發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及采用包含對(duì)死亡受體5(dr5)特異性的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)特異性的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體和化療劑的組合療法，及這些組合療法用于治療癌癥的用途。發(fā)明背景單克隆抗體是癌癥治療中有力的治療劑，因?yàn)樗鼈冞x擇性靶向癌癥細(xì)胞上差異表達(dá)的抗原。用激動(dòng)性單克隆抗體靶向癌細(xì)胞上的trail(tnf相關(guān)凋亡誘導(dǎo)性配體)死亡受體代表新一代單克隆抗體療法，因?yàn)樗鼈兡軌蛑苯诱T導(dǎo)靶定細(xì)胞凋亡。在結(jié)合trail后，tnfr-sf家族的死亡受體諸如dr4和dr5變成三聚化。三聚化誘導(dǎo)外在的凋亡途徑和復(fù)雜的事件級(jí)聯(lián)，包括胱天蛋白酶活化，其最終導(dǎo)致殺死靶細(xì)胞。如果發(fā)生dr5超聚簇(即多個(gè)三聚體聚簇)的話，凋亡誘導(dǎo)得到進(jìn)一步增強(qiáng)。雖然死亡受體在多種細(xì)胞類型上廣泛表達(dá)，但是經(jīng)外在途徑的凋亡誘導(dǎo)局限于腫瘤細(xì)胞。既然激動(dòng)性dr4或dr5結(jié)合抗體能夠交聯(lián)死亡受體及由此誘導(dǎo)凋亡，那么這些受體就是癌癥療法中感興趣的靶物。至少八種死亡受體靶向性分子進(jìn)入了臨床開發(fā)且已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中評(píng)估不同適應(yīng)癥的可能治療，諸如晚期實(shí)體瘤，像結(jié)直腸或肺癌。另外，已經(jīng)嘗試治療其它適應(yīng)癥，諸如淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。us2007/0031414和wo2006/083971中記載的完全人的dr5激動(dòng)性抗體drozitumab在高濃度在交聯(lián)缺失下顯示一些體外凋亡活性。然而，體內(nèi)數(shù)據(jù)揭示了一種不同的作用模式：在fcγr突變型小鼠中(或當(dāng)使用fcγr結(jié)合受到抑制的抗體變體時(shí))，drozitumab沒有活性，指示這種分子的體內(nèi)活性主要依賴于fcγr介導(dǎo)的交聯(lián)。這種分子測(cè)試到臨床ii期，看來是安全的(直到20mg/kg沒有達(dá)到mtd)，但是沒有展現(xiàn)任何顯著功效。ep1922337a中記載的conatumumab是另一種完全人的dr5激動(dòng)性抗體。conatumumab的活性嚴(yán)格依賴于經(jīng)fc受體的交聯(lián)。與drozitumab形成對(duì)比，這種抗體是非配體阻斷性的。同樣，這種分子在臨床試驗(yàn)中只顯示非常有限的功效。嵌合dr5抗體lby-135展現(xiàn)就交聯(lián)依賴性活性和非配體阻斷性特性而言與conatumumab類似的特征，而且在單一療法中沒有展現(xiàn)任何顯著功效。另外，lby-135在部分登記i期試驗(yàn)的患者中顯示免疫原性的跡象。dr4和dr5(trail)的重組生產(chǎn)天然配體dulanermin在臨床試驗(yàn)中只顯示有限的客觀響應(yīng)。天然配體的使用不知何故是不利的：trail靶向多種受體，包括死亡受體和誘餌受體二者，因此，選擇性堪憂。另外，trail具有與單克隆抗dr抗體相比短得多的血液半衰期，這個(gè)因素影響劑量和時(shí)間表參數(shù)。與單克隆抗dr抗體相比，trail很短的血液半衰期要求大和頻繁的劑量。另外，重組trail的生產(chǎn)非常困難且冗長。上文所述三種dr5激動(dòng)性抗體和配體的開發(fā)均已中止。另外兩種完全人的抗體，mapatumumab(抗dr4)和lexatumumab(抗dr5)，仍在開發(fā)中，雖然這些分子也沒有在單一療法中展現(xiàn)有希望的功效。tigatuzumab是一種人源化dr5激動(dòng)性抗體，據(jù)記載在體外在次級(jí)交聯(lián)缺失下(在低濃度已經(jīng))有活性，這當(dāng)然帶來系統(tǒng)性毒性問題的風(fēng)險(xiǎn)。然而，正如所有其它記載的激動(dòng)性dr5抗體，這種分子也至今沒有在i/ii期研究中展現(xiàn)令人信服的功效，而且最大耐受劑量mtd證明只有8mg/kg。用分子tas266，一種四聚體dr5結(jié)合性納米抗體(wo2011/098520)，從事通過靶向死亡受體來誘導(dǎo)凋亡的一種不同辦法。由于dr5結(jié)合模塊的四價(jià)構(gòu)造，認(rèn)為dr5交聯(lián)與標(biāo)準(zhǔn)二價(jià)抗體相比升高，這可導(dǎo)致活性升高。然而，由于它們的尺寸較小，這些分子具有(與抗體相比)半衰期相當(dāng)短的缺點(diǎn)。另外，既然這種四聚體分子沒有靶向腫瘤，那么系統(tǒng)性毒性的風(fēng)險(xiǎn)升高。本申請(qǐng)的發(fā)明人已經(jīng)將在雙特異性抗體平臺(tái)中組合dr5抗體drozitumab與腫瘤抗原結(jié)合模塊或腫瘤周圍的基質(zhì)中存在的抗原描述為實(shí)現(xiàn)兩項(xiàng)效果的一種新辦法：第一，可以將dr5結(jié)合抗體靶向腫瘤部位，這可避免潛在的系統(tǒng)性毒性問題(尤其當(dāng)使用展現(xiàn)交聯(lián)不依賴性活性的dr5抗體時(shí))。第二，這種腫瘤或腫瘤基質(zhì)靶向性模塊然后也充當(dāng)交聯(lián)單元來誘導(dǎo)dr5超聚簇和隨后的腫瘤部位特異性凋亡。已經(jīng)使用靶向不同腫瘤類型的drozitumab_scfv融合分子證明了基本概念(參見wo2011/039126)。已經(jīng)提議能夠結(jié)合dr5和人成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap；genbank登錄號(hào)aac51668)的雙特異性抗體。人fap最初是使用單克隆抗體(mab)f19(記載于wo93/05804，atcc編號(hào)hb8269)在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中鑒定的。在數(shù)個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)了該蛋白質(zhì)的同系物，包括小鼠(niedermeyeretal.，intjcancer71，383-389(1997)；niedermeyeretal.，eurjbiochem254，650-654(1998)；genbank登錄號(hào)aah19190)。fap具有獨(dú)特的組織分布：發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)在超過90％的所有原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性上皮腫瘤，包括肺，結(jié)直腸，膀胱，卵巢和乳腺癌的反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞上高度上調(diào)，而它通常在正常成年組織中缺失(rettigetal.，procnatlacadsciusa85，3110-3114(1988)；garin-chesaetal.，procnatlacadsciusa87，7235-7239(1990))。后續(xù)報(bào)告顯示fap不僅在基質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)，而且在一些類型的上皮起源的惡性細(xì)胞中表達(dá)，而且fap表達(dá)與惡性表型直接相關(guān)(jinetal.，anticancerres23，3195-3198(2003))。上文所述常規(guī)dr5靶向性分子的活性依賴于fc受體(fcr)介導(dǎo)的超聚簇，而且受腫瘤中的免疫浸潤和活化狀態(tài)影響(li和ravetch，pnas2012；wilson，cancercell2011；wo2011/098520)。fc/fcr相互作用可受生理性人igg水平削弱。因此，常規(guī)dr5靶向性分子的活性常常限于少數(shù)浸潤細(xì)胞(moessner，blood2010)。通過使用靶向dr5和fap二者的雙特異性抗體，敏感性腫瘤細(xì)胞的百分比可通過經(jīng)fap的超交聯(lián)顯著增大，而且針對(duì)dr5激動(dòng)劑的內(nèi)在抗性的風(fēng)險(xiǎn)降低。新穎的dr5結(jié)合模塊只在與fap交聯(lián)后有活性，這可導(dǎo)致與dr5結(jié)合物drozitumab和tigatuzumab相比改善的安全性和毒性概況。至今已經(jīng)測(cè)試的dr5激動(dòng)劑在臨床中是安全的，然而這些臨床程序受到dr5靶向性分子的低功效阻礙。找到使用dr5激動(dòng)性抗體靶向癌癥的有效療法仍然是本領(lǐng)域的一個(gè)問題。發(fā)明概述寬泛地，本發(fā)明涉及組合死亡受體5(dr5)靶向性抗原結(jié)合位點(diǎn)與靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體及它們與別的化療劑組合的用途。依照本發(fā)明采用的雙特異性抗體使得死亡受體變成交聯(lián)的且對(duì)靶定的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡。勝過常規(guī)死亡受體靶向性抗體的優(yōu)勢(shì)在于只在表達(dá)fap的部位誘導(dǎo)凋亡的特異性以及這些雙特異性抗體因誘導(dǎo)dr5超聚簇所致的更高效力。因而，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種供作為組合療法在治療癌癥的方法中使用的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體與選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑組合使用。優(yōu)選地，該化療劑選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，異磷酰胺或抗vegf抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與伊立替康組合使用。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，要治療的癌癥為結(jié)直腸癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與抗vegf抗體組合使用。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，要治療的癌癥為結(jié)直腸癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與多柔比星組合使用。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，要治療的癌癥為肉瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與多柔比星異磷酰胺組合使用。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，要治療的癌癥為肉瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與吉西他濱和abraxane組合使用。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，要治療的癌癥為胰腺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，該mdm2抑制劑為rg7388。在一個(gè)實(shí)施方案中，該bcl-2抑制劑為abt199。在一個(gè)實(shí)施方案中，該parp抑制劑為pj34。在一個(gè)實(shí)施方案中，該parp抑制劑為olaparip。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種供作為組合療法在治療癌癥的方法中使用的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體，其中該癌癥為結(jié)直腸癌，肉瘤，頭和頸癌，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌和間皮瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，該癌癥為結(jié)直腸癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肉瘤為軟骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃腸基質(zhì)腫瘤，纖維肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或惡性纖維組織細(xì)胞瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種供作為組合療法在治療癌癥的方法中使用的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體和化療劑一起施用，任選作為組合配制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體和該化療劑交替施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該化療劑在該雙特異性抗體之前施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該化療劑在該雙特異性抗體之后施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合以約一周至三周的間隔施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明采用一種雙特異性抗體，其中對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含：(a)seqidno.:1的重鏈cdr1；(b)seqidno.:2的重鏈cdr2；(c)seqidno.:3的重鏈cdr3；(d)seqidno.:4的輕鏈cdr1；(e)seqidno.:5的輕鏈cdr2；和(f)seqidno.:6的輕鏈cdr3。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明采用一種雙特異性抗體，其中對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含：(a)seqidno.:9的重鏈cdr1；(b)seqidno.:10的重鏈cdr2；(c)seqidno.:11的重鏈cdr3；(d)seqidno.:12的輕鏈cdr1；(e)seqidno.:13的輕鏈cdr2；和(f)seqidno.:14的輕鏈cdr3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含包含下述氨基酸序列的可變重鏈和可變輕鏈：seqidno.:7和seqidno.:8。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明，該雙特異性抗體包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含包含選自下組的氨基酸序列的可變重鏈和可變輕鏈：seqidno.:15和seqidno.:16。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明，該雙特異性抗體包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含：(a)seqidno.:1的重鏈cdr1；(b)seqidno.:2的重鏈cdr2；(c)seqidno.:3的重鏈cdr3；(d)seqidno.:4的輕鏈cdr1；(e)seqidno.:5的輕鏈cdr2；(f)seqidno.:6的輕鏈cdr3，和對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含：(a)seqidno.:9的重鏈cdr1；(b)seqidno.:10的重鏈cdr2；(c)seqidno.:11的重鏈cdr3；(d)seqidno.:12的輕鏈cdr1；(e)seqidno.:13的輕鏈cdr2；(f)seqidno.:14的輕鏈cdr3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含包含seqidno.:7的氨基酸序列的可變重鏈和包含seqidno.:8的氨基酸序列的可變輕鏈，和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含包含seqidno.:15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明，該雙特異性抗體包含seqidno:18，19和20的氨基酸序列，或者該雙特異性抗體包含seqidno:17，19和20的氨基酸序列在本發(fā)明的所有方面，有利的是，所述雙特異性抗體是人的或人源化的。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，至少一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和至少一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體對(duì)dr5和fap二者是二價(jià)的。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含一個(gè)或多個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)是交換的。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，至少一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和至少一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含：a)一個(gè)fc域，b)兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中所述fab片段在恒定重鏈(ch1)的c末端處連接至該fc域的第一或第二亞基，c)兩個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中該兩個(gè)fab片段在可變重鏈(vh)的n末端處連接至該fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)所述fab片段經(jīng)肽接頭連接至該fc域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，其包含一處或多處降低對(duì)fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一處或多處氨基酸替代在一個(gè)或多個(gè)選自下組的位置：l234，l235，和p329。在一個(gè)實(shí)施方案中，該fc域的每個(gè)亞基包含三處消除對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述雙特異性抗體和選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物包含本文所述雙特異性抗體，吉西他濱和帕利他賽或abraxane。在一個(gè)實(shí)施方案中，該mdm2抑制劑為rg7388。在一個(gè)實(shí)施方案中，該bcl-2抑制劑為abt199。在一個(gè)實(shí)施方案中，該parp抑制劑為pj34。在一個(gè)實(shí)施方案中，該parp抑制劑為olaparip。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述雙特異性抗體和選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述雙特異性抗體和伊立替康。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述雙特異性抗體，帕利他賽和吉西他濱或abraxane。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑組合使用。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體，帕利他賽和abraxane的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑組合使用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含：(i)第一容器，裝有包含本文所述雙特異性抗體的組合物；和(ii)第二容器，裝有包含選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑的組合物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含：(i)第一容器，裝有包含本文所述雙特異性抗體的組合物；和(ii)第二容器，裝有包含選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑的組合物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含：(i)第一容器，裝有包含本文所述雙特異性抗體的組合物；和(ii)第二容器，裝有abraxane；和(iii)第三容器，裝有吉西他濱。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的abraxane和治療有效量的吉西他濱。在一些實(shí)施方案中，該癌癥為結(jié)直腸癌，肉瘤，頭和頸癌，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，結(jié)締組織增生性黑素瘤和間皮瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，該癌癥為結(jié)直腸癌。在其它實(shí)施方案中，該肉瘤為軟骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃腸基質(zhì)腫瘤，纖維肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或惡性纖維組織細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體和該化療劑一起施用，任選作為組合配制劑?；蛘?，該雙特異性抗體和該化療劑可以交替施用，或是該化療劑在該雙特異性抗體之前施用，或是該化療劑在該雙特異性抗體之后施用。該組合可以依照臨床實(shí)踐來施用，例如以約一周至三周的間隔施用?，F(xiàn)在會(huì)參考附圖通過舉例而非限制的方式描述本發(fā)明的實(shí)施方案。然而，鑒于本公開文本，本發(fā)明的各種別的方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的?！昂?或”在本文中使用時(shí)要視為具體公開兩個(gè)規(guī)定特征或組件的每一個(gè)，具有或沒有另一個(gè)。例如，“a和/或b”要視為具體公開(i)a，(ii)b和(iii)a和b中的每一個(gè)，就像在本文中單獨(dú)列出每一個(gè)一樣。除非上下文另有規(guī)定，上文列出的特征的描述和定義不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓桨福彝鹊貞?yīng)用于所描述的所有方面和實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)述圖1。fap-dr5雙特異性抗體分子設(shè)計(jì)和作用模式的示意性呈現(xiàn)。圖2。對(duì)于單獨(dú)的和與10μm伊立替康組合的多種濃度的dr5抗體+fc，3天時(shí)ht29crc細(xì)胞的％抑制(細(xì)胞存活力測(cè)定法)的圖。圖3。對(duì)于單獨(dú)的和與20nmabraxane(nab-帕利他賽)組合的多種濃度的dr5抗體+fc，3天時(shí)bxpc3細(xì)胞的％抑制(細(xì)胞存活力測(cè)定法)的圖。圖4。對(duì)于單獨(dú)的和與20nm硼替佐米組合的多種濃度的dr5抗體+fc，3天時(shí)capan2pdac細(xì)胞的％抑制(細(xì)胞存活力測(cè)定法)的圖。圖5。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(1和10mg/kg)或drozitumablala(10mg/kg)任一處理的攜帶dld-1crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。第9至20天動(dòng)物用dr5-fap雙特異性抗體處理4次，并用drozitumablala處理一周一次。dr5-fap處理的腫瘤生長抑制分別計(jì)算為89％(10mg/kg)和79％(1.0mg/kg)。圖6。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或dr5-fap雙特異性抗體和伊立替康的組合任一處理的攜帶dld-1crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物用dr5-fap雙特異性抗體一周一次處理5次，并每5天用伊立替康處理總共3次。dr5-fap和伊立替康組合處理的腫瘤消退計(jì)算為72％。圖7。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或平行或順序應(yīng)用的dr5-fap雙特異性抗體和伊立替康的組合任一處理的攜帶dld-1crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物自第7天起一周一次用dr5-fap雙特異性抗體靜脈內(nèi)處理5次(第7，14，21，28，35天)，并5天每天用伊立替康腹膜內(nèi)處理總共3個(gè)周期(第7-11，19-23，33-36天)圖8。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或dr5-fap雙特異性抗體和伊立替康的組合任一處理的攜帶hct116crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物自第7天起一周一次用dr5-fap雙特異性抗體處理3次，并每5天用伊立替康處理總共2次。dr5-fap處理的腫瘤生長抑制計(jì)算為46％，而且含伊立替康的組合誘導(dǎo)腫瘤消退(tgi>100％)。圖9。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，奧沙利鉑(5mg/kg)或dr5-fap雙特異性抗體和奧沙利鉑的組合任一處理的攜帶hct116crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物自第7天起一周一次用dr5-fap雙特異性抗體處理3次(第7，14，21天)，并用奧沙利鉑腹膜內(nèi)處理總共2個(gè)周期(第7-10，21-23天)。dr5-fap和奧沙利鉑組合處理的腫瘤生長抑制計(jì)算為67％。圖10。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)或drozitumablala(10mg/kg)任一處理的攜帶lox-imvi結(jié)締組織增生性黑素瘤異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物第13至20天用dr5-fap雙特異性抗體或drozitumablala處理兩次。dr5-fap處理的腫瘤生長抑制計(jì)算為超過100％，而drozitumablala處理計(jì)算為65％。圖11。用媒介或dr5-fap雙特異性抗體(30mg/kg)任一處理的攜帶患者衍生co5896crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物第18至34天用dr5-fap雙特異性抗體處理6次。dr5-fap處理的腫瘤生長抑制計(jì)算為76％。圖12。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(30mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或dr5-fap雙特異性抗體和伊立替康的組合任一處理的攜帶患者衍生co5896crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物一周一次用dr5-fap雙特異性抗體處理4次，并第15-19天用伊立替康處理。dr5-fap和伊立替康組合處理在所有動(dòng)物中導(dǎo)致完全腫瘤消退(10/10)。圖13。顯示攜帶患者衍生co5896crc異種移植物的小鼠中的fap+基質(zhì)的ihc圖像。圖14。用媒介或dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)任一處理的攜帶患者衍生sarc4605肉瘤異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物第10至31天用dr5-fap雙特異性抗體處理4次。dr5-fap處理的腫瘤生長抑制計(jì)算為超過100％。圖15。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，ang2/vegf雙特異性抗體(10mg/kg)或dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)和ang2/vegf雙特異性抗體(10mg/kg)的組合任一處理的攜帶dld-1crc異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。兩種抗體均在第8，15和22天一周一次給予。雖然dr5-fap抗體作為單一藥劑的處理導(dǎo)致顯著的腫瘤生長抑制(tgi87％)，含抗ang/vegf單抗的組合具有疊加的功效并將腫瘤生長抑制提高至94％。單獨(dú)的ang2/vegf抗體處理以75％抑制腫瘤生長。圖16。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)或多柔比星(5mg/kg)或dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)和多柔比星(5mg/kg)的組合任一處理的攜帶lox-imvi結(jié)締組織增生性黑素瘤異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物第8至15天用dr5-fap雙特異性抗體或組合處理兩次。雖然dr5-fap抗體(10mg/kg，第8和15天)作為單一藥劑的處理導(dǎo)致腫瘤停滯(tgi97％)，含多柔比星的組合具有大于疊加的功效并引起明顯的腫瘤消退(93％)。單獨(dú)的多柔比星處理以77％抑制腫瘤生長。圖17。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，多柔比星(5mg/kg)，或dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)和多柔比星(5mg/kg)的組合任一處理的攜帶患者衍生sarc4605肉瘤異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物第20至41天用dr5-fap雙特異性抗體或組合處理4次。雖然dr5-fap抗體(10mg/kg，第20，27，34和41天)作為單一藥劑的處理導(dǎo)致腫瘤停滯(tgi99％)，含多柔比星的組合具有大于疊加的功效并引起明顯的腫瘤消退(83％)。單獨(dú)的多柔比星處理以77％抑制腫瘤生長。圖18。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，吉西他濱(40mg/kg)，吉西他濱(40mg/kg)和nab-帕利他賽(6mg/kg)，或dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)和吉西他濱(40mg/kg)和nab-帕利他賽(6mg/kg)的組合任一處理的攜帶患者衍生pa1178pdac異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物第32至81天用dr5-fap雙特異性抗體或組合處理7次。雖然dr5-fap抗體作為單一藥劑的處理導(dǎo)致96％的腫瘤生長抑制，三重組合是有效的，實(shí)現(xiàn)完全腫瘤消退。圖19。用媒介，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)，異磷酰胺(100mg/kg)，或dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)和異磷酰胺(100mg/kg)的組合任一處理的攜帶患者衍生sarc4605肉瘤異種移植物的小鼠中體內(nèi)中值腫瘤體積隨時(shí)間的變化的圖。動(dòng)物第20至41天用dr5-fap雙特異性抗體或組合處理4次，dr5-fap雙特異性抗體(10mg/kg)與烷化藥物異磷酰胺(100mg/kg，q7dx2)組合。單獨(dú)的dr5-fap抗體(10mg/kg，q7dx8)處理導(dǎo)致較強(qiáng)的腫瘤消退(96％及80％無腫瘤)，而含異磷酰胺的組合具有略微更高的功效(86％無腫瘤)。另外，組合中的腫瘤消退的動(dòng)力學(xué)更快。圖20。在用單一藥劑雙特異性dr5-fap抗體(10mg/kg；dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理之后的luminex數(shù)據(jù)。雙特異性dr5-fap抗體針對(duì)dld-1/3t3異種移植物誘導(dǎo)較強(qiáng)的時(shí)間相關(guān)腫瘤細(xì)胞凋亡。在抗體處理之后不久(6小時(shí))觀察到較強(qiáng)的效果。圖21。在用單一藥劑雙特異性dr5-fap抗體(10mg/kg；dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)或與多柔比星(10mg/kg)組合處理之后的luminex數(shù)據(jù)。雙特異性dr5-fap抗體以時(shí)間相關(guān)方式強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。雙特異性dr5-fap抗體與多柔比星一起的組合處理的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)是卓越的。a：誘導(dǎo)受到切割的胱天蛋白酶-3(效應(yīng)器胱天蛋白酶)的分析。b：誘導(dǎo)活化的胱天蛋白酶-8(外在的凋亡途徑)的分析。c：誘導(dǎo)活化的胱天蛋白酶-9(內(nèi)在的凋亡途徑)的分析。圖22。在用單一藥劑雙特異性dr5-fap抗體(10mg/kg；dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)或與伊立替康(15mg/kg)或奧沙利鉑(5mg/kg)組合處理之后的luminex數(shù)據(jù)。雙特異性dr5-fap抗體以時(shí)間相關(guān)方式強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。雙特異性dr5-fap抗體與伊立替康或奧沙利鉑一起的組合處理的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)是卓越的。a：誘導(dǎo)受到切割的parp的分析。b：誘導(dǎo)胱天蛋白酶-3(效應(yīng)器胱天蛋白酶)的分析。c：誘導(dǎo)活化的胱天蛋白酶-9(內(nèi)在的凋亡途徑)的分析。