特異性識別胃癌細胞的DNA適配子GCA-5及其應用技術領域本發(fā)明涉及基因工程領域,具體是一種特異性識別胃癌細胞的DNA寡核苷酸適配子GCA-5的序列和修飾，以及修飾后的GCA-5在識別胃癌細胞方面的應用，包括用于臨床胃癌組織標本的輔助診斷、胃癌分子靶向診斷、胃癌生物導向治療，基礎研究中胃癌細胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標志物的識別和鑒定。

背景技術：
已證實，胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類生命健康。盡管早期胃癌的治療效果較好，但診斷率低；由于胃癌早期的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，多數(shù)胃癌患者確診時已屬進展期，手術及放化療效果都不理想。可見，胃癌的預后主要依賴于分期，其診斷和治療的重點是早期。目前，早期胃癌診治的主要手段（金標準）仍然是內(nèi)鏡活檢和內(nèi)鏡粘膜下切除術（YadaT,etal.DiagnTherEndosc2013;2013:241320）。然而，這需要特殊的儀器設備、較高的費用和施術者的經(jīng)驗積累，患者的耐受性和依從性也難以保證，因而仍然面臨普及難和不易實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷的問題。因此，更可靠、更方便、更廉價和更容易普及的胃癌診治手段亟待發(fā)現(xiàn)和制備應用。近年來，眾多的高通量生物技術方法不斷涌現(xiàn)，其中細胞-SELEX技術可篩選特異性結合于細胞的核酸適配子，這為腫瘤的早期診斷和治療提供了新的可能。SELEX是指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment）的英文縮寫，利用該技術通過多次反復的擴增和篩選循環(huán)，可以從隨機單鏈DNA或RNA庫中獲取特異性結合于靶物質的核酸序列，稱為適體（aptamer）或適配子；適配子具有精確識別、高特異性、高親和力結合靶標等特性，且容易在體外合成和修飾、理化性質穩(wěn)定、費用低廉、獲取周期短等優(yōu)勢。隨著SELEX技術本身的不斷發(fā)展以及靶標范圍的不斷拓展，近年出現(xiàn)了以活細胞為靶標進行的SELEX篩選，即細胞-SELEX（cell-SELEX或cell-basedSELEX）技術（徐發(fā)良,等.第二軍醫(yī)大學學報2012;33:432-435）。通過細胞-SELEX篩選而獲得的適配子，可用于腫瘤細胞的富集與檢測、腫瘤診斷、靶向治療和腫瘤標志物研究（FangX,etal.AccChemRes2010;43:48-57）。我們利用細胞-SELEX的篩選原理和實驗方法（SefahK,etal.NatProtoc2010;5:1169-1185），以胃癌細胞株為陽性篩選細胞、以正常胃粘膜細胞為對照細胞，建立了篩選腫瘤細胞DNA適配子的方法；該技術的一個顯著優(yōu)勢在于，研究者無須事先明確腫瘤細胞特定的靶分子，就可以篩選出特異性結合于腫瘤細胞的適配子。借助蛋白質組學的技術，可對適配子結合的靶標進行分離、鑒定，進而成為潛在的腫瘤標志物。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提出特異性識別胃癌細胞的DNA適配子GCA-5,以及修飾后的GCA-5在識別胃癌細胞方面的應用，包括用于臨床胃癌組織標本的輔助診斷、胃癌靶向診斷、基礎研究中胃癌細胞的分離、純化、鑒定和胃癌的生物導向治療。本發(fā)明是結合了國內(nèi)外的研究進展以及發(fā)明人自身的工作積累，以胃癌細胞株為靶標、以正常胃粘膜為消減靶標，通過成功建立細胞-SELEX技術篩選到一個適配子GCA-5（gastriccanceraptamer）。經(jīng)鑒定，GCA-5能特異性識別并結合胃癌細胞株，而不與正常胃粘膜細胞及結腸癌細胞株結合；尤其重要的是，GCA-5也能特異性識別并結合來自臨床胃癌手術標本的癌細胞；而對照核酸序列與上述細胞均無結合。這對于胃癌的臨床輔助診斷、分子靶向診斷和生物導向治療中所需試劑盒和藥物的制備具有重要意義。由于經(jīng)過FITC或TAMRA標記的GCA-5可以直接用于熒光方法檢測腫瘤細胞，其操作比傳統(tǒng)的免疫學方法更簡單。另外，GCA-5可能通過特定的靶標分子結合于胃癌細胞，從而在胃癌細胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標志物的鑒定方面得到應用。因此，本發(fā)明可以在臨床醫(yī)學和基礎醫(yī)學中得到廣泛應用。