25μg/ml兩性霉素B(Gibco,Karlsruhe,Germany)的威廉姆斯E培養(yǎng)基(Biochrom,Cambridge,UK)中洗滌。剃除外生毛干至表皮水平；接著使用Acu-穿孔機(jī)(STIEFEL,Offenbach am Main,Germany)穿孔輸出完整頭皮皮膚的2mm活組織切片(平行于毛發(fā)生長方向，即呈斜角)。

人類頭皮組織的穿孔輸出物小心地放置于威廉姆斯E培養(yǎng)基[補(bǔ)充有100IU/ml青霉素/10μg/ml鏈霉素、10μg/ml胰島素(Sigma)、10ng/ml氫化可的松(Sigma)和2mmol/l l-谷氨酰胺(Invitrogen,Paisley,UK)]中。使皮膚片段在該培養(yǎng)基中浮動(dòng)，其中表皮在空氣/液體界面處向上并且真皮/皮下組織向下。培養(yǎng)物在37℃下維持于具有95％空氣和5％CO₂的供氣孵育器中。每隔一天更換培養(yǎng)基。

在培養(yǎng)開始之后即刻，使皮膚片段暴露于示例性肽FOL-005(在15nM至3μM的劑量下)，其持續(xù)培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間。

在不同時(shí)間點(diǎn)，皮膚樣本包埋于O.C.T.^TM Tissue-TEK(Sakura,Zoeterwoude,the Netherlands)中，在液氮中冷凍，并且切割6μm冷凍切片。該切片接著后固定于丙酮中，風(fēng)干并且針對蘇木精和曙紅(H&E；Sigma)、Giemsa或Masson-Fontana組織化學(xué)進(jìn)行加工。個(gè)別毛囊關(guān)于如(Whiting等人1999)所述的其周期階段進(jìn)行分析，而毛囊黑化通過標(biāo)準(zhǔn)硝酸銀組織化學(xué)(Masson-Fontana染色)進(jìn)行分析。使用Image J軟件(NIH)執(zhí)行近端毛基質(zhì)內(nèi)充分界定的參考區(qū)域的定量。

為了評估凋亡和增殖細(xì)胞，應(yīng)用雙重免疫熒光。末端dUTP缺口標(biāo)記(熒光素原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒；Chemicon,Tenecula,CA,USA)用作細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物，并且Ki67免疫反應(yīng)性(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)作為細(xì)胞增殖的指示劑，如先前所述(Foitzik等人,2006)。

結(jié)果

FOL-005在完整人類頭皮皮膚中誘導(dǎo)毛發(fā)生長期至退行期的快速轉(zhuǎn)變(參看圖5和6)。

在添加FOL-005至培養(yǎng)基中之后，在早期退行期中觀察到幾乎所有毛囊。

退行期也通過注射FOL-005至頭皮皮膚組織中來誘導(dǎo)。

對冷凍切片的分析披露了FOL-005促進(jìn)毛囊衰退，其指示FOL-005為體外人類毛發(fā)生長的強(qiáng)烈抑制劑(參看圖2)。

(ii)FOL-005抑制Ki67陽性細(xì)胞的增殖并且增加細(xì)胞凋亡

材料和方法

如上文所述執(zhí)行Masson Fontana染色和免疫組織化學(xué)。

Ki67陽性細(xì)胞的增殖和其中細(xì)胞凋亡如Whiting等人,1999,J Investig Dermatol Symp Proc 4:282–284(其相關(guān)公開內(nèi)容以引用的方式并入)所述來確定。

細(xì)胞暴露于在60nM劑量下的示例性多肽FOL-005。

結(jié)果

在FOL-005處理的皮膚中存在強(qiáng)烈的降低增殖的傾向，如通過Ki67陽性細(xì)胞的降低的比例所表示(參看圖7；白條)。

與對毛發(fā)生長的抑制一致，還存在增加的細(xì)胞凋亡水平，如通過FOL-05處理后TUNEL陽性細(xì)胞的比例所指示(參看圖7；陰影條)。

(iii)FOL-005誘導(dǎo)色素沉著變化

材料和方法

在用示例性多肽FOL-005處理的分離毛囊中的色素沉著變化通過Masson-Fontana組織化學(xué)來分析(參看Whiting等人,1999,J Investig Dermatol Symp Proc 4:282–284，其相關(guān)公開內(nèi)容以引用的方式并入)。