d：誘導(dǎo)活化的胱天蛋白酶-8(外在的凋亡途徑)的分析。發(fā)明詳述i.定義出于本文中的目的，“受體人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(vl)框架或重鏈可變域(vh)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列變化。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化的數(shù)目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些實(shí)施方案中，vl受體人框架與vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同?！坝H和力”指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有指示，如本文中使用的，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子x對(duì)其配偶體y的親和力通常可以用解離常數(shù)(kd)來表述。親和力可以通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測(cè)量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測(cè)量結(jié)合親和力的具體的說明性和例示性的實(shí)施方案?！坝H和力成熟的”抗體指在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)(hvr)中具有一處或多處改變的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力改善。術(shù)語“特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體”指如下的雙特異性抗體，其能夠以足夠親和力結(jié)合dr5和fap，使得該抗體可用作靶向表達(dá)dr5和fap的細(xì)胞的診斷劑和/或治療劑。具體而言，“特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體”指靶向腫瘤細(xì)胞上的dr5和所述腫瘤周圍的基質(zhì)中的fap的雙特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體結(jié)合無關(guān)非fap或非dr5蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對(duì)dr5或fap的結(jié)合的約10％，如例如通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)，基于表面等離振子共振(spr)的測(cè)定法(例如biacore)或流式細(xì)胞術(shù)(facs)測(cè)量的。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m至10-13m，例如，10-9m至10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體結(jié)合在來自不同物種的dr5或fap間保守的dr5或fap表位。優(yōu)選地，所述雙特異性抗體結(jié)合人和獼猴dr5及人，獼猴和小鼠fap。術(shù)語“特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)的抗體”指如下的抗體，其能夠以足夠親和力結(jié)合dr5，使得該抗體可用作靶向表達(dá)dr5的細(xì)胞的診斷劑和/或治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)的抗體結(jié)合無關(guān)非dr5蛋白質(zhì)的程度小于該抗體對(duì)dr5的結(jié)合的約10％，如例如通過放射免疫測(cè)定法(ria)或流式細(xì)胞術(shù)(facs)測(cè)量的。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)的抗體具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm，或≤0.001nm(例如10-8m或更少，例如10-8m至10-13m，例如，10-9m至10-13m)的解離常數(shù)(kd)。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)的抗體結(jié)合在來自不同物種的dr5間保守的dr5表位。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合人和獼猴dr5。術(shù)語“特異性結(jié)合死亡受體5(dr5)的抗體”還涵蓋能夠結(jié)合dr5和第二抗原的雙特異性抗體。本文中的術(shù)語“抗體”以最廣義使用，并且涵蓋各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性?！翱贵w片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體中的如下部分，該部分結(jié)合完整抗體所結(jié)合的抗原?？贵w片段的例子包括但不限于fv，fab，fab’，fab’-sh，f(ab’)2；雙抗體；cross-fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。例如，scfv抗體記載于huston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96。另外，抗體片段包含具有vh域或vl域的特征(即能夠與vl域或vh域一起裝配成功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且由此提供全長抗體的抗原結(jié)合特性)的單鏈多肽。如本文中使用的，“fab片段”指包含輕鏈片段(其包含vl域和輕鏈恒定域(cl))及vh域和重鏈第一恒定域(ch1)的抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含至少一個(gè)fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。由于可變區(qū)或恒定區(qū)任一的交換，所述fab片段也稱作“cross-fab”片段或“xfab”片段或“交換fab”片段。交換fab分子的兩種不同鏈組成是可能的且包含在本發(fā)明的雙特異性抗體中：一方面，fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，即交換fab分子包含由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的一條肽鏈及由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的一條肽鏈。這種交換fab分子也稱作crossfab(vlvh)。另一方面，當(dāng)fab重和輕鏈的恒定區(qū)交換時(shí)，交換fab分子包含由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的一條肽鏈及由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的一條肽鏈。這種交換fab分子也稱作crossfab(clch1)。包含交換fab片段的雙特異性抗體型式已有描述，例如在wo2009/080252，wo2009/080253，wo2009/080251，wo2009/080254，wo2010/136172，wo2010/145792和wo2013/026831中?！皢捂渇ab片段”或“scfab”是由抗體重鏈可變域(vh)，抗體恒定域1(ch1)，抗體輕鏈可變域(vl)，抗體輕鏈恒定域(cl)和接頭組成的多肽，其中所述抗體域和所述接頭n端至c端方向具有下述次序之一：a)vh-ch1-接頭-vl-cl，b)vl-cl-接頭-vh-ch1，c)vh-cl-接頭-vl-ch1或d)vl-ch1-接頭-vh-cl；且其中所述接頭是至少30個(gè)氨基酸，優(yōu)選介于32和50個(gè)氨基酸之間的多肽。所述單鏈fab片段a)vh-ch1-接頭-vl-cl，b)vl-cl-接頭-vh-ch1，c)vh-cl-接頭-vl-ch1和d)vl-ch1-接頭-vh-cl經(jīng)cl域和ch1域之間的天然二硫鍵穩(wěn)定化。另外，通過經(jīng)插入半胱氨酸殘基(例如可變重鏈中的位置44和可變輕鏈中的位置100，依照kabat編號(hào)方式)生成鏈間二硫鍵可以進(jìn)一步穩(wěn)定化這些單鏈fab分子。術(shù)語“n端”表示n端最后一個(gè)氨基酸，術(shù)語“c端”表示c端最后一個(gè)氨基酸?！叭诤稀被颉斑B接”表示各成分(例如fab分子和fc域亞基)是通過肽鍵相連接的，或是直接的或是經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)肽接頭。如本文中使用的，術(shù)語“接頭”指肽接頭且優(yōu)選是具有長度為至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度為5-100個(gè)，更優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸的氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽接頭是(gxs)n或(gxs)ngm，其中g(shù)＝甘氨酸，s＝絲氨酸，且(x＝3，n＝3，4，5或6且m＝0，1，2或3)或(x＝4且n＝2，3，4或5且m＝0，1，2或3)，優(yōu)選地x＝4且n＝2或3，更優(yōu)選地x＝4且n＝2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽接頭是(g4s)2。術(shù)語“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。例如，igg類的免疫球蛋白是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由二硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈構(gòu)成。從n端至c端，每條重鏈具有可變區(qū)(vh)，也稱為可變重域或重鏈可變域，接著是3個(gè)恒定域(ch1，ch2和ch3)，也稱為重鏈恒定區(qū)。類似地，從n端至c端，每條輕鏈具有可變區(qū)(vl)，也稱為可變輕域或輕鏈可變域，接著是恒定輕(cl)域(也稱為輕鏈恒定區(qū))。免疫球蛋白的重鏈可以歸入稱為α(iga)，δ(igd)，ε(ige)，γ(igg)或μ(igm)的5類之一，其中一些可以進(jìn)一步分成亞類，例如γ1(igg1)，γ2(igg2)，γ3(igg3)，γ4(igg4)，α1(iga1)和α2(iga2)?；谄浜愣ㄓ虻陌被嵝蛄?，免疫球蛋白的輕鏈可以歸入稱為卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)的兩類之一。免疫球蛋白基本由經(jīng)由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)fab分子和fc域組成。與參照抗體“結(jié)合相同表位的抗體”指在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中將參照抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50％或更多的抗體，且相反，參照抗體在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中將該抗體對(duì)其抗原的結(jié)合阻斷50％或更多。本文中提供了例示性的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法。術(shù)語“抗原結(jié)合域”指抗原結(jié)合分子中包含特異性結(jié)合部分或整個(gè)抗原并與部分或整個(gè)抗原互補(bǔ)的區(qū)域的部分。在抗原較大的情況中，抗原結(jié)合分子可以僅結(jié)合抗原的特定部分，該部分稱作表位。抗原結(jié)合域可以由例如一個(gè)或多個(gè)抗體可變域(也稱作抗體可變區(qū))提供。優(yōu)選地，抗原結(jié)合域包含抗體輕鏈可變區(qū)(vl)和抗體重鏈可變區(qū)(vh)。術(shù)語“嵌合”抗體指其中重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩余部分自不同來源或物種衍生的抗體，其通常通過重組dna技術(shù)來制備。包含家兔可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體是優(yōu)選的。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是那些其中恒定區(qū)已經(jīng)自初始抗體的恒定區(qū)修飾或改變以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于c1q結(jié)合/或fc受體(fcr)結(jié)合)的。此類嵌合抗體又稱為“類轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的dna區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的dna區(qū)段的免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物。用于生成嵌合抗體的方法牽涉常規(guī)的重組dna和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，其是本領(lǐng)域中公知的。參見例如morrison,s.l.等,proc.natl.acad.sci.usa81(1984)6851-6855；美國專利no.5,202,238和5,204,244。在用于本文時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒劑包括但不限于：放射性同位素(例如at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32，pb212和lu的放射性同位素)；化學(xué)治療劑或藥物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，長春花生物堿類(vincaalkaloids)(長春新堿(vincristine)，長春堿(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法侖(melphalan)，絲裂霉素(mitomycin)c，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌劑?！靶?yīng)器功能”指那些可歸于抗體fc區(qū)且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括：c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)，fc受體結(jié)合，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)，抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)，細(xì)胞因子分泌，免疫復(fù)合物介導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原攝取，細(xì)胞表面受體(例如b細(xì)胞受體)下調(diào)和b細(xì)胞活化。如本文中使用的，術(shù)語“工程化”視為包括對(duì)肽主鏈的任何操作或?qū)μ烊淮嬖诨蛑亟M的多肽或其片段的翻譯后修飾。工程化包括對(duì)氨基酸序列，糖基化模式或各氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾，以及這些辦法的組合。如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸突變”意為涵蓋氨基酸替代，缺失，插入和修飾?？梢赃M(jìn)行取代，缺失，插入和修飾的任意組合來實(shí)現(xiàn)最終構(gòu)建體，只要最終構(gòu)建體擁有期望的特性，例如降低的對(duì)fc受體的結(jié)合，或與另一種肽的增加的聯(lián)合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具體的氨基酸突變是氨基酸替代。為了改變例如fc區(qū)的結(jié)合特征，特別優(yōu)選非保守性的氨基酸替代，即將一個(gè)氨基酸用具有不同結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一種氨基酸替換。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羥脯氨酸，3-甲基組氨酸，鳥氨酸，高絲氨酸，5-羥賴氨酸)替換。可以使用本領(lǐng)域中公知的遺傳或化學(xué)方法生成氨基酸突變。遺傳方法可以包括定點(diǎn)誘變，pcr，基因合成等。通過與遺傳工程化不同的方法如化學(xué)修飾來改變氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的方法也可能可用。本文中可使用各種名稱來指示同一氨基酸突變。例如，從fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示為329g，g329，g329，p329g或pro329gly。藥劑(例如藥物配制劑)的“有效量”指在必需的劑量和時(shí)段上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防結(jié)果的量。本文中術(shù)語“fc域”或“fc區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恒定區(qū)的一部分的c端區(qū)域。該術(shù)語包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。雖然igg重鏈的fc區(qū)的邊界可以略微變化，但是人igg重鏈fc區(qū)通常定義為自cys226或pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，可以存在或不存在fc區(qū)的c端賴氨酸(lys447)。除非本文中另外指定，fc區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號(hào)方式依照eu編號(hào)系統(tǒng)，也稱為eu索引，如記載于kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991的。如本文中使用的，fc域的“亞基”指形成二聚體fc域的兩個(gè)多肽之一，即包含免疫球蛋白重鏈中能夠穩(wěn)定自身聯(lián)合的c端恒定區(qū)的多肽。例如，iggfc域的亞基包含iggch2和iggch3恒定域?！按龠M(jìn)fc域的第一和第二亞基聯(lián)合的修飾”是降低或防止包含fc域亞基的多肽與相同多肽聯(lián)合以形成同二聚體的肽主鏈操作或fc域亞基的翻譯后修飾。如本文中使用的，具體地，促進(jìn)聯(lián)合的修飾包括對(duì)期望聯(lián)合的兩個(gè)fc域亞基(即fc域的第一和第二亞基)中的每一個(gè)進(jìn)行的分開的修飾，其中所述修飾彼此互補(bǔ)，從而促進(jìn)兩個(gè)fc域亞基的聯(lián)合。例如，促進(jìn)聯(lián)合的修飾可以改變一種或兩種fc域亞基的結(jié)構(gòu)或電荷，從而在立體或靜電上分別促進(jìn)它們的聯(lián)合。如此，異二聚化在包含第一fc域亞基的多肽和包含第二fc域亞基的多肽之間發(fā)生，其在融合至每個(gè)亞基的別的組分(例如抗原結(jié)合模塊)不同這一意義上講可能是不相同的。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)聯(lián)合的修飾包含在fc域中的氨基酸突變，具體為氨基酸替代。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，促進(jìn)聯(lián)合的修飾包含fc域的兩個(gè)亞基的每一個(gè)中分開的氨基酸突變，具體為氨基酸替代?！翱蚣堋被颉癴r”指除高變區(qū)(hvr)殘基外的可變域殘基。一般地，可變域的fr由4個(gè)fr域組成：fr1，fr2，fr3，和fr4。因而，hvr和fr序列在vh(或vl)中一般以如下的順序出現(xiàn)：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。術(shù)語“全長抗體”，“完整抗體”，和“全抗體”在本文中可互換使用，指與天然抗體結(jié)構(gòu)具有基本上類似的結(jié)構(gòu)或者具有含有如本文中所限定的fc區(qū)的重鏈的抗體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞系”，和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且指已經(jīng)導(dǎo)入外源核酸的細(xì)胞，包括此類細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”，其包括原代的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及自其衍生的后代而不考慮傳代的次數(shù)。后代在核酸內(nèi)容物上可以與親本細(xì)胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選或選擇的相同功能或生物學(xué)活性的突變體后代。“人抗體”指擁有與由人或人細(xì)胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序列自非人來源衍生的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。正如關(guān)于依照本發(fā)明的嵌合和人源化抗體也提及的，如本文中使用的，術(shù)語“人抗體”也包含恒定區(qū)中經(jīng)過修飾以生成依照本發(fā)明的特性的此類抗體，尤其在c1q結(jié)合和/或fcr結(jié)合方面，例如通過“類轉(zhuǎn)換”即fc部分的改變或突變(例如自igg1至igg4和/或igg1/igg4突變)。如本文中所使用的，術(shù)語“重組人抗體”意圖包括通過重組手段制備，表達(dá)，創(chuàng)建或分離的所有人抗體，諸如自宿主細(xì)胞諸如ns0或cho細(xì)胞或者自對(duì)于使用轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的人免疫球蛋白基因或抗體而言轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)分離的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的可變和恒定區(qū)。依照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)進(jìn)行過體內(nèi)體細(xì)胞超突變。如此，重組抗體的vh和vl區(qū)的氨基酸序列是雖然自人種系vh和vl序列衍生及與其相關(guān)，但可以不天然存在于體內(nèi)的人抗體種系全集內(nèi)的序列?！叭斯灿锌蚣堋敝复砣嗣庖咔虻鞍譾l或vh框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列選集來自可變域序列亞組。通常，序列亞組是如kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,nihpublication91-3242,bethesdamd(1991),第1-3卷中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于vl，亞組是如kabat等，見上文中的亞組κi。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于vh，亞組是如kabat等，見上文中的亞組iii?！叭嗽椿笨贵w指包含來自非人hvr的氨基酸殘基和來自人fr的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)基本上整個(gè)可變域，其中所有或基本上所有hvr(例如，cdr)對(duì)應(yīng)于非人抗體的那些，且所有或基本上所有fr對(duì)應(yīng)于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的一部分?？贵w(例如非人抗體)的“人源化形式”指已經(jīng)經(jīng)歷人源化的抗體。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是那些其中的恒定區(qū)已經(jīng)另外自初始抗體的恒定區(qū)進(jìn)行過修飾或改變以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于c1q結(jié)合/或fc受體(fcr)結(jié)合)的。在用于本文時(shí)，術(shù)語“高變區(qū)”或“hvr”指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)(“高變環(huán)”)的每個(gè)區(qū)。一般地，天然的4鏈抗體包含6個(gè)hvr；三個(gè)在vh中(h1，h2，h3)，且三個(gè)在vl中(l1，l2，l3)。hvr一般包含來自高變環(huán)和/或來自“互補(bǔ)決定區(qū)”(cdr)的氨基酸殘基，后一種是最高序列變異性的和/或牽涉抗原識(shí)別。例示性高變環(huán)存在于氨基酸殘基26-32(l1)，50-52(l2)，91-96(l3)，26-32(h1)，53-55(h2)，和96-101(h3)(chothiaandlesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。例示性cdr(cdr-l1，cdr-l2，cdr-l3，cdr-h1，cdr-h2和cdr-h3)存在于氨基酸殘基24-34(l1)，50-56(l2)，89-97(l3)，31-35b(h1)，50-65(h2)，和95-102(h3)(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。高變區(qū)(hvr)也稱作互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，而且這些術(shù)語在述及形成抗原結(jié)合區(qū)的可變區(qū)部分時(shí)在本文中可交換使用。此特定區(qū)域已由kabat等,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(1983)及由chothia等,jmolbiol196:901-917(1987)描述，其中定義包括在彼此比較時(shí)氨基酸殘基的重疊或子集。然而，應(yīng)用任一種定義來指抗體或其變體的cdr意圖在如本文中定義和使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。涵蓋如由上文引用的每篇參考文獻(xiàn)定義的cdr的適宜的氨基酸殘基在下表a中列出作為比較。涵蓋特定cdr的確切殘基編號(hào)將隨著cdr的序列和大小而變化。鑒于抗體的可變區(qū)氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定哪些殘基構(gòu)成特定cdr。表a：cdr定義1cdrkabatchothiaabm2vhcdr131-3526-3226-35vhcdr250-6552-5850-58vhcdr395-10295-10295-102vlcdr124-3426-3224-34vlcdr250-5650-5250-56vlcdr389-9791-9689-971表a中所有cdr定義的編號(hào)方式依照由kabat等(見下文)提出的編號(hào)慣例。2如表a中使用的具有小寫字母“b”的“abm”指由oxfordmolecular的“abm”抗體建模軟件定義的cdr。kabat等還定義針對(duì)可變區(qū)序列的編號(hào)系統(tǒng)，其可應(yīng)用于任何抗體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以明確地將此“kabat編號(hào)”系統(tǒng)用于任何可變區(qū)序列，不依賴于序列本身外的任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。如本文中使用的，“kabat編號(hào)方式”指由kabat等,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,“sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”(1983)提出的編號(hào)系統(tǒng)。除非另外說明，提及抗體可變區(qū)中特定氨基酸殘基位置的編號(hào)方式依照kabat編號(hào)系統(tǒng)。除了vh中的cdr1外，cdr一般包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。cdr還包含“特異性決定殘基”，或“sdr”，其是接觸抗原的殘基。sdr包含在稱作縮短的-cdr，或a-cdr的cdr區(qū)內(nèi)。例示性的a-cdr(a-cdr-l1，a-cdr-l2，a-cdr-l3，a-cdr-h1，a-cdr-h2，和a-cdr-h3)存在于l1的氨基酸殘基31-34，l2的50-55，l3的89-96，h1的31-35b，h2的50-58，和h3的95-102(見almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可變域中的hvr殘基和其它殘基(例如，fr殘基)在本文中依照kabat等，見上文編號(hào)?！懊庖呔Y合物”指與一種或多種異源分子(包括但不限于細(xì)胞毒劑)綴合的抗體。“個(gè)體”或“受試者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于馴養(yǎng)的動(dòng)物(例如，牛，綿羊，貓，犬，和馬)，靈長類(例如，人和非人靈長類諸如猴)，家兔，和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體或受試者是人?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)與其天然環(huán)境的組分分開的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體純化至大于95％或99％的純度，如通過例如電泳(例如，sds-page，等電聚焦(ief)，毛細(xì)管電泳)或?qū)游?例如，離子交換或反相hplc)測(cè)定的。關(guān)于用于評(píng)估抗體純度的方法的綜述，見例如flatman等,j.chromatogr.b848:79-87(2007)?！胺蛛x的”的核酸指已經(jīng)與其天然環(huán)境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細(xì)胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色體外或在與其天然染色體位置不同的染色體位置處存在?！熬幋a特異性結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體的分離的核酸”指編碼抗體重和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子，包括單一載體或分開的載體中的此類核酸分子，和存在于宿主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)位置的此類核酸分子。如本文中使用的，術(shù)語“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體制備物的生成期間發(fā)生的可能的變體抗體外，此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。如此，修飾語“單克隆”指示抗體自一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的特性，而不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可以通過多種技術(shù)來生成要依照本發(fā)明使用的單克隆抗體，包括但不限于雜交瘤方法，重組dna方法，噬菌體展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，本文中描述了用于生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法。“裸抗體”指未與異源模塊(例如細(xì)胞毒性模塊)或放射性標(biāo)記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物配制劑中?！疤烊豢贵w”指具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構(gòu)成。從n至c端，每條重鏈具有一個(gè)可變區(qū)(vh)，又稱作可變重域或重鏈可變域，接著是三個(gè)恒定域(ch1，ch2，和ch3)。類似地，從n至c端，每條輕鏈具有一個(gè)可變區(qū)(vl)，又稱作可變輕域或輕鏈可變域，接著是一個(gè)恒定輕(cl)域。根據(jù)其恒定域氨基酸序列，抗體輕鏈可歸入兩種類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。術(shù)語“包裝插頁”用于指治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中通常包含的用法說明書，其含有關(guān)于涉及此類治療產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)癥，用法，劑量，施用，聯(lián)合療法，禁忌癥和/或警告的信息?！皼]有實(shí)質(zhì)性交叉反應(yīng)性”意指分子(例如，抗體)不識(shí)別或特異性結(jié)合與該分子的實(shí)際靶抗原不同的抗原(例如與靶抗原密切相關(guān)的抗原)，特別地在與該靶抗原相比時(shí)。例如，抗體可以結(jié)合少于約10％至少于約5％的與實(shí)際靶抗原不同的抗原，或者可以以由少于約10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.2％，或0.1％組成的量結(jié)合所述與實(shí)際靶抗原不同的抗原，優(yōu)選地少于約2％，1％，或0.5％，且最優(yōu)選地少于約0.2％或0.1％與實(shí)際靶抗原不同的抗原。關(guān)于參照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為比對(duì)序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性目的的對(duì)比可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如blast，blast-2，align或megalign(dnastar)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能決定用于比對(duì)序列的合適參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長獲得最大對(duì)比所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序align-2產(chǎn)生的。align-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由genentech,inc.編寫，并且源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國版權(quán)局(uscopyrightoffice,washingtond.c.,20559)，在那里其以美國版權(quán)注冊(cè)號(hào)txu510087注冊(cè)。公眾自genentech,inc.,southsanfrancisco,california可獲得align-2程序，或者可以從源代碼編譯。align-2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在unix操作系統(tǒng)，包括數(shù)碼unixv4.0d上使用。所有序列比較參數(shù)由align-2程序設(shè)定且不變。在采用align-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列a相對(duì)于(to)，與(with)，或針對(duì)(against)給定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對(duì)于，與，或針對(duì)給定氨基酸序列b的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列a)如下計(jì)算：分?jǐn)?shù)x/y乘100其中x是由序列比對(duì)程序align-2在該程序的a和b比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中y是b中的氨基酸殘基總數(shù)。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，若氨基酸序列a的長度與氨基酸序列b的長度不相等，則a相對(duì)于b的％氨基酸序列同一性將不等于b相對(duì)于a的％氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用align-2計(jì)算機(jī)程序獲得的。術(shù)語“藥物配制劑”指處于如下的制劑，其形式使得容許其中含有的活性成分的生物學(xué)活性是有效的，且不含對(duì)會(huì)接受配制劑施用的受試者具有不可接受的毒性的別的組分?！八帉W(xué)可接受載體”指藥物配制劑中與活性成分不同的，且對(duì)受試者無毒的成分。藥學(xué)可接受載體包括但不限于緩沖劑，賦形劑，穩(wěn)定劑，或防腐劑。如本文中使用的，術(shù)語“死亡受體5(dr5)”指來自任何脊椎動(dòng)物來源，包括哺乳動(dòng)物諸如靈長類(例如人)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然dr5，除非另外指明。該術(shù)語涵蓋“全長”，未加工的dr5以及dr5因細(xì)胞中的加工所致的任何形式。該術(shù)語還涵蓋dr5的天然存在變體，例如剪接變體或等位變體。例示性人dr5的氨基酸序列披露于wo2011/039126。如本文中使用的，術(shù)語“成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)”指來自任何脊椎動(dòng)物來源，包括哺乳動(dòng)物諸如靈長類(例如人)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然fap，除非另外指明。該術(shù)語涵蓋“全長”，未加工的fap以及fap因細(xì)胞中的加工所致的任何形式。該術(shù)語還涵蓋fap的天然存在變體，例如剪接變體或等位變體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗fap抗體結(jié)合fap的胞外域。例示性fap多肽序列的氨基酸序列，包括人fap的序列披露于wo2012/020006。在用于本文時(shí)，“治療/處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個(gè)體的天然過程的臨床干預(yù)，并且可以為了預(yù)防或者在臨床病理學(xué)的過程期間實(shí)施。治療的期望效果包括但不限于預(yù)防疾病的發(fā)生或再發(fā)生，減輕癥狀，減輕/減少疾病的任何直接或間接病理后果，預(yù)防轉(zhuǎn)移，降低疾病進(jìn)展速率，改善或減輕疾病狀態(tài)，和消退或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進(jìn)展。如本文中使用的，術(shù)語癌癥指增殖性疾病，諸如癌癥為結(jié)直腸癌，肉瘤，頭和頸癌，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌癥，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌和間皮瘤，包括任何上述癌癥的頑固性型式，或一種或多種上述癌癥的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥為結(jié)直腸癌癥，而且，任選的是，化療劑為伊立替康。如本文中使用的，“肉瘤”指在結(jié)締組織中生長的癌癥類型。肉瘤包括胃腸基質(zhì)腫瘤(在胃和腸中找到的一類軟組織肉瘤，通常稱作gist)，軟組織肉瘤(例如平滑肌肉瘤，成纖維細(xì)胞肉瘤，脂肪肉瘤，卡波西(kaposi)氏肉瘤(ks)，血管肉瘤，惡性周圍神經(jīng)鞘瘤(mpnst)，滑膜肉瘤，橫紋肌肉瘤)和骨的肉瘤(例如軟骨肉瘤，骨肉瘤，尤因(ewing)氏肉瘤，脊索瘤)。在癌癥為肉瘤的實(shí)施方案中，任選的是，肉瘤為軟骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃腸基質(zhì)腫瘤，纖維肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或惡性纖維組織細(xì)胞瘤。術(shù)語“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重或輕鏈中牽涉抗體結(jié)合抗原的域。天然抗體的重鏈和輕鏈可變域(分別為vh和vl)一般具有類似的結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)域包含4個(gè)保守的框架區(qū)(fr)和3個(gè)高變區(qū)(hvr)(見例如kindt等kubyimmunology,第6版,w.h.freemanandco.,第91頁(2007))。單個(gè)vh或vl域可以足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以分別使用來自結(jié)合抗原的抗體的vh或vl域篩選互補(bǔ)vl或vh域的文庫來分離結(jié)合特定抗原的抗體。見例如，portolano等,j.immunol.150:880-887(1993)；clarkson等,nature352:624-628(1991)。術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)”在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基?？贵w的抗原結(jié)合部分包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基。“框架”或“fr”區(qū)是可變域中那些與本文中定義的高變區(qū)殘基不同的區(qū)。因此，抗體的輕和重鏈可變域自n至c端包含域fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，和fr4。尤其地，重鏈的cdr3是對(duì)抗原結(jié)合貢獻(xiàn)最大且限定抗體特性的區(qū)。cdr和fr區(qū)依照kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或那些來自“高變環(huán)”的殘基來確定。抗體特異性指抗體對(duì)抗原的特定表位的選擇性識(shí)別。例如，天然抗體是單特異性的。依照本發(fā)明的“雙特異性抗體”是具有兩種不同抗原結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的抗體是對(duì)兩種不同抗原特異性，即作為第一抗原的dr5和作為第二抗原的fap。如本文中使用的，術(shù)語“單特異性”抗體表示抗體具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)結(jié)合相同抗原的相同表位。如本文中使用的，術(shù)語“雙特異性”抗體表示抗體具有至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)結(jié)合不同抗原或相同抗原的不同表位。本文中提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體指對(duì)至少兩種不同位點(diǎn)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。本文中提供雙特異性抗體，其具有針對(duì)fap和dr5的結(jié)合特異性。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以結(jié)合dr5的兩種不同表位。雙特異性抗體也可以用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)dr5的細(xì)胞。可以作為全長抗體或抗體片段制備雙特異性抗體。用于生成多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于具有不同特異性的兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的重組共表達(dá)(見milstein和cuello,nature305:537(1983))，wo93/08829，和traunecker等,emboj.10:3655(1991))，和“突起-入-空穴”工程化(見例如美國專利no.5,731,168)。也可以通過用于生成抗體fc-異二聚體分子的工程化靜電操縱效應(yīng)(wo2009/089004)；交聯(lián)兩個(gè)或更多個(gè)抗體或片段(見例如美國專利no.4,676,980,及brennan等,science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體(見例如kostelny等,j.immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(shù)(見例如hollinger等,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993))；及使用單鏈fv(sfv)二聚體(見例如gruber等,j.immunol.,152:5368(1994))；及如例如tutt等j.immunol.147:60(1991)中所描述的，制備三特異性抗體來生成多特異性抗體。本文中還包括具有三個(gè)或更多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程化改造抗體，包括“章魚抗體”(見例如us2006/0025576a1)。本文中的抗體或片段還包括包含至少一個(gè)結(jié)合fap或dr5以及另一種不同抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的“雙重作用fab”或“daf”(參見例如us2008/0069820)。如本申請(qǐng)內(nèi)使用的，術(shù)語“效價(jià)”或“價(jià)”表示抗體分子中存在指定數(shù)目的結(jié)合位點(diǎn)。如此，術(shù)語“二價(jià)”，“四價(jià)”，和“六價(jià)”分別表示抗體分子中存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，和六個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。依照本發(fā)明的雙特異性抗體至少是“二價(jià)”的，而且可以是“三價(jià)”的或“多價(jià)”的(例如“四價(jià)”或“六價(jià)”)。本發(fā)明的抗體具有兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)且是雙特異性的。就是說，該抗體可以是雙特異性的，即使在有超過兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的情況中(即該抗體是三價(jià)或多價(jià)的)。本發(fā)明的雙特異性抗體包括例如多價(jià)單鏈抗體，雙抗體和三抗體，以及如下的抗體，該抗體具有全長抗體的恒定域結(jié)構(gòu)，對(duì)其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)肽接頭連接別的抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如單鏈fv，vh域和/或vl域，fab，或(fab)2)。所述抗體可以是來自單一物種的全長，或者是嵌合化的或人源化的。在用于本文時(shí)，術(shù)語“載體”指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自身復(fù)制型核酸結(jié)構(gòu)的載體及并入接受其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的核酸的表達(dá)。此類載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。如本本申請(qǐng)內(nèi)使用的，術(shù)語“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸組，包括丙氨酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：a)，精氨酸(arg，r)，天冬酰胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，谷氨酰胺(gln，q)，谷氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，組氨酸(his，h)，異亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，賴氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro，p)，絲氨酸(ser，s)，蘇氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，和纈氨酸(val，v)。如本文中所使用的，表述“細(xì)胞”，“細(xì)胞系”，和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有此類名稱包括后代。如此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主題細(xì)胞和自其衍生的培養(yǎng)物，而不管傳代的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意或無意的突變，所有后代在dna內(nèi)容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變體后代。“親和力”指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有指示，如本文中使用的，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子x對(duì)其配偶體y的親和力通常可以用解離常數(shù)(kd)來表述。親和力可以通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測(cè)量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測(cè)量結(jié)合親和力的具體的說明性和例示性的實(shí)施方案。如本文中所使用的，術(shù)語“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指在體外測(cè)定法中，優(yōu)選地在表面等離振子共振測(cè)定法(spr,biacore,ge-healthcareuppsala,sweden)中抗體對(duì)抗原的表位的結(jié)合。結(jié)合親和力通過術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的結(jié)合速率常數(shù))，kd(解離常數(shù))，和kd(kd/ka)限定。結(jié)合或特異性結(jié)合意指10-8mol/l或更小，優(yōu)選10-9m至10-13m的結(jié)合親和力(kd)?？贵w對(duì)死亡受體的結(jié)合可以通過biacore測(cè)定法(ge-healthcareuppsala,sweden)來調(diào)查。結(jié)合親和力通過術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的結(jié)合速率常數(shù))，kd(解離常數(shù))，和kd(kd/ka)限定。術(shù)語“表位”包括能夠與抗體特異性結(jié)合的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面聚組，諸如氨基酸，糖側(cè)鏈，磷?；?，或磺酰基，并且在某些實(shí)施方案中可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特征。表位是抗原中被抗體結(jié)合的區(qū)域。如本文中所使用的，認(rèn)為特別地具有前綴“糖”的術(shù)語“工程化”或“工程化改造”及術(shù)語“糖基化工程”包括對(duì)天然存在的或重組的多肽或其片段的糖基化樣式的任何操作。糖基化工程包括細(xì)胞的糖基化機(jī)制的代謝工程，包括對(duì)寡糖合成途徑的遺傳操作以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白的改變的糖基化。此外，糖基化工程包括突變和細(xì)胞環(huán)境對(duì)糖基化的影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化工程是糖基轉(zhuǎn)移酶活性的變化。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，工程化改造導(dǎo)致改變的葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性和/或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性。ii.組合物和方法在一個(gè)方面，本發(fā)明基于包含對(duì)trail死亡受體5(dr5)特異性的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)特異性的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體和別的化療劑的治療劑組合的用途，例如用于治療癌癥。a.對(duì)fap和dr5特異性的雙特異性抗體的組合療法寬泛地，本發(fā)明涉及組合死亡受體5(dr5)靶向性抗原結(jié)合位點(diǎn)與靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體及它們與別的化療劑組合的用途。依照本發(fā)明采用的雙特異性抗體使得死亡受體變成交聯(lián)的且對(duì)靶定的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡。勝過常規(guī)死亡受體靶向性抗體的優(yōu)勢(shì)在于只在表達(dá)fap的部位誘導(dǎo)凋亡的特異性以及這些雙特異性抗體因誘導(dǎo)dr5超聚簇所致的更高效力。因而，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種供作為組合療法在治療癌癥的方法中使用的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體與選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑組合使用。優(yōu)選地，該化療劑選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，異磷酰胺或抗vegf抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該化療劑選自伊立替康，多柔比星或奧沙利鉑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與伊立替康組合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與帕利他賽和吉西他濱組合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體與異磷酰胺組合使用。伊立替康是一種用于治療癌癥的藥物。伊立替康通過抑制拓樸異構(gòu)酶1來阻止dna解開。伊立替康是天然生物堿喜樹堿的一種半合成類似物，而且名稱為[1,4’聯(lián)哌啶]-1’-羧酸(s)-4,11-二乙基-3,4,12,14-四氫-4-羥基-3,14-二氧代1h-吡喃并[3’,4’:6,7]-中氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基-酯。伊立替康具有結(jié)構(gòu)：多柔比星是用于治療一大批癌癥的化療劑。多柔比星插入dna，導(dǎo)致抑制dna合成；干擾拓樸異構(gòu)酶2，阻止dna復(fù)制和提高自由基的生成，促成它的細(xì)胞毒性。多柔比星是一種蒽環(huán)類抗生素，與天然的柔紅霉素密切相關(guān)，而且名稱為(7s,9s)-7-[(2r,4s,5s,6s)-4-氨基-5-羥基-6-甲基口惡烷-2-基]氧基-6,9,11-三羥基-9-(2-羥基乙?；?-4-甲氧基-8,10-二氫-7h-并四苯-5,12-二酮。多柔比星具有結(jié)構(gòu)：奧沙利鉑(sanofi)是一種用于治療癌癥，特別是結(jié)直腸癌的基于鉑的化療藥物。在生理學(xué)溶液中，奧沙利鉑經(jīng)歷非酶促轉(zhuǎn)變，變成活性衍生物，并導(dǎo)致dna交聯(lián)，抑制dna合成和轉(zhuǎn)錄。奧沙利鉑名稱為[(1r,2r)-環(huán)己烷-1,2-二胺](乙二酸合-o,o')鉑(ii)且具有結(jié)構(gòu)：5-fu(5-氟尿嘧啶)廣泛用于治療癌癥。5-fu是尿嘧啶的一種類似物，運(yùn)輸入細(xì)胞中并轉(zhuǎn)變成活性代謝物。這些代謝物破壞rna合成并抑制酶胸苷酸合酶，阻斷胸苷合成，胸苷是dna復(fù)制和修復(fù)所必需的。5-fu的名稱為5-氟-1h,3h-嘧啶-2,4-二酮且具有該結(jié)構(gòu)：mdm2抑制劑阻斷p53-mdm2結(jié)合，導(dǎo)致p53途徑激活，這導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和/或凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，mdm2抑制劑為rg7388。mdm2抑制劑rg7388是小分子吡咯烷化合物，正在進(jìn)行治療癌癥的臨床調(diào)查(dingetal.,j.med.chem.56(14):5979-5983,2013)。mdm2抑制劑rg7388的名稱為4-((2r,3s,4r,5s)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4-(4-氯-2-氟苯基)-4-氰基-5-新戊基吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基苯甲酸且具有結(jié)構(gòu)：在另一個(gè)實(shí)施方案中，mdm2抑制劑為mk-8242。其它mdm2抑制劑是本領(lǐng)域已知的且記載于例如swatupalitdebandsumitradeb:mutantp53andmdm2incancer,subcellularbiochemistry85,springer(isbn978-94-017-9211-0)。bcl-2(b細(xì)胞淋巴瘤2)抑制劑靶向bcl-2家族蛋白且旨在恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)促凋亡信號(hào)的敏感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，bcl-2抑制劑為abt199。bcl-2抑制劑abt199，也稱作gdc-0199，是一種選擇性抑制劑，正在進(jìn)行治療癌癥的臨床調(diào)查(souersetal.,(2013)nat.med.19(2):202-208)。它設(shè)計(jì)成模擬bcl-2蛋白上存在的bh3結(jié)構(gòu)元件的結(jié)合，在凋亡的調(diào)節(jié)中是重要的。abt199的名稱為(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基環(huán)己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-n-({3-硝基-4-[(四氫-2h-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺?；?-2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)且具有結(jié)構(gòu)：紫杉烷(帕利他賽和abraxane)是自太平洋紫杉樹taxusbrevifolia的小枝，針葉和樹皮衍生的藥物。它們已經(jīng)在多種腫瘤類型中展現(xiàn)抗腫瘤活性。紫杉烷通過超穩(wěn)定化微管的結(jié)構(gòu)來干擾它們的生長來發(fā)揮功能，破壞細(xì)胞在細(xì)胞分裂期間使用它的細(xì)胞骨架的能力并導(dǎo)致異常細(xì)胞功能和最終細(xì)胞死亡。帕利他賽在稱作cremophor(蓖麻油的一種有毒衍生物)的溶劑中溶解，投遞入細(xì)胞。清蛋白結(jié)合的帕利他賽(商品名abraxane，也稱作nab-帕利他賽)是一種備選配制劑，其中帕利他賽結(jié)合至清蛋白納米顆粒，它是一種備選的，毒性較低的投遞劑。帕利他賽的名稱為5β,20-環(huán)氧基-1,2α,4,7β,10β,13α-六羥基紫衫-11-烯-9-酮4,10-二乙酸酯2-苯甲酸酯與(2r,3s)-n-苯甲酰基-3-苯基異絲氨酸的13-酯且具有結(jié)構(gòu)：硼替佐米是一種用于治療癌癥的治療性蛋白酶體抑制劑。也稱作ps-341，硼替佐米特異性且可逆抑制26s蛋白酶體(一種涉及對(duì)癌細(xì)胞存活至關(guān)重要的多種蛋白的降解的酶復(fù)合物)的蘇氨酸殘基。抑制這些蛋白的降解使細(xì)胞對(duì)凋亡敏化。硼替佐米的名稱為[(1r)-3-甲基-1-[(2s)-3-苯基-2-(吡嗪-2-基甲酰胺基)丙酰胺基]丁基]硼酸且具有結(jié)構(gòu)：吉西他濱是一種殺死正在經(jīng)歷dna合成的細(xì)胞的化療劑。吉西他濱是一個(gè)核苷類似物，由核苷激酶代謝成二磷酸和三磷酸核苷。二磷酸吉西他濱抑制核糖核苷酸還原酶(dna合成所需要的一種酶)，而三磷酸吉西他濱與脫氧胞苷競(jìng)爭(zhēng)摻入dna。吉西他濱的名稱為4-氨基-1-(2-脫氧-2,2-二氟-β-d-赤式-呋喃戊糖基)嘧啶-2(1h)-酮且具有結(jié)構(gòu)：環(huán)巴胺是一種天然生物堿，正在作為潛在癌癥治療進(jìn)行調(diào)查。hedgehog途徑的不當(dāng)激活與腫瘤形成和生長有關(guān)。環(huán)巴胺能夠通過直接結(jié)合受體smoothened來破壞hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑來殺死癌細(xì)胞。環(huán)巴胺的名稱為(3β,23r)-17,23-環(huán)氧基藜蘆-3-醇且具有結(jié)構(gòu)：parp抑制劑是酶聚adp核糖聚合酶(parp)的一組藥理學(xué)抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，parp抑制劑為pj34。parp抑制劑pj34引起parp1不依賴性，p21依賴性有絲分裂阻滯。參見madisonetal.,dnarepair(amst).2011oct10；10(10):1003-13.doi:10.1016/j.dnarep.2011.07.006.epub2011aug12。pj34阻斷parp-1的活性，阻止含有受損dna的細(xì)胞修復(fù)單鏈斷裂并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。pj34的名稱為鹽酸n-(5,6-二氫-6-氧代-2-菲啶基)-2-乙酰胺且具有結(jié)構(gòu)：在一個(gè)實(shí)施方案中，parp抑制劑為olaparip。olaparip是聚adp核糖聚合酶(parp)(一種涉及dna修復(fù)的酶)的一種抑制劑。它在具有遺傳性brca1或brca2突變的人中針對(duì)癌癥起作用，這包括許多卵巢，乳腺和前列腺癌。olaparip的名稱為4-[(3-[(4-環(huán)丙基羰基)哌嗪-4-基]羰基)-4-氟苯基]甲基(2h)酞嗪-1-酮且具有結(jié)構(gòu)：異磷酰胺是一種用于治療癌癥的氮芥烷化劑，系統(tǒng)名稱為n-3-二(2-氯乙基)-1,3,2-氧雜氮雜磷雜環(huán)己烷-2-胺-2-氧化物，也稱作例如商品名ifex且具有結(jié)構(gòu)：異磷酰胺是一種用于治療不同癌癥(包括睪丸癌，肉瘤和一些類型的淋巴瘤)的化療藥物。含本發(fā)明的雙特異性dr5-fap抗體的治療劑組合中可采用的又一類化療劑是抗vegf抗體?？箆egf抗體的例子包括抗vegf抗體或靶向血管發(fā)生促進(jìn)性生長因子受體的肽-抗體融合物，例如貝伐珠單抗(雷尼珠單抗)，西妥昔單抗拉米魯珠單抗伊曲庫巴，humv833，2c3，阿柏西普和imc-1c11。一種優(yōu)選的抗vegf抗體是貝伐珠單抗抗vegf抗體的又一個(gè)例子是wo2010/040508和wo2011/117329中記載的抗vegf-ang2雙特異性抗體。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述雙特異性抗體和選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述雙特異性抗體和選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述雙特異性抗體和abraxane和吉西他濱。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含：(i)第一容器，裝有包含本文所述雙特異性抗體的組合物；和(ii)第二容器，裝有包含選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑的組合物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含：(i)第一容器，裝有包含本文所述雙特異性抗體的組合物；和(ii)第二容器，裝有包含選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑的組合物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含：(i)第一容器，裝有包含本文所述雙特異性抗體的組合物；和(ii)第二容器，裝有包含選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑的組合物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含：(i)第一容器，裝有包含本文所述雙特異性抗體的組合物；和(ii)第二容器，裝有帕利他賽或abraxane；和(iii)第三容器，裝有吉西他濱。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑組合使用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑組合使用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與伊立替康組合使用。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為結(jié)直腸癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與抗vegf抗體，優(yōu)選貝伐珠單抗組合使用。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為結(jié)直腸癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與多柔比星組合使用。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為肉瘤。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與異磷酰胺組合使用。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為肉瘤。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和化療劑的組合在制造用于治療癌癥的藥物中的用途，其中該雙特異性抗體與abraxane和吉西他濱組合使用。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為胰腺癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑，bcl-2抑制劑，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的選自伊立替康，多柔比星，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑rg7388，bcl-2抑制劑abt199，abraxane，帕利他賽，吉西他濱，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑pj34，異磷酰胺或抗vegf抗體的化療劑。在一些實(shí)施方案中，該癌癥為結(jié)直腸癌，肉瘤，頭和頸癌，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，結(jié)締組織增生性黑素瘤和間皮瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，該癌癥為結(jié)直腸癌。在其它實(shí)施方案中，該肉瘤為軟骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃腸基質(zhì)腫瘤，纖維肉瘤，骨肉瘤。脂肪肉瘤或惡性纖維組織細(xì)胞瘤。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的伊立替康。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為結(jié)直腸癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的抗vegf抗體，例如貝伐珠單抗。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為結(jié)直腸癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的abraxane和治療有效量的吉西他濱。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為胰腺癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的多柔比星。