結(jié)果

黑色素沉著分析結(jié)果展示于圖8和9中。

通過注射或添加至培養(yǎng)基中使完整人類頭皮皮膚暴露于FOL-005會(huì)誘導(dǎo)色素沉著的顯著減少，從而確認(rèn)毛囊中毛發(fā)生長期至退行期的轉(zhuǎn)變。

展示FOL-005對一名個(gè)體中的黑色素沉著的效應(yīng)的代表性冷凍切片照片展示于圖10中。媒介物處理的對照組(左圖)展示強(qiáng)烈色素沉著，與FOL-005處理的毛囊形成對比，該FOL-005處理的毛囊呈現(xiàn)不太致密的色素沉著(中間和右圖)。

實(shí)施例C：頭皮毛囊(HF)上FOL-005[SEQ ID NO:1]的離體分析

重復(fù)示例性肽FOL-005對頭皮毛囊(HF)的效應(yīng)的以上離體分析以便證明所觀察到的對毛發(fā)生長的抑制的堅(jiān)固性。

使用人類HF在器官培養(yǎng)的全層人類頭皮皮膚片段(4mm，6名女性患者，42-65歲)中執(zhí)行以下實(shí)驗(yàn)。

a)DP細(xì)胞的遷出

在HF中未觀察到FOL-005處理對遷出的真皮乳頭(DP)細(xì)胞的數(shù)目具有顯著效應(yīng)(由六名患者匯集的數(shù)據(jù)；平均值+/-SEM，n＝18-22個(gè)HF，曼-惠特尼測試)。

結(jié)果展示于圖11和12中。

b)HF周期的分析

用FOL-005處理HF始終在人類頭皮皮膚中誘導(dǎo)毛發(fā)生長期HF在所測試的所有六名患者中過早地進(jìn)入退行期(由六名患者匯集的數(shù)據(jù))。

結(jié)果展示于圖13和14中。

c)毛發(fā)色素沉著

在用處于所測試的劑量下的FOL-005處理的HF中未觀察到HF色素沉著的顯著變化(平均值+/-SEM，未配對Student氏t測試)。

結(jié)果展示于圖15和16中(分析毛發(fā)生長期和退行期HF)。

進(jìn)一步結(jié)果展示于圖17和18 9中(僅分析毛發(fā)生長期HF)。

d)毛囊形態(tài)(PAS)

在用FOL-005處理的HF中關(guān)于BM的形態(tài)未觀察到可觀察差異(指示不存在任何毒性效應(yīng))

結(jié)果展示于圖19中。

e)增殖/細(xì)胞凋亡

在用15nM FOL-005處理的HF中觀察到凋亡細(xì)胞的數(shù)目顯著增加(分析毛發(fā)生長期和退行期HF)。

在用處于這一劑量下的FOL-005處理的HF中增殖細(xì)胞的數(shù)目未確定顯著變化。

平均值+/-SEM，n＝評估的48-59個(gè)HF，曼-惠特尼測試，^*p<0.02。為了減少異常值引起的數(shù)據(jù)失真，執(zhí)行Grubb氏測試并且從分析中消除異常值。

結(jié)果展示于圖20和21中。

f)關(guān)于MC(肥大細(xì)胞)、MHCII+、CD31+細(xì)胞的染色

組織化學(xué)可檢測的毛囊周肥大細(xì)胞的數(shù)目未觀察到顯著差異(參考圖22；用于檢測肥大細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色)

免疫組織學(xué)可檢測的毛囊周MHC II+類細(xì)胞的數(shù)目未觀察到顯著差異(參看圖23)

CD31+細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞)的數(shù)目無顯著差異(參看圖24)。

g)關(guān)于K15+細(xì)胞的染色

K15+細(xì)胞的數(shù)目未觀察到顯著差異

使用HS14-087(間接免疫熒光，來自Chemikon的小鼠抗人類CK15 Ab)執(zhí)行K15染色。

人類HF上皮干細(xì)胞未受不利影響。

實(shí)現(xiàn)HF干細(xì)胞池的保存，因此證明FOL-005的再生潛力(參看圖25)