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為肉瘤。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的方法，其包括作為組合配制劑或交替地將治療劑組合施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療劑組合包含治療有效量的包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合死亡受體5(dr5)和成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)的雙特異性抗體和治療有效量的異磷酰胺。在一個(gè)此類方面，要治療的癌癥為肉瘤。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體和該化療劑一起施用，任選作為組合配制劑?；蛘撸撾p特異性抗體和該化療劑可以交替施用，或是該化療劑在該雙特異性抗體之前施用，或是該化療劑在該雙特異性抗體之后施用。該組合可以依照臨床實(shí)踐來施用，例如以約一周至三周的間隔施用。b.例示性的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體在一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體。fap結(jié)合模塊已經(jīng)記載于wo2012/020006，通過援引將其完整收錄。下述實(shí)施方案中描繪了要在dr5-fap雙特異性抗體中使用的特別感興趣的fap結(jié)合模塊。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體特異性交聯(lián)死亡受體且靶細(xì)胞的凋亡得以誘導(dǎo)。這些雙特異性死亡受體激動(dòng)性抗體勝過常規(guī)死亡受體靶向性抗體的優(yōu)勢(shì)在于只在表達(dá)fap的部位誘導(dǎo)凋亡的特異性。如上文描繪的，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了與已知的dr5結(jié)合物相比具有卓越特性的dr5結(jié)合模塊，其可并入新穎的且有利的dr5-fap雙特異性抗體中。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體的治療劑組合，該雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含(a)seqidno.:1的重鏈cdr1；(b)seqidno.:2的重鏈cdr2；(c)seqidno.:3的重鏈cdr3；(d)seqidno.:4的輕鏈cdr1；(e)seqidno.:5的輕鏈cdr2；(f)seqidno.:6的輕鏈cdr3，和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含(a)seqidno.:9的重鏈cdr1；(b)seqidno.:10的重鏈cdr2；(c)seqidno.:11的重鏈cdr3；(d)seqidno.:12的輕鏈cdr1；(e)seqidno.:13的輕鏈cdr2；(f)seqidno.:14的輕鏈cdr3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含包含seqidno.:7的氨基酸序列的可變重鏈和包含seqidno.:8的氨基酸序列的可變輕鏈；和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含包含seqidno.:15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供一種雙特異性抗體，其包含seqidno.:18，seqidno.:19和seqidno.:20。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種雙特異性抗體，其包含seqidno.:17，seqidno.:19和seqidno.:20。在另一個(gè)方面，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含與seqidno.:7的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重鏈可變域(vh)序列，和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:15的可變重鏈和seqidno.:16的可變輕鏈。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的vh序列相對(duì)于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體保留結(jié)合fap和dr5的能力。在某些實(shí)施方案中，在seqidno.:7中替代，插入和/或刪除總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，替代，插入，或刪除發(fā)生在hvr以外的區(qū)域中(即在fr中)。任選地，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含seqidno.:7中的vh序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)方面，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含與seqidno.:8的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的輕鏈可變域(vl)序列，和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:15的可變重鏈和seqidno.:16的可變輕鏈。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的vl序列相對(duì)于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體保留結(jié)合dr5和fap的能力。在某些實(shí)施方案中，在seqidno.:8中替代，插入和/或刪除總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，替代，插入，或刪除發(fā)生在hvr以外的區(qū)域中(即在fr中)。任選地，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含seqidno:8中的vl序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)方面，提供結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:8的可變輕鏈和seqidno.:7的可變重鏈；和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含與seqidno.:15的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重鏈可變域(vh)序列。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的vh序列相對(duì)于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體保留結(jié)合fap和dr5的能力。在某些實(shí)施方案中，在seqidno.:15中替代，插入和/或刪除總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，替代，插入，或刪除發(fā)生在hvr以外的區(qū)域中(即在fr中)。任選地，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含seqidno.:15中的vh序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)方面，提供結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含至少一個(gè)對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:8的可變輕鏈和seqidno.:7的可變重鏈，和至少一個(gè)對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其包含與seqidno.:16的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的輕鏈可變域(vl)。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的vl序列相對(duì)于參照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或刪除，但是包含該序列的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體保留結(jié)合dr5和fap的能力。在某些實(shí)施方案中，在seqidno.:16中替代，插入和/或刪除總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，替代，插入，或刪除發(fā)生在hvr以外的區(qū)域中(即在fr中)。任選地，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含seqidno:16中的vl序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)方面，提供結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體，其中該抗體包含上文提供的任何實(shí)施方案中的vh和上文提供的任何實(shí)施方案中的vl。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含分別在seqidno:7和seqidno:8，及seqidno:15和seqidno:16中的vh和vl序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體為單克隆抗體，包括嵌合，人源化或人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的所述結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體為人抗體。c.結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體的例示性型式在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含抗體片段，例如fv，fab，fab’，scfv，xfab，scfab，雙抗體，或f(ab’)2片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含全長抗體，例如完整igg1抗體或本文中定義的其它抗體類或同種型。依照本發(fā)明的雙特異性抗體至少是二價(jià)的且可以是三價(jià)的或多價(jià)的，例如四價(jià)的或六價(jià)的。本發(fā)明的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，至少一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和至少一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，至少一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和至少一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段經(jīng)重鏈(vhch1)連接至該fc域的第一或第二亞基。在任何實(shí)施方案中，fab片段可以直接或經(jīng)由包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸，通常約2-20個(gè)氨基酸的肽接頭融合至fc域或彼此融合。肽接頭是本領(lǐng)域已知的，而且本文中有描述。合適的非免疫原性肽接頭包括例如(g4s)n，(sg4)n，(g4s)n或g4(sg4)n肽接頭。“n”一般為1和10之間，通常2和4之間的數(shù)值。一種對(duì)于將第一和第二抗原結(jié)合模塊的fab輕鏈彼此融合特別合適的肽接頭為(g4s)2。一種適合于連接第一和第二抗原結(jié)合模塊的fab重鏈的例示性肽接頭為epksc(d)-(g4s)2。另外，接頭可以包含(部分)免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。特別地，在抗原結(jié)合模塊融合至fc域亞基的n末端的情況中，它可以經(jīng)免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或其部分融合，有或無另外的肽接頭。優(yōu)選地，所述雙特異性抗體是四價(jià)的，具有兩個(gè)各自分別靶向fap和dr5的結(jié)合位點(diǎn)(2+2型式)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是四價(jià)的，具有三個(gè)針對(duì)dr5的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)針對(duì)fap的結(jié)合位點(diǎn)(3+1型式)。3+1型式可以例如經(jīng)由將一個(gè)靶向fap的fab片段和一個(gè)靶向dr5的fab片段融合至具有兩個(gè)dr5結(jié)合位點(diǎn)的igg分子的重鏈的c末端來實(shí)現(xiàn)。這在下文更加詳細(xì)地描繪。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是三價(jià)的(2+1型式)，具有兩個(gè)各自靶向dr5的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)靶向fap的結(jié)合位點(diǎn)。2+1型式可以例如經(jīng)由將一個(gè)靶向fap的fab片段融合至具有兩個(gè)dr5結(jié)合位點(diǎn)的igg分子的重鏈的c末端來實(shí)現(xiàn)，其中第一抗體的fc部分是依照下文描述的節(jié)入穴策略修飾的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是二價(jià)的(1+1型式)，即對(duì)dr5和fap每項(xiàng)是單價(jià)的。本發(fā)明的二價(jià)抗體具有一個(gè)靶向dr5的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)靶向fap的結(jié)合位點(diǎn)。1+1型式可以例如通過schaeferetal。procnatlacadsciusa2011；108:11187-92中描述和下文描繪的crossmab技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。其中提供的是包含依照任何上述實(shí)施方案的任何序列的結(jié)合dr5和fap的不同雙特異性抗體型式。1.2+2型式的雙特異性dr5-fap抗體在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。既然上述雙特異性抗體對(duì)fap和dr5二者是二價(jià)的，具有各2個(gè)針對(duì)fap和dr5的結(jié)合位點(diǎn)，那么這種型式也稱作“2+2”型式。圖1中描繪具有2+2型式的雙特異性抗體的例示性結(jié)構(gòu)。由于可變區(qū)或恒定區(qū)任一的交換，上述fab片段也稱作“cross-fab片段”或“xfab片段”或“交換fab片段”。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中全部?jī)蓚€(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中全部?jī)蓚€(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中全部?jī)蓚€(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中全部?jī)蓚€(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。由于fab重和輕鏈的可變區(qū)的交換，對(duì)fap特異性的交換fab片段各自包含由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的肽鏈，和由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的肽鏈。這些交換fab片段也稱作crossfab(vlvh)且各自包含vlch1和vhcl鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中全部?jī)蓚€(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)各自包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中全部?jī)蓚€(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。由于fab重和輕鏈的恒定區(qū)的交換，對(duì)fap特異性的交換fab片段各自包含由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的肽鏈，和由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的肽鏈。這些交換fab片段也稱作crossfab(clch1)且包含vhcl和vlch1鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的所述結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，對(duì)其兩個(gè)fab片段融合至n末端且兩個(gè)fab片段融合至c末端，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)fab片段經(jīng)由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)融合至fc域的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)為人igg1鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段和fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子為igg類免疫球蛋白。在一個(gè)甚至更加特定的實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg1亞類免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg4亞類免疫球蛋白。在又一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段經(jīng)肽接頭連接至fc域。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段經(jīng)肽接頭連接至fc域的第一或第二亞基的c末端。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，所述包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段經(jīng)肽接頭連接至fc域的第二亞基(ch3鏈)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的所述結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(即兩個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的，其中兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段在可變重鏈(vh)的n末端處融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段在恒定重鏈(ch1)的c末端處融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段在恒定重鏈(ch1)的c末端處融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段通過肽接頭，優(yōu)選具有約10-30個(gè)氨基酸的長度的肽接頭融合至igg分子。優(yōu)選地，所述肽接頭為(g4s)2或(g4s)4接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段通過肽接頭在恒定重鏈(ch1)的c末端處融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段通過肽接頭在可變重鏈(vh)的n末端處融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和兩個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段經(jīng)重鏈(vhch1)融合至fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含：a)一個(gè)fc域，b)兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中所述fab片段在恒定重鏈(ch1)的c末端處連接至fc域的第一或第二亞基，和c)兩個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中兩個(gè)fab片段在可變重鏈(vh)的n末端處連接至fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體包含a)一個(gè)fc域，b)兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中所述fab片段在恒定重鏈(ch1)的c末端處連接至fc域的第一亞基的n末端，和c)兩個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中兩個(gè)fab片段在可變輕鏈(vl)的n末端處連接至fc域的第二亞基(ch3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段各自經(jīng)由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)融合至fc域。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)為人igg1鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段和fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子為igg類免疫球蛋白。在一個(gè)甚至更加特定的實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg1亞類免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg4亞類免疫球蛋白。在又一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段經(jīng)肽接頭連接至fc域。例示性的具有2+2型式的抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:1的重鏈cdr1；seqidno.:2的重鏈cdr2；seqidno.:3的重鏈cdr3；seqidno.:4的輕鏈cdr1；seqidno.:5的輕鏈cdr2；seqidno.:6的輕鏈cdr3；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含seqidno.:9的重鏈cdr1；seqidno.:10的重鏈cdr2；seqidno.:11的重鏈cdr3；seqidno.:12的輕鏈cdr1；seqidno.:13的輕鏈cdr2；seqidno.:14的輕鏈cdr3；其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:1的重鏈cdr1；seqidno.:2的重鏈cdr2；seqidno.:3的重鏈cdr3；seqidno.:4的輕鏈cdr1；seqidno.:5的輕鏈cdr2；和seqidno.:6的輕鏈cdr3；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含seqidno.:9的重鏈cdr1；seqidno.:10的重鏈cdr2；seqidno.:11的重鏈cdr3；seqidno.:12的輕鏈cdr1；seqidno.:13的輕鏈cdr2；和seqidno.:14的輕鏈cdr3；其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:7的可變重鏈和seqidno.:8的可變輕鏈；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含包含seqidno.:15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:7的可變重鏈和seqidno.:8的可變輕鏈；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含包含seqidno.:15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述雙特異性抗體包含igg分子的fc部分中的修飾，如下文描繪的。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有上文所述2+2型式的雙特異性抗體，其包含兩個(gè)seqidno.:18的vh(dr5)-fc部分-vh(fap)-cl鏈，兩個(gè)seqidno.:19的vl(dr5)-卡帕輕鏈和兩個(gè)seqidno.:20的vlch1(fap)鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有如上所述2+2型式的雙特異性抗體，其包含兩個(gè)seqidno.:17的vh(dr5)-fc部分-vh(fap)-cl鏈，兩個(gè)seqidno.:19的vl(dr5)-卡帕輕鏈和兩個(gè)seqidno.:20的vlch1(fap)鏈。2.2+1型式的雙特異性dr5-fap抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。既然上述雙特異性抗體是三價(jià)的，具有一個(gè)針對(duì)fap的結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)針對(duì)dr5的結(jié)合位點(diǎn)，那么這種型式也稱作“2+1”型式。因此，這節(jié)中提供的雙特異性抗體對(duì)dr5是二價(jià)的且對(duì)fap是單價(jià)的。由于可變區(qū)或恒定區(qū)任一的交換，上述fab片段也稱作“cross-fab片段”或“xfab片段”或“交換fab片段”。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。由于fab重和輕鏈的可變區(qū)的交換，對(duì)fap特異性的交換fab片段各自包含由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的肽鏈，和由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的肽鏈。這些交換fab片段也稱作crossfab(vlvh)且包含vlch1和vhcl鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，兩個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中全部?jī)蓚€(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。由于fab重和輕鏈的恒定區(qū)的交換，對(duì)fap特異性的交換fab片段各自包含由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的肽鏈，和由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的肽鏈。這些交換fab片段也稱作crossfab(clch1)且包含vhcl和vlch1鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的所述結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，對(duì)其兩個(gè)fab片段融合至n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)fab片段經(jīng)由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)融合至fc域的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)為人igg1鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子為igg類免疫球蛋白。在一個(gè)甚至更加特定的實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg1亞類免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg4亞類免疫球蛋白。在又一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。有fap結(jié)合物融合至c末端的2+1型式的雙特異性dr5-fap抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段和fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段經(jīng)肽接頭融合至fc域的第一或第二亞基的c末端。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，所述包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段經(jīng)肽接頭融合至fc域的第二亞基(ch3鏈)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的，其中fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)的所述對(duì)fap特異性的fab片段融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)的所述fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)的所述對(duì)fap特異性的fab片段融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)的所述fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，和b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中fab片段融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)的所述fab片段對(duì)fap特異性的融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fab片段ofb)融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。有fap結(jié)合物融合至n末端的2+1型式的雙特異性dr5-fap抗體在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段和fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，另一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段經(jīng)肽接頭融合至igg分子的包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中對(duì)fap特異性的fab片段為crossfab片段(即重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的)；和b)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中對(duì)fap特異性的fab片段為crossfab(vlvh)片段(即重和輕鏈的可變區(qū)是交換的)；和b)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中對(duì)fap特異性的fab片段為crossfab(clch1)片段(即重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的)；和b)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中對(duì)fap特異性的fab片段為crossfab片段(即重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的)；和b)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段，其中所述fab片段融合至igg分子的可變重或輕鏈的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中對(duì)fap特異性的fab片段為crossfab(vlvh)片段(即重和輕鏈的可變區(qū)是交換的)；和b)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段，其中所述fab片段融合至igg分子的可變重或輕鏈的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)的對(duì)dr5特異性的fab片段融合至a)的對(duì)dr5特異性的fab片段的可變重或輕鏈的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中對(duì)fap特異性的fab片段為crossfab(clch1)片段(即重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的)；和b)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段，其中所述fab片段融合至igg分子的可變重或輕鏈的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)的對(duì)dr5特異性的fab片段融合至a)的對(duì)dr5特異性的fab片段的可變重或輕鏈的n末端。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)dr5特異性的fab片段通過肽接頭融合至igg分子，優(yōu)選具有約10–30個(gè)氨基酸的長度的肽接頭。優(yōu)選地，所述肽接頭為(g4s)2或(g4s)4接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中所述本發(fā)明的雙特異性抗體包含igg分子的fc部分中的修飾，如下文描繪的。3.3+1型式的雙特異性dr5-fap抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：一個(gè)fc域，三個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。既然上述雙特異性抗體是四價(jià)的，具有一個(gè)針對(duì)fap的結(jié)合位點(diǎn)和三個(gè)針對(duì)dr5的結(jié)合位點(diǎn)，那么這種型式也稱作“3+1”型式。因此，這節(jié)中描述的雙特異性分子對(duì)dr5是三價(jià)的且對(duì)fap是單價(jià)的。由于可變區(qū)或恒定區(qū)任一的交換，上述fab片段也稱作“cross-fab片段”或“xfab片段”或“交換fab片段”。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，三個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，三個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。由于fab重和輕鏈的可變區(qū)的交換，對(duì)fap特異性的交換fab片段包含由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的肽鏈，和由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的肽鏈。這種交換fab片段也稱作crossfab(vlvh)且包含vlch1和vhcl鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，三個(gè)各自包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。由于fab重和輕鏈的恒定區(qū)的交換，對(duì)fap特異性的交換fab片段各自包含由重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈恒定區(qū)(cl)構(gòu)成的肽鏈，和由輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈恒定區(qū)(ch1)構(gòu)成的肽鏈。這種交換fab片段也稱作crossfab(clch1)且包含vhcl和vlch1鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的所述結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，對(duì)其兩個(gè)fab片段融合至n末端且兩個(gè)fab片段融合至c末端，其中一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)fab片段經(jīng)由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)融合至fc域的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)為人igg1鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段和fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子為igg類免疫球蛋白。在一個(gè)甚至更加特定的實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg1亞類免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg4亞類免疫球蛋白。在又一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；和c)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的；和c)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段。任選地，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的；和c)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的；和c)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段，其中b)和c)的fab片段融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)和c)的所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的；和c)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段，其中b)和c)的fab片段融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)和c)的所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)(fab片段)的免疫球蛋白g(igg)分子，b)一個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，和c)一個(gè)對(duì)dr5特異性的fab片段，其中b)和c)的fab片段融合至所述igg分子的fc域的第一或第二亞基。在一個(gè)實(shí)施方案中，b)和c)的所述兩個(gè)fab片段融合至所述igg分子的fc域的第二亞基(ch3)的c末端。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這節(jié)中描述的任何實(shí)施方案的b)和c)的兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至igg分子，優(yōu)選具有約10–30個(gè)氨基酸的長度的肽接頭。優(yōu)選地，所述肽接頭為(g4s)2或(g4s)4接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述本發(fā)明的雙特異性抗體包含igg分子的fc部分中的修飾，如下文描繪的。4.1+1型式的雙特異性dr5-fap抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。既然上述雙特異性抗體是二價(jià)的，具有一個(gè)針對(duì)fap的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)針對(duì)dr5的結(jié)合位點(diǎn)，那么這種型式也稱作“1+1”型式。因此，這節(jié)中描述的雙特異性抗體對(duì)dr5是單價(jià)的且對(duì)fap是單價(jià)的。由于可變區(qū)或恒定區(qū)任一的交換，上述fab片段也稱作“cross-fab片段”或“xfab片段”或“交換fab片段”。1+1型式的igg分子也稱作crossmab型式(參見schaeferetal.,procnatlacadsciusa2011；108:11187-92)。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：一個(gè)fc域，一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：一個(gè)fc域，一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：一個(gè)fc域，一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：一個(gè)fc域，一個(gè)包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，和一個(gè)包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，其中包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段的重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的所述結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)fc域，對(duì)其兩個(gè)fab片段融合至n末端，其中至少一個(gè)fab片段的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)fab片段經(jīng)由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)融合至fc域的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)為人igg1鉸鏈區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含對(duì)dr5特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段，包含對(duì)fap特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的fab片段和fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子為igg類免疫球蛋白。在一個(gè)甚至更加特定的實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg1亞類免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白為igg4亞類免疫球蛋白。在又一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中igg分子的一個(gè)臂(fab片段)的重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中igg分子的一個(gè)臂(fab片段)的重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。這種抗體型式也稱作crossmab(vhvl)。在一個(gè)實(shí)施方案中，igg分子的包含對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)臂(fab片段)的重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中igg分子的一個(gè)臂(fab片段)的重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。這種抗體型式也稱作crossmab(ch1cl)。在一個(gè)實(shí)施方案中，igg分子的包含對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)臂(fab片段)的重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)具有一個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)對(duì)fap特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中igg分子的一個(gè)臂(fab片段)的整個(gè)vh-ch1和vl-cl域是交換的。這意味著至少一個(gè)fab片段經(jīng)輕鏈(vlcl)融合至fc域的n末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，另一個(gè)fab片段經(jīng)重鏈(vhch1)融合至fc域的n末端。這種抗體型式也稱作crossmabfab。在一個(gè)實(shí)施方案中，全部?jī)蓚€(gè)fab片段經(jīng)由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)融合至fc域的n末端。d.降低fc受體結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的fc域修飾在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc部分是經(jīng)過修飾的。經(jīng)過修飾的fc部分具有與野生型fc部分相比降低的對(duì)fcγ受體的結(jié)合親和力。本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域由一對(duì)包含免疫球蛋白分子重鏈域的多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白g(igg)分子的fc域是二聚體，其每個(gè)亞基包含ch2和ch3igg重鏈恒定域。fc域的兩個(gè)亞基能夠彼此穩(wěn)定聯(lián)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域是iggfc域。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，fc域是igg1fc域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，fc域是igg4fc域。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，fc域是包含位置s228(kabat編號(hào)方式)處的氨基酸替代，特別是氨基酸替代s228p的igg4fc域。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，fc域是包含氨基酸替代l235e和s228p和p329g的igg4fc域。此氨基酸替代降低igg4抗體的體內(nèi)fab臂交換(參見stubenrauch等,drugmetabolismanddisposition38,84-91(2010))。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，fc域是人的。fc域賦予本發(fā)明的雙特異性抗體以有利的藥動(dòng)學(xué)特性，包括長血清半衰期，其有助于在靶組織中的較好積累和有利的組織-血液分配比。然而，同時(shí)它可能導(dǎo)致不想要的本發(fā)明的雙特異性抗體對(duì)表達(dá)fc受體的細(xì)胞而非優(yōu)選的攜帶抗原的細(xì)胞的靶向。因而，在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域展現(xiàn)出與天然igg1fc域相比降低的對(duì)fc受體的結(jié)合親和力和/或降低的效應(yīng)器功能。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，fc域(或包含所述fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)展現(xiàn)出與天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)相比少于50％，優(yōu)選少于20％，更優(yōu)選少于10％且最優(yōu)選少于5％的對(duì)fc受體的結(jié)合親和力，和/或與天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)相比少于50％，優(yōu)選少于20％，更優(yōu)選少于10％且最優(yōu)選少于5％的效應(yīng)器功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，fc域(或包含所述fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)沒有實(shí)質(zhì)性結(jié)合fc受體和/或誘導(dǎo)效應(yīng)器功能。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述fc受體是fcγ受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fc受體是人fc受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fc受體是活化性fc受體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述fc受體是活化性人fcγ受體，更具體地是人fcγriiia，fcγri或fcγriia，最具體地是人fcγriiia。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fc受體是抑制性fc受體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述fc受體是抑制性人fcγ受體，更具體地是人fcγriiib。在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)器功能是cdc，adcc，adcp，和細(xì)胞因子分泌中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述效應(yīng)器功能是adcc。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fc域展現(xiàn)出與天然igg1fc域相比基本相似的對(duì)新生兒fc受體(fcrn)的結(jié)合親和力。當(dāng)fc域(或包含所述fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)展現(xiàn)出超過約70％，特別是超過約80％，更特別是超過約90％的天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)對(duì)fcrn的結(jié)合親和力時(shí)，實(shí)現(xiàn)基本相似的對(duì)fcrn的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，fc域工程化改造為具有與非工程化fc域相比降低的對(duì)fc受體的結(jié)合親和力和/或降低的效應(yīng)器功能。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域包含一處或多處降低fc域?qū)c受體的結(jié)合親和力和/或效應(yīng)器功能的氨基酸突變。通常，fc域的兩個(gè)亞基的每一個(gè)中存在相同的一處或多處氨基酸突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸突變降低fc域?qū)c受體的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸突變將fc域?qū)c受體的結(jié)合親和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。在有超過一處降低fc域?qū)c受體的結(jié)合親和力的氨基酸突變的實(shí)施方案中，這些氨基酸突變的組合可以將fc域?qū)c受體的結(jié)合親和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含工程化fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體展現(xiàn)出與包含非工程化fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體相比少于20％，特別是少于10％，更特別是少于5％的對(duì)fc受體的結(jié)合親和力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述fc受體是fcγ受體。在一些實(shí)施方案中，所述fc受體是人fc受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fc受體是抑制性fc受體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述fc受體是抑制性人fcγ受體，更具體地是人fcgriib。在一些實(shí)施方案中，所述fc受體是活化性fc受體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述fc受體是活化性人fcγ受體，更特別是人fcγriiia，fcγri或fcγriia，最特別是人fcγriiia。優(yōu)選地，對(duì)這些受體的每一種的結(jié)合是降低的。在一些實(shí)施方案中，對(duì)補(bǔ)體成分的結(jié)合親和力，特別是對(duì)c1q的結(jié)合親和力也是降低的。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)新生兒fc受體(fcrn)的結(jié)合親和力沒有降低。當(dāng)fc域(或包含所述fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)展現(xiàn)出非工程化形式的fc域(或包含所述非工程化形式的fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)對(duì)fcrn的結(jié)合親和力的超過約70％時(shí)，實(shí)現(xiàn)基本相似的對(duì)fcrn的結(jié)合，即保留該fc域?qū)λ鍪荏w的結(jié)合親和力。fc域或包含所述fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體可以展現(xiàn)出超過約80％和甚至超過約90％的此類親和力。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域工程化改造為具有與非工程化fc域相比降低的效應(yīng)器功能。所述降低的效應(yīng)器功能可包括但不限于下列一項(xiàng)或多項(xiàng)：降低的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)，降低的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)，降低的抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)，降低的細(xì)胞因子分泌，降低的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原攝取，降低的對(duì)nk細(xì)胞的結(jié)合，降低的對(duì)巨噬細(xì)胞的結(jié)合，降低的對(duì)單核細(xì)胞的結(jié)合，降低的對(duì)多形核細(xì)胞的結(jié)合，降低的誘導(dǎo)凋亡的直接信號(hào)傳導(dǎo)，降低的樹突細(xì)胞成熟，或降低的t細(xì)胞引發(fā)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述降低的效應(yīng)器功能是降低的cdc，降低的adcc，降低的adcp，和降低的細(xì)胞因子分泌中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述降低的效應(yīng)器功能是降低的adcc。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述降低的adcc小于20％的由非工程化fc域(或包含非工程化fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體)誘導(dǎo)的adcc。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述降低fc域?qū)c受體的結(jié)合親和力和/或效應(yīng)器功能的氨基酸突變是氨基酸替代。在一個(gè)實(shí)施方案中，fc域包含在e233，l234，l235，n297，p331和p329位置處的氨基酸替代。在一個(gè)更特定的實(shí)施方案中，fc域包含在l234，l235和p329位置處的氨基酸替代。在一些實(shí)施方案中，fc域包含氨基酸替代l234a和l235a。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，fc域是igg1fc域，特別是人igg1fc域。在一個(gè)實(shí)施方案中，fc域包含在位置p329處的氨基酸替代。在一個(gè)更加特定的實(shí)施方案中，氨基酸替代是p329a或p329g，特別是p329g。在一個(gè)實(shí)施方案中，fc域包含在位置p329處的氨基酸替代和在選自以下的位置處的又一處氨基酸替代：e233，l234，l235，n297和p331。在一個(gè)更加特定的實(shí)施方案中，所述又一處氨基酸替代是e233p，l234a，l235a，l235e，n297a，n297d或p331s。在具體的實(shí)施方案中，所述fc域包含在位置p329，l234和l235處的氨基酸替代。在更具體的實(shí)施方案中，所述fc域包含氨基酸突變l234a，l235a和p329g(“p329glala”)。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，fc域是igg1fc域，特別是人igg1fc域。氨基酸替代組合“p329glala”幾乎完全消除了人igg1fc域的fcγ受體結(jié)合，如記載于wo2012/130831，其通過提述完整并入本文。wo2012/130831還描述了制備此類突變體fc域的方法和用于測(cè)定其特性(諸如fc受體結(jié)合或效應(yīng)器功能)的方法。igg4抗體展現(xiàn)出與igg1抗體相比降低的對(duì)fc受體的結(jié)合親和力和降低的效應(yīng)器功能。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域是igg4fc域，特別是人igg4fc域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述igg4fc域包含在位置s228處的氨基酸替代，具體是氨基酸替代s228p。為了進(jìn)一步降低其對(duì)fc受體的結(jié)合親和力和/或其效應(yīng)器功能，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述igg4fc域包含在位置l235處的氨基酸替代，具體是氨基酸替代l235e。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述igg4fc域包含在位置p329處的氨基酸替代，具體是氨基酸替代p329g。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述igg4fc域包含在位置s228，l235和p329處的氨基酸替代，具體是氨基酸替代s228p，l235e和p329g。此類igg4fc域突變體及其fcγ受體結(jié)合特性記載于wo2012/130831，其通過提述完整并入本文。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，展現(xiàn)出與天然igg1fc域相比降低的對(duì)fc受體的結(jié)合親和力和/或降低的效應(yīng)器功能的fc域是包含氨基酸替代l234a，l235a和任選地p329g的人igg1fc域，或包含氨基酸替代s228p，l235e和任選地p329g的人igg4fc域。在某些實(shí)施方案中，已消除fc域的n-糖基化。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，所述fc域包含在位置n297處的氨基酸突變，特別是用丙氨酸(n297a)或天冬氨酸(n297d)替換天冬酰胺的氨基酸替代。在上文和wo2012/130831中描述的fc域以外，具有降低的fc受體結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的fc域還包括那些具有fc域殘基238，265，269，270，297，327和329中一個(gè)或多個(gè)的替代的(美國專利no.6,737,056)。此類fc突變體包括具有在氨基酸位置265，269，270，297和327中的兩個(gè)或更多個(gè)處的替代的fc突變體，包括所謂的“dana”fc突變體，其具有殘基265和297變成丙氨酸的替代(美國專利no.7,332,581)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的遺傳或化學(xué)方法通過氨基酸刪除，替代，插入或修飾來制備突變體fc域。遺傳方法可以包括編碼dna序列的位點(diǎn)特異性誘變，pcr，基因合成等。正確的核苷酸變化可以通過例如測(cè)序來驗(yàn)證?？梢匀菀椎販y(cè)定對(duì)fc受體的結(jié)合，例如通過elisa或通過使用標(biāo)準(zhǔn)儀器諸如biacore儀(gehealthcare)的表面等離振子共振(spr)進(jìn)行，并且fc受體諸如可通過重組表達(dá)獲得。本文中描述了一種合適的此類結(jié)合測(cè)定法?；蛘?，可使用已知表達(dá)特定fc受體的細(xì)胞系，如表達(dá)fcγiiia受體的人nk細(xì)胞來評(píng)估fc域或包含fc域的細(xì)胞活化性雙特異性抗原結(jié)合分子對(duì)fc受體的結(jié)合親和力。可通過本領(lǐng)域中已知的方法來測(cè)量fc域或包含fc域的本發(fā)明的雙特異性抗體的效應(yīng)器功能。評(píng)估感興趣分子的adcc活性的體外測(cè)定法的例子記載于美國專利no.5,500,362；hellstrom等，procnatlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等,procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美國專利no.5,821,337；bruggemann等,jexpmed166,1351-1361(1987)?；蛘撸刹捎梅欠派湫詼y(cè)定方法(參見例如用于流式細(xì)胞術(shù)的actitm非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定法(celltechnology,inc.mountainview,ca)；和cytotox非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定法(promega,madison,wi))。對(duì)于此類測(cè)定法有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細(xì)胞?；蛘?另外，可體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的adcc活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如披露于clynes等,procnatlacadsciusa95,652-656(1998)的。在一些實(shí)施方案中，fc域?qū)ρa(bǔ)體成分(特別是對(duì)c1q)的結(jié)合是降低的。因而，在fc域工程化為具有降低的效應(yīng)器功能的一些實(shí)施方案中，所述降低的效應(yīng)器功能包括降低的cdc。可實(shí)施c1q結(jié)合測(cè)定法來測(cè)定本發(fā)明的雙特異性抗體是否能夠結(jié)合c1q并因此具有cdc活性。參見例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c結(jié)合elisa。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可實(shí)施cdc測(cè)定法(參見例如gazzano-santoro等,jimmunolmethods202,163(1996)；cragg等,blood101,1045-1052(2003)；以及cragg和glennie,blood103,2738-2743(2004))。下面的部分描述本發(fā)明的雙特異性抗體的優(yōu)選實(shí)施方案，其包含降低fc受體結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的fc域修飾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc域展現(xiàn)與天然igg1fc域相比降低的對(duì)fc受體的結(jié)合親和力和/或降低的效應(yīng)器功能；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc域包含一處或多處降低對(duì)fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中所述一處或多處氨基酸替代在l234，l235，和p329中的一個(gè)或多個(gè)位置處；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白g(igg)分子，其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:1的重鏈cdr1；seqidno.:2的重鏈cdr2；seqidno.:3的重鏈cdr3；seqidno.:4的輕鏈cdr1；seqidno.:5的輕鏈cdr2；和seqidno.:6的輕鏈cdr3；其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性和抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含seqidno.:9的重鏈cdr1；seqidno.:10的重鏈cdr2；seqidno.:11的重鏈cdr3；seqidno.:12的輕鏈cdr1；seqidno.:13的輕鏈cdr2；和seqidno.:14的輕鏈cdr3；其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:1的重鏈cdr1；seqidno.:2的重鏈cdr2；seqidno.:3的重鏈cdr3；seqidno.:4的輕鏈cdr1；seqidno.:5的輕鏈cdr2；和seqidno.:6的輕鏈cdr3；其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含seqidno.:9的重鏈cdr1；seqidno.:10的重鏈cdr2；seqidno.:11的重鏈cdr3；seqidno.:12的輕鏈cdr1；seqidno.:13的輕鏈cdr2；和seqidno.:14的輕鏈cdr3；其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:1的重鏈cdr1；seqidno.:2的重鏈cdr2；seqidno.:3的重鏈cdr3；seqidno.:4的輕鏈cdr1；seqidno.:5的輕鏈cdr2；seqidno.:6的輕鏈cdr3；其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含seqidno.:9的重鏈cdr1；seqidno.:10的重鏈cdr2；seqidno.:11的重鏈cdr3；seqidno.:12的輕鏈cdr1；seqidno.:13的輕鏈cdr2；和seqidno.:14的輕鏈cdr3；其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含：a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:7的可變重鏈和seqidno.:8的可變輕鏈；其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含包含seqidno.:15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中重和輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)任一是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:7的可變重鏈和seqidno.:8的可變輕鏈；其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g，和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含包含seqidno.:15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中fab重和輕鏈的恒定區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含a)一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，該免疫球蛋白g(igg)分子具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其包含seqidno.:7的可變重鏈和seqidno.:8的可變輕鏈；其中fc域的每個(gè)亞基包含三處降低對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g；和b)兩個(gè)對(duì)fap特異性的fab片段，其包含包含seqidno.:15的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中fab重和輕鏈的可變區(qū)是交換的，其中兩個(gè)fab片段通過肽接頭融合至所述igg分子的恒定重鏈。