概述

以上發(fā)現(xiàn)確認(rèn)并且擴(kuò)充了實(shí)施例B中的結(jié)果，展示示例性肽FOL-005通過誘導(dǎo)以下效應(yīng)堅(jiān)固地促進(jìn)人類頭皮HF中的退行期發(fā)展。

(a)在用FOL-005處理后退行期HF的％增加；

(b)在匯集的數(shù)據(jù)中經(jīng)過處理的HF的毛基質(zhì)中的凋亡細(xì)胞增加；以及

(c)在處理后增加從毛發(fā)生長期HF遷出DP的傾向

示例性肽FOL-005看來是充分耐受的，如通過以下觀察證明：

(a)在用FOL-005處理后HF黑色素含量無顯著變化；

(b)在FOL-005處理的樣品中基底膜形態(tài)或毛囊周巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞和CD31+細(xì)胞的數(shù)目無顯著差異；以及

(c)K15+細(xì)胞的數(shù)目無顯著差異

結(jié)論

FOL-005明顯地促進(jìn)HF退行期，從而確認(rèn)其作為人類毛發(fā)生長抑制劑的活性：其看來是充分耐受和有效的。不存在任何毒性效應(yīng)的跡象。

實(shí)施例D：示例性肽FOL-005[SEQ ID NO:1]對人類皮膚片的效應(yīng)

研究FOL-005對移植至SCID小鼠上的人類男性頭皮皮膚的毛發(fā)生長的效應(yīng)。

該研究的目的是調(diào)查FOL-005對具有雄激素性禿發(fā)的傾向的人類男性頭皮皮膚的毛發(fā)生長的效應(yīng)。為了解決這一問題，在該研究中涉及四十二只雌性六周齡SCID/淺褐色小鼠。將獲自具有發(fā)展常見禿發(fā)的傾向的人類志愿者的頭皮皮膚的穿孔輸出移植物3mm²移植至SCID/淺褐色小鼠上(每只小鼠三個(gè)移植物)。

在移植后一周，小鼠如下隨機(jī)分成四個(gè)處理組：

1.媒介物(10只小鼠)一周兩次進(jìn)行皮內(nèi)注射并且用作陰性對照。

2.米諾地爾(5％)(11只小鼠)一天兩次進(jìn)行表面應(yīng)用并且用作陽性對照。

3.FOL-005(每個(gè)移植物300nM)(11只小鼠)一周兩次進(jìn)行皮內(nèi)注射。

4.米諾地爾5％+FOL-005/米諾地爾(5％)(11只小鼠)一天兩次進(jìn)行表面應(yīng)用。FOL-005(每個(gè)移植物300nM)一周兩次進(jìn)行皮內(nèi)注射。關(guān)于最初4周，動(dòng)物僅用米諾地爾處理(以便起始毛發(fā)生長)并且接著關(guān)于剩余時(shí)期(2個(gè)月)，F(xiàn)OL-005處理作為注射液添加，而米諾地爾處理維持作為表面應(yīng)用。

一周兩次由兩個(gè)獨(dú)立觀察者對毛發(fā)/移植物的數(shù)目計(jì)數(shù)。在皮膚移植之后三個(gè)月，從該小鼠獲得移植物并且在液氮中凍并且存儲(chǔ)于-80℃下用于進(jìn)一步分析。

如與媒介物處理組(分別地3.7±0.6，p<0.05)相比，在FOL-005處理組(2.1±0.4)中觀察到毛發(fā)/移植物的數(shù)目的顯著減少(參看圖26和圖27)。

此外，如與用單獨(dú)米諾地爾處理的組(8.1±0.1，p<0.001)相比，在FOL-005+米諾地爾(3.4±0.7)處理組中檢測到毛發(fā)/移植物的數(shù)目的顯著減少。

在媒介物組和FOL-005+米諾地爾(3.7±0.6和3.4±0.7，p＝NS)中觀察到毛發(fā)/移植物的相似平均數(shù)。

這一研究的結(jié)果確認(rèn)FOL-005對毛發(fā)生長具有抑制效應(yīng)。FOL-005在體內(nèi)人類頭皮皮膚中的完全毛發(fā)生長-抑制潛力也通過以下事實(shí)理解，即其強(qiáng)烈地拮抗米諾地爾(臨床醫(yī)學(xué)中的一種最佳識別的毛發(fā)過多誘導(dǎo)劑)的毛發(fā)生長促進(jìn)效應(yīng)。

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