e.促進(jìn)異二聚化的fc域修飾本發(fā)明的雙特異性dr5-fap抗體包含不同的抗原結(jié)合模塊，其融合至fc域的兩個(gè)亞基之一個(gè)或另一個(gè)，如此fc域的兩個(gè)亞基通常包含在兩條不相同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表達(dá)和隨后二聚化導(dǎo)致兩種多肽的數(shù)種可能組合。為了改進(jìn)重組生產(chǎn)中本發(fā)明的雙特異性抗體的產(chǎn)率和純度，如此在本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域中引入促進(jìn)期望多肽聯(lián)合的修飾會(huì)是有利的。因而，在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域包含促進(jìn)fc域的第一和第二亞基聯(lián)合的修飾。人iggfc域的兩個(gè)亞基之間最廣泛的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)在fc域的ch3域中。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾在fc域的ch3域中。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述修飾是所謂的“節(jié)-入-穴”修飾，其包含在fc域的兩個(gè)亞基之一中的“節(jié)”修飾和在fc域的兩個(gè)亞基之另一中的“穴”修飾。節(jié)-入-穴技術(shù)記載于例如us5,731,168；us7,695,936；ridgway等,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)。一般地，該方法牽涉在第一多肽的界面處引入隆起(“節(jié)”)并在第二多肽的界面中引入相應(yīng)的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中從而促進(jìn)異二聚體形成并阻礙同二聚體形成。通過將來自第一多肽界面的小氨基酸側(cè)鏈用更大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換來構(gòu)建隆起。在第二多肽的界面中創(chuàng)建具有與隆起相同或相似大小的互補(bǔ)性空腔，其通過將大氨基酸側(cè)鏈用更小的氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換進(jìn)行。因而，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的雙特異性抗體的fc域的第一亞基的ch3域中，一個(gè)氨基酸殘基用具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第一亞基的ch3域內(nèi)生成隆起，其可安置于第二亞基的ch3域內(nèi)的空腔中，而且在fc域的第二亞基的ch3域中，一個(gè)氨基酸殘基用具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第二亞基的ch3域內(nèi)生成空腔，其中可安置第一亞基的ch3域內(nèi)的隆起。可以通過改變編碼多肽的核酸，例如通過位點(diǎn)特異性誘變或通過肽合成來生成隆起和空腔。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，在fc域第一亞基的ch3域中，第366位的蘇氨酸殘基用色氨酸殘基替換(t366w)，而在fc域第二亞基的ch3域中，第407位的酪氨酸殘基用纈氨酸殘基替換(y407v)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在fc域第二亞基中，另外，第366位的蘇氨酸殘基用絲氨酸殘基替換(t366s)且第368位的亮氨酸殘基用丙氨酸殘基替換(l368a)。在還有又一個(gè)實(shí)施方案中，在fc域的第一亞基中，另外，第354位的絲氨酸殘基用半胱氨酸殘基替換(s354c)，而在fc域的第二亞基中，另外，第349位的酪氨酸殘基用半胱氨酸殘基替換(y349c)。這兩個(gè)半胱氨酸殘基的引入導(dǎo)致在fc域的兩個(gè)亞基之間形成二硫橋，進(jìn)一步穩(wěn)定了二聚體(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，促進(jìn)fc域的第一和第二亞基聯(lián)合的修飾包含介導(dǎo)靜電操縱效應(yīng)(electrostaticsteeringeffect)的修飾，例如如記載于wo2009/089004的。一般地，此方法涉及將在兩個(gè)fc域亞基界面處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換為帶電荷的氨基酸殘基，從而在靜電上不利于同二聚體形成而在靜電上有利于異二聚化。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照任何上述實(shí)施方案的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體包含一個(gè)免疫球蛋白g(igg)分子，其具有兩個(gè)對(duì)dr5特異性的結(jié)合位點(diǎn)，其中第一重鏈的fc部分包含第一二聚化模塊且第二重鏈的fc部分包含第二二聚化模塊，容許igg分子的兩條重鏈異二聚化。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照節(jié)入穴策略(參見carterp.；ridgwayj.b.b.；prestal.g.:immunotechnology,volume2,number1,february1996,pp.73-73(1))，第一二聚化模塊包含節(jié)且第二二聚化模塊包含穴。f.核酸序列，載體和生產(chǎn)方法編碼能夠結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體的多核苷酸可用于它的生產(chǎn)。編碼本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的多核苷酸可以作為編碼完整雙特異性抗原結(jié)合分子或完整結(jié)合dr5的抗體的單條多核苷酸或作為多條(例如兩條或更多條)共表達(dá)的多核苷酸來表達(dá)。由共表達(dá)的多核苷酸編碼的多肽可經(jīng)由例如二硫鍵或其它手段聯(lián)合以形成功能性雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體。例如，fab片段的輕鏈部分可以與雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體中包含fab片段的重鏈部分，fc域亞基和任選(部分)另一個(gè)fab片段的部分由分開的多核苷酸編碼。當(dāng)共表達(dá)時(shí)，重鏈多肽會(huì)與輕鏈多肽聯(lián)合以形成fab片段。又例如，本文中提供的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體中包含兩個(gè)fc域亞基中的一個(gè)和任選(部分)一個(gè)或多個(gè)fab片段的部分可以與本文中提供的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體中包含兩個(gè)fc域亞基中的另一個(gè)和任選(部分)fab片段的部分由分開的多核苷酸編碼。當(dāng)共表達(dá)時(shí)，fc域亞基會(huì)聯(lián)合以形成fc域。在某些實(shí)施方案中，所述多核苷酸或核酸為dna。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸為rna，例如信使rna(mrna)的形式。本發(fā)明的rna可以是單鏈的或雙鏈的。g.抗體變體在某些實(shí)施方案中，在上文描述的那些以外，還涵蓋本文中提供的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的氨基酸序列變體。例如，可以期望改善雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性?？梢酝ㄟ^將合適的修飾引入編碼雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的核苷酸序列中，或者通過肽合成來制備雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如對(duì)抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基的刪除，和/或插入和/或替代?？梢赃M(jìn)行刪除，插入，和替代的任何組合以得到最終的構(gòu)建體，只要最終的構(gòu)建體擁有期望的特征，例如抗原結(jié)合。1.替代，插入，和刪除變體在某些實(shí)施方案中，提供了具有一處或多處氨基酸替代的抗體變體。替代誘變感興趣的位點(diǎn)包括hvr和fr。保守替代在表b中在“保守替代”的標(biāo)題下顯示。更實(shí)質(zhì)的變化在表b中在“例示性替代”的標(biāo)題下提供，并且如下文參照氨基酸側(cè)鏈類別進(jìn)一步描述的?？梢詫被崽娲敫信d趣的抗體中，并且對(duì)產(chǎn)物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結(jié)合，降低的免疫原性，或改進(jìn)的adcc或cdc。表b初始?xì)埢拘蕴娲鷥?yōu)選的替代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp；lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu依照共同的側(cè)鏈特性，氨基酸可以如下分組：(1)疏水性的：正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile；(2)中性，親水性的：cys,ser,thr,asn,gln；(3)酸性的：asp,glu；(4)堿性的：his,lys,arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly,pro；(6)芳香族的：trp,tyr,phe。非保守替代會(huì)需要用這些類別之一的成員替換另一個(gè)類別的。一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。一般地，為進(jìn)一步研究選擇的所得變體相對(duì)于親本抗體會(huì)具有某些生物學(xué)特性的改變(例如改善)(例如升高的親和力，降低的免疫原性)和/或會(huì)基本上保留親本抗體的某些生物學(xué)特性。例示性的替代變體是親和力成熟的抗體，其可以例如使用基于噬菌體展示的親和力成熟技術(shù)諸如本文中所描述的那些技術(shù)來方便地生成。簡(jiǎn)言之，將一個(gè)或多個(gè)hvr殘基突變，并將變體抗體在噬菌體上展示，并對(duì)其篩選特定的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。可以對(duì)hvr做出變化(例如，替代)，例如以改善抗體親和力?？梢詫?duì)hvr“熱點(diǎn)”，即由在體細(xì)胞成熟過程期間以高頻率經(jīng)歷突變的密碼子編碼的殘基(見例如chowdhury,methodsmol.biol.207:179-196(2008))，和/或sdr(a-cdr)做出此類變化，其中對(duì)所得的變體vh或vl測(cè)試結(jié)合親和力。通過次級(jí)文庫的構(gòu)建和再選擇進(jìn)行的親和力成熟已經(jīng)記載于例如hoogenboom等于methodsinmolecularbiology178:1-37(o’brien等編,humanpress,totowa,nj,(2001))。在親和力成熟的一些實(shí)施方案中，通過多種方法(例如，易錯(cuò)pcr，鏈改組，或寡核苷酸指導(dǎo)的誘變)將多樣性引入為成熟選擇的可變基因。然后，創(chuàng)建次級(jí)文庫。然后，篩選文庫以鑒定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法牽涉hvr指導(dǎo)的方法，其中將幾個(gè)hvr殘基(例如，一次4-6個(gè)殘基)隨機(jī)化?？梢岳缡褂帽彼釖呙枵T變或建模來特異性鑒定牽涉抗原結(jié)合的hvr殘基。特別地，經(jīng)常靶向cdr-h3和cdr-l3。在某些實(shí)施方案中，可以在一個(gè)或多個(gè)hvr內(nèi)發(fā)生替代，插入，或刪除，只要此類變化不實(shí)質(zhì)性降低抗體結(jié)合抗原的能力。例如，可以對(duì)hvr做出保守變化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不實(shí)質(zhì)性降低結(jié)合親和力。此類變化可以在hvr“熱點(diǎn)”或sdr外部。在上文提供的變體vh和vl序列的某些實(shí)施方案中，每個(gè)hvr是未改變的，或者含有不超過1，2或3處氨基酸替代。一種可用于鑒定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區(qū)域的方法稱作“丙氨酸掃描誘變”，如由cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，將一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如，帶電荷的殘基諸如arg，asp，his，lys，和glu)鑒定，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替換以測(cè)定抗體與抗原的相互作用是否受到影響?？梢栽趯?duì)初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入進(jìn)一步的替代?；蛘?另外，抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來鑒定抗體與抗原間的接觸點(diǎn)。作為替代的候選，可以靶向或消除此類接觸殘基和鄰近殘基?？梢院Y選變體以確定它們是否含有期望的特性。氨基酸序列插入包括長度范圍為1個(gè)殘基至含有100或更多個(gè)殘基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有n端甲硫氨?；鶜埢目贵w?？贵w分子的其它插入變體包括抗體的n或c端與酶(例如對(duì)于adept)或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。2.糖基化變體在某些實(shí)施方案中，改變本文中提供的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體以提高或降低抗體糖基化的程度。可以通過改變氨基酸序列，使得創(chuàng)建或消除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體的糖基化位點(diǎn)的添加或刪除。在雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體包含fc區(qū)的情況中，可以改變其附著的碳水化合物。由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生成的天然抗體通常包含分支的，雙觸角寡糖，其一般通過n連接附著于fc區(qū)的ch2域的asn297。見例如wright等tibtech15:26-32(1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如，甘露糖，n-乙酰葡糖胺(glcnac)，半乳糖，和唾液酸，以及附著于雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)“主干”中的glcnac的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體中的寡糖進(jìn)行修飾以創(chuàng)建具有某些改善的特性的抗體變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了雙特異性抗體變體或結(jié)合dr5的抗體的變體，其具有缺乏附著(直接或間接)于fc區(qū)的巖藻糖的碳水化合物結(jié)構(gòu)。例如，此類抗體中的巖藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通過相對(duì)于附著于asn297的所有糖結(jié)構(gòu)(例如，復(fù)合的，雜合的和高甘露糖的結(jié)構(gòu))的總和，計(jì)算asn297處糖鏈內(nèi)巖藻糖的平均量來測(cè)定巖藻糖量，如通過maldi-tof質(zhì)譜術(shù)測(cè)量的，例如如記載于wo2008/077546的。asn297指位于fc區(qū)中的約第297位(fc區(qū)殘基的eu編號(hào)方式)的天冬酰胺殘基；然而，asn297也可以由于抗體中的微小序列變異而位于第297位上游或下游約±3個(gè)氨基酸，即在第294位和第300位之間。此類巖藻糖基化變體可以具有改善的adcc功能。見例如美國專利公開文本no.us2003/0157108(presta,l.)；us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd)。涉及“脫巖藻糖基化的”或“巖藻糖缺乏的”抗體變體的出版物的例子包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki等j.mol.biol.336:1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等biotech.bioeng.87:614(2004)。能夠生成脫巖藻糖基化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖基化缺陷的lec13cho細(xì)胞(ripka等arch.biochem.biophys.249:533-545(1986)；美國專利申請(qǐng)nous2003/0157108a1,presta,l；及wo2004/056312a1,adams等，尤其在實(shí)施例11)，和敲除細(xì)胞系，諸如α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因fut8敲除cho細(xì)胞(見例如yamane-ohnuki等biotech.bioeng.87:614(2004)；kanda,y.等,biotechnol.bioeng.,94(4):680-688(2006)；及wo2003/085107)。進(jìn)一步提供了具有兩分型寡糖的雙特異性抗體變體或結(jié)合dr5的抗體的變體，例如其中附著于雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體fc區(qū)的雙觸角寡糖是通過glcnac兩分的。此類雙特異性抗體變體或結(jié)合dr5的抗體的變體可以具有降低的巖藻糖基化和/或改善的adcc功能。此類抗體變體的例子記載于例如wo2003/011878(jean-mairet等)；美國專利no.6,602,684(umana等)；及us2005/0123546(umana等)。還提供了在附著于fc區(qū)的寡糖中具有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可以具有改善的cdc功能。此類抗體變體記載于例如wo1997/30087(patel等)；wo1998/58964(raju,s.)；及wo1999/22764(raju,s.)。3.經(jīng)半胱氨酸工程化改造的抗體變體在某些實(shí)施方案中，可以期望創(chuàng)建經(jīng)半胱氨酸工程化改造的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體，例如，“thiomab”，其中雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的一個(gè)或多個(gè)殘基用半胱氨酸殘基替代。在具體的實(shí)施方案中，替代的殘基存在于雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的可接近位點(diǎn)。通過用半胱氨酸替代那些殘基，反應(yīng)性硫醇基團(tuán)由此定位于抗體的可接近位點(diǎn)，并且可以用于將抗體與其它模塊，諸如藥物模塊或接頭-藥物模塊綴合，以創(chuàng)建免疫綴合物。在某些實(shí)施方案中，可以用半胱氨酸替代下列殘基之任一個(gè)或多個(gè)：輕鏈的v205(kabat編號(hào)方式)；重鏈的a118(eu編號(hào)方式)；和重鏈fc區(qū)的s400(eu編號(hào)方式)?？梢匀缋缑绹鴮＠鹡o.7,521,541所述生成經(jīng)半胱氨酸工程化改造的抗體。h.重組方法和組合物可以例如通過固相肽合成(例如merrifield固相肽合成)或重組生成來獲得本發(fā)明的雙特異性抗體和結(jié)合dr5的抗體。對(duì)于重組生成，分離一種或多種編碼所述雙特異性抗體(片段)或結(jié)合dr5的抗體(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并將其插入一種或多種載體中用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)?？梢允褂贸Ｒ?guī)規(guī)程容易分離并測(cè)序此類多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含一種或多種本發(fā)明的多核苷酸的載體(優(yōu)選為表達(dá)載體)。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來構(gòu)建含有雙特異性抗體(片段)或結(jié)合dr5的抗體(片段)的編碼序列以及適宜的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組。參見例如記載于maniatis等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y(1989)的技術(shù)。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒，病毒的一部分或可以是核酸片段。表達(dá)載體包含表達(dá)盒，其中(在與啟動(dòng)子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件的可操作聯(lián)合中)克隆編碼雙特異性抗體(片段)或結(jié)合dr5的抗體(片段)的多核苷酸(即編碼區(qū))。如本文中使用的，“編碼區(qū)”是核酸中由翻譯成氨基酸的密碼子組成的一部分。盡管“終止密碼子”(tag，tga或taa)不翻譯成氨基酸，但可將其視為編碼區(qū)的一部分(若存在的話)，但任何側(cè)翼序列例如啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子，內(nèi)含子，5’和3’非翻譯區(qū)等，不是編碼區(qū)的一部分。兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)可以存在于單一多核苷酸構(gòu)建體中(例如在單一載體上)，或存在于分開的多核苷酸構(gòu)建體中，例如在分開的(不同的)載體上。此外，任何載體可含有單個(gè)編碼區(qū)，或可包含兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)，例如本發(fā)明的載體可以編碼一種或多種多肽，其經(jīng)由蛋白水解切割在翻譯后或共翻譯分開成最終蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的載體，多核苷酸或核酸可以編碼異源編碼區(qū)，其與編碼本發(fā)明的雙特異性抗體(片段)或結(jié)合dr5的抗體(片段)或其變體或衍生物的多核苷酸融合或未融合。異源編碼區(qū)包括但不限于特殊化的元件或基序，諸如分泌信號(hào)肽或異源功能域。當(dāng)基因產(chǎn)物例如多肽的編碼區(qū)與一種或多種調(diào)節(jié)序列以某種方式聯(lián)合從而使得該基因產(chǎn)物的表達(dá)置于該調(diào)節(jié)序列的影響或控制下時(shí)，即為可操作聯(lián)合。若誘導(dǎo)啟動(dòng)子功能導(dǎo)致編碼期望的基因產(chǎn)物的mrna的轉(zhuǎn)錄并且若兩個(gè)dna片段之間的連接的性質(zhì)不干擾表達(dá)調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)的能力或不干擾dna模板被轉(zhuǎn)錄的能力，則兩個(gè)dna片段(諸如多肽編碼區(qū)和與其聯(lián)合的啟動(dòng)子)為“可操作聯(lián)合的”。如此，如果啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)編碼多肽的核酸的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動(dòng)子區(qū)將是與該核酸可操作聯(lián)合。啟動(dòng)子可以是細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，其僅在預(yù)先確定的細(xì)胞中指導(dǎo)dna的實(shí)質(zhì)性轉(zhuǎn)錄。除啟動(dòng)子以外，其它轉(zhuǎn)錄控制元件例如增強(qiáng)子，操縱基因，阻遏物和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)能與多核苷酸可操作聯(lián)合以指導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。在本文中公開了合適的啟動(dòng)子和其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括但不限于在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，諸如但不限于來自巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)段(例如立即早期啟動(dòng)子，連同內(nèi)含子-a)，猿病毒40(例如早期啟動(dòng)子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(諸如例如勞斯(rous)肉瘤病毒)。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括那些自脊椎動(dòng)物基因諸如肌動(dòng)蛋白，熱休克蛋白，牛生長激素和家兔a-球蛋白衍生的，以及能夠控制真核細(xì)胞中基因表達(dá)的其它序列。另外的合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)。類似地，多種翻譯控制元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這些包括但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始和終止密碼子以及自病毒系統(tǒng)衍生的元件(具體地，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或ires，亦稱為cite序列)。表達(dá)盒還可以包含其它特征，諸如復(fù)制起點(diǎn)和/或染色體整合元件，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)(ltr)或腺伴隨病毒(aav)反向末端重復(fù)(itr)。本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可以與編碼分泌或信號(hào)肽的另外的編碼區(qū)聯(lián)合，所述分泌或信號(hào)肽指導(dǎo)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的分泌。例如，如果期望分泌雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體，那么可以將編碼信號(hào)序列的dna置于編碼本發(fā)明雙特異性抗體或本發(fā)明結(jié)合dr5的抗體或其片段的核酸上游。依照信號(hào)假說，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦啟動(dòng)將生長中的蛋白質(zhì)鏈跨越粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出，就將該信號(hào)肽或分泌前導(dǎo)序列從成熟的蛋白質(zhì)切去。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員知曉由脊椎動(dòng)物細(xì)胞分泌的多肽一般具有融合至多肽n端的信號(hào)肽，其從所翻譯的多肽切去以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些實(shí)施方案中，使用天然的信號(hào)肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號(hào)肽，或該序列的保留指導(dǎo)與其可操作聯(lián)合的多肽分泌的能力的功能性衍生物?；蛘?，可以使用異源哺乳動(dòng)物信號(hào)肽或其功能性衍生物。例如，可以將野生型前導(dǎo)序列用人組織纖溶酶原激活劑(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前導(dǎo)序列取代?？梢詫⒕幋a能用于促進(jìn)后期純化(例如組氨酸標(biāo)簽)或輔助標(biāo)記雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的短蛋白質(zhì)序列的dna納入雙特異性抗體(片段)或結(jié)合dr5的抗體(片段)編碼多核苷酸內(nèi)或其末端。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，提供包含本發(fā)明的一種或多種載體的宿主細(xì)胞。多核苷酸和載體可以單獨(dú)地或組合地?fù)饺氡疚闹蟹謩e關(guān)于多核苷酸和載體所描述的任何特征。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含載體(例如已用該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述載體包含編碼本發(fā)明雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”指任何種類能工程化改造以生成本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體或其片段的細(xì)胞系統(tǒng)。適用于復(fù)制雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體及支持其表達(dá)的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域中公知的。在適當(dāng)時(shí)，可用特定的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)此類細(xì)胞，并且可以培養(yǎng)大量的含載體細(xì)胞以用于接種大規(guī)模發(fā)酵罐，從而獲得充足量的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體用于臨床應(yīng)用。合適的宿主細(xì)胞包括原核微生物諸如大腸桿菌，或各種真核細(xì)胞，諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho)，昆蟲細(xì)胞等。例如，可以在細(xì)菌中生成多肽，特別是在不需要糖基化時(shí)。在表達(dá)后，可以將多肽在可溶性級(jí)分中與細(xì)菌細(xì)胞糊分離并可以進(jìn)一步純化。除了原核生物外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是適合多肽編碼載體的克隆或表達(dá)宿主，包括其糖基化途徑已被“人源化”，導(dǎo)致生成具有部分或完全人的糖基化樣式的多肽的真菌和酵母菌株。參見gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004)，和li等,natbiotech24,210-215(2006)。適用于表達(dá)(糖基化)多肽的宿主細(xì)胞還自多細(xì)胞生物體(無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物)衍生。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定出可與昆蟲細(xì)胞一起使用的大量桿狀病毒株，特別是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)細(xì)胞。也可以將植物細(xì)胞培養(yǎng)物用作宿主。參見例如美國專利no.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中生成抗體的plantibodiestm技術(shù))。脊椎動(dòng)物細(xì)胞也可以用作宿主。例如，適應(yīng)于在懸浮液中生長的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以是有用的。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其它例子是由sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1系(cos-7)；人胚腎系(293或293t細(xì)胞，如例如記載于graham等,jgenvirol36,59(1977))，幼倉鼠腎細(xì)胞(bhk)，小鼠塞托利(sertoli)細(xì)胞(tm4細(xì)胞，如例如記載于mather,biolreprod23,243-251(1980)的)，猴腎細(xì)胞(cv1)，非洲綠猴腎細(xì)胞(vero-76)，人宮頸癌細(xì)胞(hela)，犬腎細(xì)胞(mdck)，牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(brl3a)，人肺細(xì)胞(w138)，人肝細(xì)胞(hepg2)，小鼠乳房腫瘤細(xì)胞(mmt060562)，tri細(xì)胞(如例如記載于mather等,annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)的)，mrc5細(xì)胞和fs4細(xì)胞。其它有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞，包括dhfr-cho細(xì)胞(urlaub等,procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤細(xì)胞系諸如yo，ns0，p3x63和sp2/0。對(duì)于某些適用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述，參見例如yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,第248卷(b.k.c.lo編,humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主細(xì)胞包括培養(yǎng)的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞，酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞和植物細(xì)胞等，但還包括在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因植物或培養(yǎng)的植物或動(dòng)物組織中包含的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞，人胚腎(hek)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如y0，ns0，sp20細(xì)胞)。本領(lǐng)域中已知在這些系統(tǒng)中表達(dá)外來基因的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？梢詫⒈磉_(dá)包含抗原結(jié)合域諸如抗體的重鏈或輕鏈的多肽的細(xì)胞工程化改造為使得還表達(dá)另一抗體鏈，從而使得表達(dá)的產(chǎn)物是具有重鏈和輕鏈兩者的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了生成依照本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的方法，其中所述方法包括在適合于雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含編碼雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的多核苷酸的宿主細(xì)胞(如本文中提供的)，并從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)液)回收雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體。雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的組分彼此遺傳融合。雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體可設(shè)計(jì)為使其組分直接彼此融合或經(jīng)由接頭序列間接融合?？梢勒毡绢I(lǐng)域中公知的方法確定接頭的組成和長度，并可以測(cè)試功效。雙特異性抗體不同組分之間的接頭序列的例子見于本文中提供的序列。還可包含另外的序列以納入切割位點(diǎn)來分開融合物的各個(gè)組分(若期望的話)，例如內(nèi)肽酶識(shí)別序列。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的fab片段形成部分至少包含能夠結(jié)合抗原性決定簇的抗體可變區(qū)?？勺儏^(qū)能形成天然或非天然存在的抗體及其片段的一部分及自其衍生。生成多克隆抗體和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域中公知的(參見例如harlow和lane,“antibodies,alaboratorymanual”,coldspringharborlaboratory,1988)。非天然存在的抗體可以使用固相肽合成構(gòu)建，可以重組生成(例如如記載于美國專利no.4,186,567的)或可通過例如篩選包含可變重鏈和可變輕鏈的組合庫獲得(參見例如mccafferty的美國專利no.5,969,108)?？梢詫⑷魏蝿?dòng)物種類的抗體，抗體片段，抗原結(jié)合域或可變區(qū)用于本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體?？捎糜诒景l(fā)明的非限制性抗體，抗體片段，抗原結(jié)合域或可變區(qū)可以是鼠，靈長類或人起源的。如果雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體意圖供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗體，其中抗體的恒定區(qū)來自人。也可以依照本領(lǐng)域中公知的方法制備人源化或全人形式的抗體(參見例如winter的美國專利no.5,565,332)。人源化可以通過各種方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于(a)將非人(例如供體抗體)cdr嫁接到人(例如受體抗體)框架和恒定區(qū)上，保留或不保留關(guān)鍵的框架殘基(例如那些對(duì)于保留較好的抗原結(jié)合親和力或抗體功能重要的殘基)，(b)僅將非人特異性決定區(qū)(sdr或a-cdr；對(duì)于抗體-抗原相互作用關(guān)鍵的殘基)嫁接到人框架和恒定區(qū)上，或(c)移植完整的非人可變域，但通過替換表面殘基用人樣部分來“掩飾(cloak)”它們。人源化的抗體及其制備方法綜述于例如almagro和fransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)，并且還記載于例如riechmann等,nature332,323-329(1988)；queen等,procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美國專利no.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；jones等,nature321,522-525(1986)；morrison等,procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrison和oi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyen等,science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmiri等,methods36,25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)嫁接)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；dall’acqua等,methods36,43-60(2005)(描述“fr改組”)；和osbourn等,methods36,61-68(2005)以及klimka等,brjcancer83,252-260(2000)(描述了fr改組的“引導(dǎo)選擇”辦法)。可以使用本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來生成人抗體和人可變區(qū)。人抗體一般記載于vandijk和vandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)以及l(fā)onberg,curropinimmunol20,450-459(2008)。人可變區(qū)能形成通過雜交瘤方法制備的人單克隆抗體的一部分及自其衍生(參見例如monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。還可以通過對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物施用免疫原來制備人抗體和人可變區(qū)，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)過修飾以應(yīng)答抗原刺激而生成完整的人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體(參見例如lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005))。還可以通過分離自人衍生的噬菌體展示庫選擇的fv克隆可變區(qū)序列來生成人抗體和人可變區(qū)(參見例如hoogenboom等，于methodsinmolecularbiology178,1-37(o’brien等編,humanpress,totowa,nj,2001)；和mccafferty等,nature348,552-554；clackson等,nature352,624-628(1991))。噬菌體通常展示抗體片段，作為單鏈fv(scfv)片段或作為fab片段。在某些實(shí)施方案中，將可用于本發(fā)明的fab片段工程化改造為具有增強(qiáng)的結(jié)合親和力，其依照例如公開于美國專利申請(qǐng)公開文本no.2004/0132066的方法進(jìn)行，其完整內(nèi)容通過提述據(jù)此并入?？梢越?jīng)由酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它技術(shù)來測(cè)量本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體結(jié)合特定抗原性決定簇的能力，所述其它技術(shù)例如表面等離振子共振技術(shù)(在biacoret100系統(tǒng)上分析)(liljeblad等,glycoj17,323-329(2000))和傳統(tǒng)的結(jié)合測(cè)定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))?？梢允褂酶?jìng)爭(zhēng)測(cè)定法來鑒定與參照抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)特定抗原的結(jié)合的抗體，抗體片段，抗原結(jié)合域或可變域。在某些實(shí)施方案中，此類競(jìng)爭(zhēng)性抗體結(jié)合由參照抗體結(jié)合的相同表位(例如線性或構(gòu)象表位)。用于定位抗體結(jié)合的表位的詳細(xì)的例示性方法在morris(1996)“epitopemappingprotocols,”于methodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中提供。在一種例示性競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中，將固定化的抗原在溶液中溫育，所述溶液包含結(jié)合該抗原的第一經(jīng)標(biāo)記抗體和測(cè)試其與第一經(jīng)抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)抗原的結(jié)合的第二未標(biāo)記抗體。第二抗體可以存在于雜交瘤上清液中。作為對(duì)照，將固定化的抗原在溶液中溫育，所述溶液包含第一標(biāo)記抗體但沒有第二未標(biāo)記抗體。在允許第一抗體結(jié)合抗原的條件下溫育后，除去過量的未結(jié)合的抗體，并測(cè)量與固定化抗原聯(lián)合的標(biāo)記物的量。如果與固定化抗原聯(lián)合的標(biāo)記物的量在測(cè)試樣品中相對(duì)于對(duì)照樣品實(shí)質(zhì)性降低，那么這指示第二抗體與第一抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)抗原的結(jié)合。參見harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的技術(shù)來純化如本文中描述的那樣制備的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體，所述技術(shù)諸如高效液相層析，離子交換層析，凝膠電泳，親和層析，大小排阻層析等。用于純化具體蛋白質(zhì)的實(shí)際條件將部分取決于諸如凈電荷，疏水性，親水性等因素，而且對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將是明顯的。對(duì)于親和層析純化，可以使用雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體結(jié)合的抗體，配體，受體或抗原。例如，對(duì)于本發(fā)明的雙特異性抗體的親和層析純化，可以使用具有蛋白a或蛋白g的基質(zhì)?？梢赃B續(xù)使用蛋白a或g親和層析和大小排阻層析來分離雙特異性抗體，基本如實(shí)施例中描述的?？梢酝ㄟ^多種公知的分析方法中的任一種來測(cè)定雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的純度，包括凝膠電泳，高壓液相層析等。i.測(cè)定法可以通過本領(lǐng)域中已知的多種測(cè)定法對(duì)本文中提供的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體和結(jié)合dr5的抗體鑒定，篩選，或表征其物理/化學(xué)特性和/或生物學(xué)活性。1.親和力測(cè)定法可以依照實(shí)施例中提出的方法使用標(biāo)準(zhǔn)的儀器如biacore儀(gehealthcare)通過表面等離振子共振(spr)測(cè)定本文中提供的雙特異性抗體和結(jié)合dr5的抗體對(duì)dr5和/或fap的親和力，而且諸如可以通過重組表達(dá)獲得受體或靶蛋白?；蛘?，可以例如通過流式細(xì)胞術(shù)(facs)，使用表達(dá)特定受體或靶抗原的細(xì)胞系來評(píng)估本文中提供的雙特異性抗體和結(jié)合dr5的抗體對(duì)dr5和/或fap的結(jié)合。可以通過表面等離振子共振使用t100儀(gehealthcare)于25℃測(cè)量kd。為了分析fc部分與fc受體之間的相互作用，通過固定化于cm5芯片上的抗五his抗體(qiagen)來捕捉帶his標(biāo)簽的重組fc受體并將雙特異性構(gòu)建體用作分析物。簡(jiǎn)言之，將羧甲基化的葡聚糖生物傳感器芯片(cm5,gehealthcare)依照供應(yīng)商說明書用n-乙基-n’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺氫氯化物(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化。將抗五his抗體用10mm醋酸鈉ph5.0稀釋至40μg/ml，接著以5μl/分鐘的流速注射以實(shí)現(xiàn)約6500響應(yīng)單位(ru)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。在注射配體后，注射1m乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。然后，在4或10nm捕捉fc受體60秒。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)量，將雙特異性構(gòu)建體的4倍連續(xù)稀釋液(范圍為約500nm至4000nm)在hbs-ep(gehealthcare,10mmhepes,150mmnacl,3mmedta,0.05％表面活性劑p20,ph7.4)中于25℃以30μl/min的流速注射120秒。為了測(cè)定對(duì)靶抗原的親和力，通過固定化于活化cm5傳感器芯片表面上的抗人fab特異性抗體(gehealthcare)來捕捉雙特異性構(gòu)建體，如對(duì)于抗五his抗體所描述的。偶聯(lián)蛋白質(zhì)的最終量為約12000ru。雙特異性構(gòu)建體在300nm捕捉90秒。使靶抗原在從250至1000nm的濃度范圍以30μl/min的流速通過流動(dòng)池達(dá)180秒。監(jiān)測(cè)解離達(dá)180秒。通過扣除在參照流動(dòng)池上獲得的響應(yīng)來校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差異。使用穩(wěn)定態(tài)響應(yīng)通過langmuir結(jié)合等溫線的非線性曲線擬合來導(dǎo)出解離常數(shù)kd。使用簡(jiǎn)單的1對(duì)1langmuir結(jié)合模型(t100評(píng)估軟件版本1.1.1)通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖來計(jì)算結(jié)合速率(k結(jié)合)和解離速率(k解離)。平衡解離常數(shù)(kd)計(jì)算為比率k解離/k結(jié)合。參見例如chen等,jmolbiol293,865-881(1999)。2.結(jié)合測(cè)定法和其它測(cè)定法在一個(gè)方面，對(duì)本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體測(cè)試其抗原結(jié)合活性，例如通過已知的方法諸如elisa，western印跡，等來進(jìn)行。在另一個(gè)方面，可使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法來鑒定分別與特定抗fap抗體或特定抗dr5抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)fap或dr5的結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方案中，此類競(jìng)爭(zhēng)性抗體結(jié)合與特定抗fap抗體或特定抗dr5抗體所結(jié)合表位相同的表位(例如線性或構(gòu)象表位)。用于定位抗體所結(jié)合表位的詳細(xì)例示性方法見morris(1996)“epitopemappingprotocols”,methodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)。實(shí)施例部分描述了別的方法。3.活性測(cè)定法在一個(gè)方面，提供了用于鑒定具有生物學(xué)活性的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的測(cè)定法。生物學(xué)活性可包括例如dna片段化，誘導(dǎo)凋亡和靶細(xì)胞裂解。還提供了在體內(nèi)和/或在體外具有此類生物學(xué)活性的抗體。在某些實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體測(cè)試此類生物學(xué)活性。用于檢測(cè)細(xì)胞裂解(例如通過測(cè)量ldh釋放)或凋亡(例如使用tunel測(cè)定法)的測(cè)定法是本領(lǐng)域公知的。用于測(cè)量adcc或cdc的測(cè)定法還記載于wo2004/065540(參見其中的實(shí)施例1)，通過述及將其完整內(nèi)容收入本文。j.藥物配制劑通過混合具有期望純度的此類雙特異性抗體或抗體與一種或多種任選的藥學(xué)可接受載劑(remington’spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.編(1980))以凍干配制劑或水性溶液形式制備如本文中所描述的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的抗體的藥物配制劑。一般地，藥學(xué)可接受載劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無毒的，而且包括但不限于緩沖劑，諸如磷酸鹽，檸檬酸鹽，和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，芐索氯銨；酚，丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烴基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，諸如edta；糖類，諸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇(peg)。本文中的例示性的藥學(xué)可接受載劑進(jìn)一步包含間質(zhì)藥物分散劑諸如可溶性中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，諸如rhuph20(baxterinternational,inc.)。某些例示性的shasegp和使用方法，包括rhuph20記載于美國專利公開文本no.2005/0260186和2006/0104968。在一個(gè)方面，將shasegp與一種或多種另外的糖胺聚糖酶諸如軟骨素酶組合。例示性的凍干抗體配制劑記載于美國專利no.6,267,958。水性抗體配制劑包括那些記載于美國專利no.6,171,586和wo2006/044908的，后一種配制劑包含組氨酸-乙酸鹽緩沖液。本文中的配制劑還可含有所治療具體適應(yīng)癥所必需的超過一種活性組分，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的。此類活性組分適于以有效用于所需目的的量而組合存在。活性組分可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體，清蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)披露于例如remington'spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.編(1980)?？梢灾苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適的例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成形物品形式，例如膜，或微膠囊。要用于體內(nèi)施用的配制劑一般是無菌的。無菌性可容易地實(shí)現(xiàn)，例如通過穿過無菌濾膜過濾。k.治療性方法和組合物可以在治療性方法中使用本文中提供的包含一種或多種結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體和別的化療劑的治療劑組合。在一個(gè)方面，提供了作為藥物使用的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體，用于與別的化療劑組合使用。在某些實(shí)施方案中，提供了用于與別的化療劑組合使用的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體，用于在治療方法中使用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在治療具有癌癥的個(gè)體的方法中使用的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體，該治療包括對(duì)個(gè)體施用有效量的結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)個(gè)體施用有效量的至少一種另外的治療劑，例如如下文所描述的。依照任何上述實(shí)施方案的“個(gè)體”優(yōu)選是人。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌，肉瘤或結(jié)直腸癌。在其它實(shí)施方案中，該癌癥為結(jié)直腸癌，肉瘤，頭和頸癌，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌或間皮瘤。在該癌癥為乳腺癌的實(shí)施方案中，該乳腺癌可以是三重陰性乳腺癌。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體和別的化療劑的治療劑組合在制造或制備藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物用于治療癌癥。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物用于治療癌癥的方法，其包括對(duì)具有癌癥的個(gè)體施用有效量的該藥物。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)個(gè)體施用有效量的至少一種另外的治療劑，例如如下文所描述的。依照任何上述實(shí)施方案的“個(gè)體”可以是人。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)具有癌癥的個(gè)體施用有效量的包含結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體和別的化療劑的治療劑組合。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)個(gè)體施用有效量的至少一種另外的治療劑，如下文所描述的。依照任何上述實(shí)施方案的“個(gè)體”可以是人。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌，肉瘤或結(jié)直腸癌。在其它實(shí)施方案中，該癌癥為結(jié)直腸癌，肉瘤，頭和頸癌，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌或間皮瘤。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物配制劑，其包含本文中提供的任何結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體，例如在任何上述治療性方法中使用，和別的化療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物配制劑包含本文中提供的任何結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體和藥學(xué)可接受載劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物配制劑包含本文中提供的任何結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體和至少一種另外的治療劑，例如如下文所描述的。可以通過任何合適的手段，包括胃腸外，肺內(nèi)，和鼻內(nèi)，及若期望用于局部治療的話，損傷內(nèi)施用來施用雙特異性抗體。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，或皮下施用。部分根據(jù)施用是短暫的還是長期的，劑量給藥可以通過任何合適的路徑，例如通過注射，諸如靜脈內(nèi)或皮下注射進(jìn)行。本文中涵蓋各種劑量給藥日程表，包括但不限于單次施用或在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)里的多次施用，推注施用，和脈沖輸注。雙特異性抗體可以以一種符合良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐的方式配制，確定劑量及施用。在此背景中考慮的因素包括所治療的特定病癥，所治療的特定哺乳動(dòng)物，患者個(gè)體的臨床狀況，病癥的起因，藥劑投遞的部位，施用的方法，施用進(jìn)度，以及醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。雙特異性抗體無需但任選地與一種或多種目前用于預(yù)防或治療所討論病癥的藥劑一起配制。此類其它藥劑的有效量取決于配制劑中存在的抗體的量，病癥或治療的類型，及上文討論的其它因素。這些藥劑通常以本文所述相同的劑量和施用途徑使用，或以約1-99％的本文所述劑量使用，或以憑經(jīng)驗(yàn)/臨床確定為合適的任何劑量并通過任何途徑使用。為了預(yù)防或治療疾病，雙特異性抗體的合適劑量會(huì)取決于要治療的疾病的類型，抗體的種類，疾病的嚴(yán)重性和病程，所給予雙特異性抗體的預(yù)防或治療目的，之前的療法，患者的臨床史和對(duì)雙特異性抗體的應(yīng)答及主治醫(yī)師的斟酌決定。雙特異性抗體適合于在一次或一系列的治療中施用于患者。取決于疾病的類型和嚴(yán)重性，約1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的雙特異性抗體或結(jié)合dr5的新穎抗體可作為首次候選用量給予患者，無論是例如通過一次或多次分開的給藥或通過連續(xù)輸注。取決予上述提及的因素，一種典型的日劑量可在約1μg/kg-100mg/kg或更多的范圍內(nèi)。對(duì)于幾天或更長時(shí)間的重復(fù)給藥，取決于病情，治療通常會(huì)持續(xù)直至出現(xiàn)疾病癥狀得到期望的抑制為止。雙特異性抗體的一種例示性劑量會(huì)在約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍中。如此，可以對(duì)患者施用約0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg的一劑或多劑。上述劑量可間歇給予，如每周或每三周(例如使得患者得到約2-約20劑，或例如約6劑雙特異性抗體)?？山o予初始較高的加載劑量，接著給予較低的一或多劑。然而，可使用其它劑量方案。通過常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法易于監(jiān)測(cè)該療法的進(jìn)展。應(yīng)當(dāng)理解，可以替換結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體或在結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體外使用本發(fā)明的免疫綴合物實(shí)施任何上述配制劑或治療性方法。l.制品在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種制品，其含有可用于治療，預(yù)防和/或診斷上文所描述的病癥的材料。制品包含容器和容器上或與容器聯(lián)合的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，iv溶液袋，等等。容器可以由多種材料諸如玻璃或塑料形成。容器容納單獨(dú)或與另一種組合物組合有效治療，預(yù)防和/或診斷狀況的組合物，并且可以具有無菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射針可穿過的塞子的管形瓶或靜脈內(nèi)溶液袋)。組合物中的至少一種活性劑是雙特異性抗體且另外的活性劑是本文所述別的化療劑。標(biāo)簽或包裝插頁指示使用組合物來治療選擇的狀況。此外，制品可以包含(a)其中裝有組合物的第一容器，其中組合物包含雙特異性抗體；和(b)其中裝有組合物的第二容器，其中組合物包含別的細(xì)胞毒性或其它方面治療性的藥劑。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中的制品可以進(jìn)一步包含包裝插頁，其指示可以使用組合物來治療特定的狀況。或者/另外，制品可以進(jìn)一步包含第二(或第三)容器，其包含藥學(xué)可接受緩沖液，諸如抑菌性注射用水(bwfi)，磷酸鹽緩沖鹽水，ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以進(jìn)一步包含從商業(yè)和用戶觀點(diǎn)看期望的其它材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，濾器，針，和注射器。應(yīng)當(dāng)理解，任何上述制品可包括本發(fā)明的免疫綴合物來代替或補(bǔ)充結(jié)合dr5和fap的雙特異性抗體。iii.實(shí)施例下面是本發(fā)明的方法和組合物的實(shí)施例。要理解，鑒于上文提供的一般描述，可以實(shí)施各種其它實(shí)施方案。雖然出于清楚理解的目的，前述發(fā)明已經(jīng)作為例示和例子相當(dāng)詳細(xì)地進(jìn)行了描述，但是說明書和實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過提及而明確將本文中引用的所有專利和科學(xué)文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整收錄。實(shí)施例1：dr5-fap死亡受體激動(dòng)性雙特異性抗體一種通過死亡受體(如dr5)的交聯(lián)(除經(jīng)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原的交聯(lián)之外)來誘導(dǎo)凋亡的辦法靶向腫瘤周圍的基質(zhì)。在該情況中，靶定抗原不由腫瘤細(xì)胞直接展示，而是由第二種不同細(xì)胞類型展示。此類抗原的一個(gè)例子會(huì)是fap(成纖維細(xì)胞活化蛋白)。這種蛋白質(zhì)在活化的成纖維細(xì)胞上表達(dá)，正如在腫瘤基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)它們那樣。通過噬菌體展示鑒定新穎的dr5結(jié)合物。對(duì)通過噬菌體展示獲得的dr5結(jié)合物篩選凋亡誘導(dǎo)，特異性，物種交叉反應(yīng)性，和表位特異性。選擇dr5結(jié)合物5e11并轉(zhuǎn)變成四價(jià)雙特異性分子。這些雙特異性抗體含有兩種結(jié)合模塊，各自針對(duì)dr5和fap。fap結(jié)合模塊已經(jīng)記載于wo2012/020006。使用(g4s)4連接頭將28h1crossfab域(vhcl)融合至抗dr5重鏈的c端，提供2+2型式的雙特異性抗體。表1：雙特異性，四價(jià)dr5-fapcrossmab分子(均使用(g4s)4連接頭將28h1crossfab域(vhcl)融合至抗dr5重鏈的c端，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的hek293ebna細(xì)胞中生成dr5-fap雙特異性分子，并經(jīng)由蛋白a和大小排阻層析來純化。獲得的產(chǎn)物產(chǎn)量在合理范圍中(20mg/l左右)。對(duì)于所有分子，最后的純化步驟之后的單體含量在96％以上。通過表面等離振子共振(biacore)進(jìn)行的靶物結(jié)合分析揭示了2+2型式的雙特異性抗體能夠同時(shí)結(jié)合重組dr5和fap(人和鼠)。為了評(píng)估dr5-fap雙特異性分子是否能夠誘導(dǎo)mda-mb-231靶細(xì)胞系凋亡，用重組人fap包被96孔板，用于經(jīng)由隨后添加的雙特異性抗體來交聯(lián)靶細(xì)胞上的dr5。在添加靶細(xì)胞(mda-mb231)和溫育24小時(shí)之后，通過標(biāo)準(zhǔn)dna片段化elisa測(cè)定法來測(cè)定凋亡誘導(dǎo)。dr5-fap雙特異性分子在板上包被的fap存在下展現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)活性，指示此活性依賴于經(jīng)由重組fap的交聯(lián)。實(shí)施例2：dr5-fap雙特異性抗體能夠?qū)Σ煌屑?xì)胞誘導(dǎo)凋亡在含gm05389人fap+成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)測(cè)定法中在實(shí)驗(yàn)中對(duì)包含融合至fap28h1crossfab模塊的新分離的dr5結(jié)合物的2+2型式的dr5-fap雙特異性抗體測(cè)試對(duì)兩種不同細(xì)胞系(mda-mb-231和g401)誘導(dǎo)凋亡的情況。在0.0007–7nm的濃度范圍上測(cè)試雙特異性抗體。dna片段化測(cè)定法的結(jié)果顯示所測(cè)試的雙特異性抗體對(duì)兩種細(xì)胞系均展示較好的凋亡誘導(dǎo)活性。依照用mda-mb-231細(xì)胞獲得的結(jié)果，雙特異性2+2型式的抗體在高濃度沒有顯示活性下降，而是上至最高濃度保持恒定或甚至升高。在含gm05389成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)物中有g(shù)401細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，早在0.07nm的濃度就達(dá)到了最大凋亡誘導(dǎo)，然后保持恒定。在這種設(shè)置中，所有分子就凋亡誘導(dǎo)水平而言性能相似。表1a：fap-dr5雙特異性抗體的表征實(shí)施例3：人腫瘤中的fap流行度通過ihc評(píng)估人腫瘤中fap的流行度以了解雙特異性dr5-fap抗體的可能臨床用途。在ventanabenchmarkxt上使用來自vitatex(mabs1001)的大鼠抗人seprase抗體(igg2a，克隆d8)免疫染色來自多種腫瘤適應(yīng)癥的2.5μmffpet切片。對(duì)切片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)cc1處理，接著是于37℃在dako抗體稀釋液(s3022)中以5μg/ml的濃度的抗體溫育60分鐘，并使用ultraviewdab檢測(cè)系統(tǒng)(ventana，#760-4456)檢測(cè)陽性染色。使用匹配的來自abcam的同種型抗體(ab18450)作為陰性對(duì)照。fap+基質(zhì)浸潤物存在于不同適應(yīng)癥的人腫瘤中，包括sclc，標(biāo)志著雙特異性dr5-fap抗體的潛在感興趣臨床適應(yīng)癥(表2)。表2：人上皮腫瘤中的fap流行度fap-dr5的另一種感興趣臨床適應(yīng)癥是肉瘤，其中在跨越肉瘤亞型的大約50％的病例中fap不在基質(zhì)上表達(dá)但在惡性細(xì)胞自身上表達(dá)(表3)。表3：人肉瘤亞型中的fap流行度實(shí)施例4：體外組合研究為了評(píng)估fap-dr5與不同抗癌藥物的組合潛力，在體外使用dr5抗體(drozitumab，記載于us2007/0031414)+經(jīng)由抗fc抗體的交聯(lián)作為在fap+細(xì)胞缺失下的交聯(lián)的替代。在一個(gè)細(xì)胞系子集中確認(rèn)了體外細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)中fap交聯(lián)和fc交聯(lián)之間較好的相關(guān)性用于原理證明(數(shù)據(jù)未顯示)。評(píng)估一組crc和pdac細(xì)胞系，并使用與相應(yīng)腫瘤適應(yīng)癥潛在臨床相關(guān)的組合配偶來評(píng)估組合效果(crc：伊立替康，奧沙利鉑，5-fu，mdm2抑制劑(rg7388)，bcl-2抑制劑(abt199)；pdac：abraxane，帕利他賽，吉西他濱，多柔比星，mdm2i(rg7388)，bcl2i(abt199)，硼替佐米，環(huán)巴胺，parp抑制劑(pj34))。結(jié)果描述于表4和表5和圖2-4?；衔锏膇c50值的測(cè)定在具有透明，平坦底的黑色96孔微量板中接種細(xì)胞(數(shù)目隨細(xì)胞系而變化)，并于37℃和5％co2溫育過夜。在檢查細(xì)胞貼壁/匯合之后，去除培養(yǎng)基并對(duì)每個(gè)孔添加100μl含有相應(yīng)化合物的新鮮培養(yǎng)基。每種化合物(n＝3)使用8個(gè)濃度的順序稀釋系列(1:4)。使用相應(yīng)dmso濃度和單獨(dú)的培養(yǎng)基作為對(duì)照。在于37℃和5％co2培養(yǎng)3天之后，對(duì)板添加每孔100μlcelltiter-glo試劑(promega)。在于室溫?fù)u動(dòng)30分鐘之后測(cè)量發(fā)光。用xl-fit軟件計(jì)算ic50值。一種化合物的每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少兩次。dr5抗體組合：在具有透明，平坦底的黑色96孔微量板中接種細(xì)胞(數(shù)目隨細(xì)胞系而變化)，并于37℃和5％co2溫育過夜。在檢查細(xì)胞貼壁/匯合之后，去除培養(yǎng)基并對(duì)每個(gè)孔添加100μl含有相應(yīng)化合物或組合的新鮮培養(yǎng)基。在96孔pp-v底微量板中制備drozitumab/抗人fc的9個(gè)濃度的順序1:3稀釋系列(n＝6)。以等摩爾濃度混合的drozitumab/抗人fc的預(yù)稀釋液，drozitumab/抗人fc的范圍為0–28nm而化療劑為800nm。然后將25μl/孔drozitumab/抗人fc系列轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。然后用1xic50濃度的化合物和7nm或最高濃度200nm任一的drozitumab/抗人fc達(dá)到終濃度。在于37℃和5％co2溫育3天之后，對(duì)板給予每孔100μlcelltiter-glo試劑(promega)。在于室溫?fù)u動(dòng)30分鐘之后測(cè)量發(fā)光。對(duì)于drozitumab/抗人fc和drozitumab/抗人fc+化合物的每個(gè)濃度，在同一塊板上制備一式三份，而且每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少兩次。表4：組合篩選pdac細(xì)胞系表5：組合篩選crc細(xì)胞系n.s.＝不顯著n.c.＝未計(jì)算(因數(shù)據(jù)不合適)n.t.＝未測(cè)試實(shí)施例5：fap-dr5與化療劑組合的體內(nèi)抗腫瘤功效可以在移植到裸小鼠上的多種腫瘤起源(例如crc，胰腺癌，結(jié)締組織增生性黑素瘤和肉瘤)的基于細(xì)胞和碎片的患者衍生(pdx)模型中檢測(cè)雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)的體內(nèi)抗腫瘤功效。例如，針對(duì)crc異種移植物模型dld-1和hct116(基于細(xì)胞系的，共注射模型l)和co5896(基于碎片的)顯示了雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)和化療劑激活內(nèi)在凋亡途徑的組合功效的數(shù)據(jù)。測(cè)試藥劑作為來自roche(penzberg，germany)的儲(chǔ)液提供雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)?？贵w緩沖液包括組氨酸。注射前在緩沖液中自儲(chǔ)液適當(dāng)稀釋抗體溶液。作為來自roche(penzberg，germany)的儲(chǔ)液提供現(xiàn)有技術(shù)dr5特異性抗體drozitumab的一種fc突變體。這種抗體包含fc域中消除對(duì)活化性或抑制性fc受體的結(jié)合和/或效應(yīng)器功能的三處氨基酸替代，其中所述氨基酸替代為l234a，l235a和p329g。drozitumab的這種fc突變體也稱作“drozitumablala”。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件dld-1和hct116人crc細(xì)胞最初是自atcc獲得的；lox-imvi人結(jié)締組織增生性黑素瘤細(xì)胞最初是在nci建立并自atcc購買的。例行地在水飽和氣氛中于37℃和5％co2在含1.0mm丙酮酸鈉，補(bǔ)充有10％胎牛血清，2.0mml-谷氨酰胺，10mmhepes的dmem高葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系。每三天用胰蛋白酶/edta1x分瓶實(shí)施培養(yǎng)物傳代。另外，鼠成纖維細(xì)胞nih3t3購自atcc，并在含1.0mm丙酮酸鈉，10％fcs和2.0mml-谷氨酰胺的dmem高葡萄糖中培養(yǎng)。患者衍生異種移植物模型(pdx)crc腫瘤異種移植物co5896，肉瘤腫瘤異種移植物sarc4605和胰腺導(dǎo)管腺癌(pdac)腫瘤異種移植物pa1178和pa3137最初是自患者獲得的，并適當(dāng)傳代3-5次，直至建立穩(wěn)定生長樣式。為了后續(xù)體內(nèi)研究，自在裸小鼠中連續(xù)傳代的異種移植物獲得co5896，sarc4605，pa1178和pa3137腫瘤碎片。自供體小鼠取出后，將腫瘤切成碎片(4-5mm直徑)并放置在pbs中，直至皮下植入。異氟烷麻醉下的小鼠在體側(cè)中接受單側(cè)皮下腫瘤植入物。動(dòng)物裸小鼠購自育種公司(例如charlesriver，sulzfeld，germany)，并依照提交的指導(dǎo)方針(gv-solas；felasa；tierschg)以12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的日周期在無特定病原體的條件下維持。實(shí)驗(yàn)性研究方案得到當(dāng)?shù)卣膶彶楹团鷾?zhǔn)。到達(dá)后，將動(dòng)物在動(dòng)物房的檢疫部分中維持一周適應(yīng)新環(huán)境和進(jìn)行觀察。定期進(jìn)行連續(xù)健康監(jiān)測(cè)。隨意提供飲食食物(provimikliba3337)和水(酸化的ph2.5-3)。監(jiān)測(cè)每天對(duì)動(dòng)物管理臨床癥狀和不利作用檢測(cè)。對(duì)于貫穿實(shí)驗(yàn)的監(jiān)測(cè)，記錄動(dòng)物的體重。對(duì)動(dòng)物的處理在細(xì)胞或碎片移植后當(dāng)中值腫瘤大小為約100-200mm3時(shí)進(jìn)行動(dòng)物隨機(jī)化，此后開始動(dòng)物處理。作為單一藥劑以1.0，10或30mg/kg靜脈內(nèi)施用抗體，一周一次或兩次，持續(xù)數(shù)周，取決于模型。在同一天施用相應(yīng)媒介。抗體功效基于dld-1和hct116crc共注射細(xì)胞系的異種移植物模型研究第9至20天以10和1.0mg/kg的劑量用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理攜帶dld-1crc異種移植物的小鼠4次。結(jié)果是，雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理顯示劑量相關(guān)的顯著的抗腫瘤功效，具有較強(qiáng)的針對(duì)皮下dld-1異種移植物的抗腫瘤功效。腫瘤生長抑制(tgi)分別計(jì)算為89％(10mg/kg)和79％(1.0mg/kg)。相反，用dr5fc突變體抗體drozitumab，lala(10mg/kg，一周一次)處理后沒有注意到抗腫瘤功效(圖5)。而且，在一項(xiàng)組合中，用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg，靜脈內(nèi)，一周一次，5x)和伊立替康(15mg/kg，腹膜內(nèi)，5天，3x)處理攜帶dld-1腫瘤的小鼠。該組合處理展現(xiàn)與相應(yīng)單一藥劑相比卓越的功效并實(shí)現(xiàn)72％腫瘤消退(圖6)。測(cè)試在伊立替康處理之前，之后5天或平行地用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理攜帶dld-1腫瘤的小鼠。平行組合處理展現(xiàn)與兩種藥劑的順序處理相比卓越的功效(圖7)。在又一項(xiàng)臨床前研究中，攜帶dld-1腫瘤的小鼠接受雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg)與抗vegf抗體b20(10mg/kg)或ang2/vegf抗體(10mg/kg)一起的組合處理，如記載于wo2011/117329。兩種抗體均在第8，15和22天一周一次給予。雖然dr5-fap抗體作為單一藥劑的處理導(dǎo)致顯著的腫瘤生長抑制(tgi87％)，含抗ang/vegf單抗的組合具有疊加的功效并將腫瘤生長抑制提高至94％。單獨(dú)的ang2/vegf抗體處理以75％抑制腫瘤生長(圖15)。在第二種基于細(xì)胞系的crc模型(hct116)中，評(píng)估雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg，靜脈內(nèi)，一周一次，3x)與伊立替康(15mg/kg，腹膜內(nèi)，5天，2x)和奧沙利鉑(5mg/kg)的組合。植入后7天開始處理，而且雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)的單一療法導(dǎo)致46％tgi。含伊立替康的組合展現(xiàn)卓越的功效并引起腫瘤消退(圖8)。而且，雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)與奧沙利鉑的組合療法提高功效至67％tgi(圖9)?；趌ox-imvi結(jié)締組織增生性黑素瘤細(xì)胞系的異種移植物模型研究第13至20天以10mg/kg的劑量用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理攜帶lox-imvi異種移植物的小鼠2次。另一組攜帶腫瘤的小鼠以10mg/kg(第13和20天)接受dr5靶向性fc突變體抗體drozitumablala的處理。結(jié)果是，雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理針對(duì)皮下lox-imvi異種移植物顯示顯著的強(qiáng)抗腫瘤功效(腫瘤停滯)。腫瘤生長抑制(tgi)對(duì)于雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)計(jì)算為超過100％(10mg/kg)，而drozitumablala處理功效較低(tgi65％)(圖10)。另外，用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg)與蒽環(huán)類抗生素多柔比星(adriamycin，5mg/kg，q7d)的組合處理攜帶lox-imvi的小鼠。雖然dr5-fap抗體(10mg/kg，第8和15天)作為單一藥劑的處理導(dǎo)致腫瘤停滯(tgi97％)，含多柔比星的組合具有大于疊加的功效并引起明顯的腫瘤消退(93％)。單獨(dú)的多柔比星處理以77％抑制腫瘤生長(圖16)?；赾o5896crc碎片的患者衍生異種移植物模型(pdx)研究第18至34天作為單一藥劑以30mg/kg的劑量用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理攜帶co5896crc異種移植物的小鼠6次(見圖11)。結(jié)果是，雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理顯示顯著的抗腫瘤功效，具有較強(qiáng)的針對(duì)皮下co5896患者衍生異種移植物的抗腫瘤功效。腫瘤生長抑制(tgi)計(jì)算為76％。另外，在一項(xiàng)組合研究中，自研究第15天起作為單一藥劑每周一次給予雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(30mg/kg)(4次)并與伊立替康(15mg/kg，第15-19天)組合。在雙特異性dr5-fap抗體與伊立替康的組合中觀察到卓越的功效，在所有動(dòng)物中導(dǎo)致完全腫瘤消退(10/10無腫瘤)(圖12)。通過ihc確認(rèn)co5896患者衍生異種移植物的基質(zhì)中存在fap(圖13)。基于sarc4605肉瘤碎片的患者衍生異種移植物模型(pdx)研究第10至31天作為單一藥劑以10mg/kg的劑量用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理攜帶sarc4605肉瘤異種移植物的小鼠4次(圖14)。結(jié)果是，雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理顯示顯著的抗腫瘤功效，具有較強(qiáng)的針對(duì)皮下sarc4605患者衍生異種移植物的抗腫瘤功效(腫瘤停滯)。腫瘤生長抑制(tgi)計(jì)算為超過100％。另外，用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg)與蒽環(huán)類抗生素多柔比星(adriamycin，5mg/kg，q7d)組合處理攜帶sarc4605腫瘤的小鼠。雖然dr5-fap抗體(10mg/kg，第20，27，34和41天)作為單一藥劑的處理導(dǎo)致腫瘤停滯(tgi99％)，含多柔比星的組合具有大于疊加的功效并引起明顯的腫瘤消退(83％)。單獨(dú)的多柔比星處理以77％抑制腫瘤生長(圖17)。而且，用雙特異性抗體dr5-fap(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg)與烷化藥物異磷酰胺(100mg/kg，q7dx2)組合處理攜帶sarc4605腫瘤的小鼠。單獨(dú)的dr5-fap抗體(10mg/kg，q7dx8)處理導(dǎo)致較強(qiáng)的腫瘤消退(96％及80％無腫瘤)，而含異磷酰胺的組合具有略微更高的功效(86％無腫瘤)。另外，組合中的腫瘤消退的動(dòng)力學(xué)更快(圖19)?；趐a1178和pa3137pdac碎片的異種移植物模型(pdx)研究第32至81天作為單一藥劑和與吉西他濱和nab-帕利他賽的組合以10mg/kg的劑量用雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理攜帶pa1178異種移植物的小鼠7次(見圖18)。作為單一藥劑以10mg/kg腹膜內(nèi)一周一次施用雙特異性抗體。在同一天施用相應(yīng)媒介。一周兩次腹膜內(nèi)以40mg/kg給予吉西他濱數(shù)周，并連續(xù)4天以6mg/kg靜脈內(nèi)施用nab-帕利他賽兩個(gè)周期。結(jié)果是，dr5-fap雙特異性抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)作為單一藥劑的處理顯示顯著的抗腫瘤功效，具有較強(qiáng)的針對(duì)皮下pa1178患者衍生異種移植物的抗腫瘤功效。與對(duì)照相比，腫瘤生長抑制(tgi)計(jì)算為96％。而且，與吉西他濱和nab-帕利他賽(abraxane)組合給予dr5-fap雙特異性抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)。該三重組合是有效的，在所有接受處理的動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)完全腫瘤消退，這在吉西他濱/nab-帕利他賽雙重組合給藥組中沒有實(shí)現(xiàn)。在第二種基于碎片的pdacpdx模型(pa3137)中，作為單一藥劑和與吉西他濱(腹膜內(nèi)，一周一次，40mg/kg)和nab-帕利他賽(6mg/kg，連續(xù)四天，靜脈內(nèi))的組合評(píng)估雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg，腹膜內(nèi)，一周一次，x8)的功效。植入后31天開始動(dòng)物處理，直至第66天。單一療法中雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)的功效導(dǎo)致40％tgi。雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)與吉西他濱和nab-帕利他賽(abraxane)的組合展現(xiàn)較好的功效，大多具有完全腫瘤消退(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例6：臨床前藥效學(xué)生物標(biāo)志物和組合策略進(jìn)行臨床前轉(zhuǎn)化研究來證明上靶(on-target)作用模式，確保最大活性及指導(dǎo)藥效學(xué)(pd)分析以闡明潛在抗性機(jī)制。材料和方法在與成纖維細(xì)胞共注射的基于結(jié)直腸癌(crc)細(xì)胞系的異種移植物模型(dld-1)中設(shè)計(jì)一項(xiàng)動(dòng)力學(xué)研究。在雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg)單劑處理之后6，16，72和168小時(shí)外植腫瘤，并收獲進(jìn)行針對(duì)凋亡標(biāo)志物的基于免疫組織化學(xué)(ihc)和elisa的蛋白質(zhì)分析，諸如受到切割的胱天蛋白酶3(cc3)，受到切割的parp和活化的胱天蛋白酶8和9。用用于平臺(tái)的凋亡人3-plex小組(lifetechnologies)測(cè)定受到切割的胱天蛋白酶3水平。使用map7-plex來測(cè)定磷酸化akt(ser473)，jnk(thr183/tyr185)，bad(ser112)，bcl-2(ser70)，p53(ser46)，活性胱天蛋白酶-8(asp384)和活性胱天蛋白酶-9(asp315)的變化。對(duì)于ihc分析，將腫瘤在3.8％緩沖的甲醛溶液中固定最多48小時(shí)并在paraplast中包埋。遵循一種例行的ihc染色方案使用ventanadiscoveryxt載玻片染色儀應(yīng)用針對(duì)受到切割的胱天蛋白酶-3的家兔多克隆抗體(asp175；cellsignalling)。為了分析雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)(10mg/kg)與多柔比星(5mg/kg)的組合處理，使用一種fap陽性結(jié)締組織增生性黑素瘤細(xì)胞系衍生模型(lox-imvi)。在處理之后3，6，16，72和168小時(shí)外植腫瘤。結(jié)果我們通過ihc和elisa在基質(zhì)中或直接在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)fap的異種移植物腫瘤中觀察到用雙特異性dr5-fap抗體處理后顯著的時(shí)間依賴性凋亡誘導(dǎo)。與媒介對(duì)照相比在處理之后早期通過ihc觀察到水平較高的瞬時(shí)的凋亡標(biāo)志物諸如cc3。通過elisa對(duì)等同組織裂解物的分析還揭示dld-1crc異種移植物模型中單一療法中cc3，受到切割的parp和活化的胱天蛋白酶8和9的快速誘導(dǎo)，它在lox-imvi結(jié)締組織增生性黑素瘤模型中與多柔比星一起給予時(shí)是卓越的。通過elisa對(duì)等同組織裂解物的分析揭示dld-1crc異種移植物模型中單一療法中cc3，受到切割的parp和活化的胱天蛋白酶8和9的快速誘導(dǎo)，它在與伊立替康或奧沙利鉑一起給予時(shí)是卓越的。圖20顯示在用單一藥劑雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)處理之后的luminex數(shù)據(jù)(elisa)。雙特異性dr5-fap抗體針對(duì)dld-1/3t3異種移植物誘導(dǎo)較強(qiáng)的時(shí)間相關(guān)腫瘤細(xì)胞凋亡。在抗體處理之后不久(6小時(shí))觀察到較強(qiáng)的效果。圖21顯示在用單一藥劑雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)或與多柔比星(10mg/kg)組合處理之后的luminex數(shù)據(jù)(elisa)。雙特異性dr5-fap抗體以時(shí)間相關(guān)方式強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。雙特異性dr5-fap抗體與多柔比星一起的組合處理在lox-imvi結(jié)締組織增生性黑素瘤模型中的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)是卓越的。圖22顯示在用單一藥劑雙特異性dr5-fap抗體(10mg/kg；dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)或與伊立替康(15mg/kg)或奧沙利鉑(5mg/kg)組合處理之后的luminex數(shù)據(jù)(elisa)。雙特異性dr5-fap抗體在dld-1crc異種移植物模型中以時(shí)間相關(guān)方式強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。雙特異性dr5-fap抗體與伊立替康或奧沙利鉑一起的組合處理的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)是卓越的。我們鑒定了雙特異性dr5-fap抗體(dr5結(jié)合物：vhseqidno.:7，vlseqidno.:8，fap結(jié)合物：vhseqidno.:15，vlseqidno.:16)在體內(nèi)在注射之后不久強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，不依賴于fap是在腫瘤基質(zhì)上或是在腫瘤細(xì)胞處表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)了最佳藥效學(xué)標(biāo)志物和用于采樣和分析的時(shí)間點(diǎn)。序列1.噬菌體展示衍生的dr5結(jié)合物的氨基酸序列2.fap結(jié)合物的氨基酸序列3.包含噬菌體展示衍生的dr5結(jié)合物的雙特異性分子的氨基酸序列雖然顯示和描述了本發(fā)明當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案，但是要清楚地理解，本發(fā)明不限于此而是可以在所述權(quán)利要求書的范圍內(nèi)以其它方式多種多樣地體現(xiàn)和實(shí)施。序列表<110>豪夫邁·羅氏有限公司（f.hoffmann-larocheag）<120>對(duì)fap和dr5特異性的雙特異性抗體和化療劑的組合療法<130>32336wo<160>20<170>patentinversion3.5<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_cdrh1<400>1sertyralametser15<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_cdrh2<400>2alaileserglyserglyglyserthrtyrtyralaaspservallys151015gly<210>3<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_cdrh3<400>3glyvalargvalserpheasptyr15<210>4<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_cdrhl1<400>4argalaserglnservalsersersertyrleuala1510<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_cdrl2<400>5glyalaserserargalathr15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_cdrl3<400>6glnglnglythrthrhisproilethr15<210>7<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_vh<400>7gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyserglyglyserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysglyvalargvalserpheasptyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserser115<210>8<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)_vl<400>8gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser202530tyrleualatrptyrglnglnl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ythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn195200205thrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhis210215220thrcysproprocysproalaproglualaalaglyglyproserval225230235240pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr245250255progluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspproglu260265270vallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalys275280285thrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalser290295300valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys305310315320cyslysvalserasnlysalaleuglyalaproileglulysthrile325330335serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro340345350proserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleu355360365vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn370375380glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser385390395400aspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserarg405410415trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu420425430hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglyglygly435440445glyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglygly450455460glysergluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnpro465470475480glyglyserleuargleusercysalaalaserglyphethrpheser485490495serhisalametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglu500505510trpvalseralailetrpalaserglygluglntyrtyralaaspser515520525vallysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleu530535540tyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyr545550555560cysalalysglytrpleuglyasnpheasptyrtrpglyglnglythr565570575leuvalthrvalserseralaservalalaalaproservalpheile580585590pheproproseraspgluglnleulysserglythralaservalval595600605cysleuleuasnasnphetyrproargglualalysvalglntrplys610615620valaspasnalaleuglnserglyasnserglngluservalthrglu625630635640glnaspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleu645650655serlysalaasptyrglulyshislysvaltyralacysgluvalthr660665670hisglnglyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglu675680685cys<210>19<211>215<212>prt<213>人工序列<220><223>dr5(5e11)lc<400>19gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglnglythrthrhispro859095ilethrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthrvalala100105110alaproservalpheilepheproproseraspgluglnleulysser115120125glythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproargglu130135140alalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnser145150155160glngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleu165170175serserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysval180185190tyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlys195200205serpheasnargglyglucys210215<210>20<211>214<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)_vlch1<400>20gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserargser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045ileileglyalaserthrargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglnglyglnvalilepro859095prothrpheglyglnglythrlysvalgluilelysserseralaser100105110thrlysglyproservalpheproleualaproserserlysserthr115120125serglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrphepro130135140gluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyval145150155160histhrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuser165170175servalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrile180185190cysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplyslysval195200205gluprolyssercysasp210當(dāng)前第1頁12