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術方案是這樣的，一種特異性識別胃癌細胞的DNA適配子GCA-5的核苷酸序列為:SEQIDNO.1。進一步可以再在所述核苷酸序列SEQIDNO.1的5’端標記熒光素（如FITC、TAMRA等）或酶類物質(生物素和地高辛)等，并通過熒光檢測設備、鏈親和素標記的辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)和抗地高辛抗體標記的堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)，對胃癌細胞進行示蹤、定位和檢測。上述核苷酸在制備靶向定位胃癌細胞的試劑盒中的應用。上述核苷酸在制備靶向殺滅胃癌細胞的藥物中的應用。上述核苷酸在制備胃癌細胞體外識別、分離和鑒定的試劑盒中的應用。上述核苷酸在制備分離或鑒定胃癌生物標記物的試劑盒中的應用。本發(fā)明能夠獲得的有益技術效果包括：1）與功能類似的蛋白類抗體相比，單鏈DNA理化性質更加穩(wěn)點；適配子體外合成的成本比抗體制備的成本低、周期短；適配子可直接在體外合成、修飾標記、批量生產(chǎn)，操作更簡便、迅速。2）GCA-5能特異性識別胃癌細胞株和胃癌手術標本的細胞，因此在胃癌的臨床輔助診斷、分子靶向診斷和生物導向治療藥物的制備方面具有重要價值。3）本發(fā)明證實GCA-5能特異性識別并結合胃癌細胞株和胃癌手術標本，從而在胃癌細胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標志物的鑒定方面具有廣泛的應用價值和廣闊的市場前景。附圖說明圖1為適配子GCA-5高親和力結合胃癌細胞株和手術標本結果圖；圖2為激光共聚焦分析FITC-GCA-5特異性識別胃癌細胞結果圖，圖中A表示正常人胃粘膜GES-1株，B表示人結腸癌細胞株Lovo，C表示人胃癌細胞株SGC-7901，D臨床胃癌標本細胞懸液。具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明作進一步說明，但不應該理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術思想的情況下，根據(jù)本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。1.以胃癌細胞株為靶標、以正常胃粘膜為消減靶標，通過細胞-SELEX技術篩選到一個適配子GCA-5。采用精確比對法，在NCBI網(wǎng)站提供的Blastn程序比對人、小鼠的編碼核酸數(shù)據(jù)庫和其他非編碼數(shù)據(jù)庫，均未發(fā)現(xiàn)與GCA-5相似的核酸序列。2.人工合成GCA-5及其對照序列RCA，均在5'端標記FITC（用于流式細胞檢測）或TAMRA（用于激光共聚焦），由上海生功公司完成：FITC-GCA-5或TAMRA-GCA-5：SEQIDNO.1：5'-ataccagcttattcaattgcacccataacaaggcacacgtggaaggtcttttgtacttcttttcaaatggagatagtaagtgcaatct-3'3.胃癌標本單細胞懸液的制作：1)取胃癌新鮮手術標本，用無菌PBS沖洗；2)用無菌剪刀剪成糊狀；3)200目銅網(wǎng)過濾，1000r/min離心5min以沉淀細胞，棄上清后用Hanks液漂洗；4)用臺盼藍染色法計數(shù)活細胞比例大于90%；5)用含10%FBS的培養(yǎng)基重懸細胞；6)調整細胞濃度為2×105/ml。4.細胞樣品制備、FCM檢測：1)FITC標記的GCA-5或RCA與2×105的正常胃粘膜細胞GES-1、結腸癌細胞Lovo、胃癌細胞SGC-7901、臨床胃癌標本細胞懸液共孵育于200ul含20%FBS的結合液；2)冰上放置50min令其結合；3)以0.7ml結合液(含0.1%的NaN3)洗滌兩次；4)以0.4ml結合液(含0.1%的NaN3)重懸；5)上FCM計數(shù)30000個細胞的平均熒光強度；6)以FITC標記的RCA作為背景熒光，計算相對親和力。5.細胞爬片，孵育、結合、共聚焦流圖：1)分別培養(yǎng)正常胃粘膜細胞GES-1、結腸癌細胞Lovo、胃癌細胞SGC-7901、臨床胃癌標本細胞懸液，調整濃度為2×105/ml，接種于預先放置了蓋玻片的6孔板，爬片過夜；甲醛-20℃固定2小時，PBS沖洗。2)取50pmol的TAMRA標記的GCA-5，與靶細胞結合于100ul含20%FBS的結合液；3)冰上放置50min令其結合；4)以0.7ml結合液(含0.1%的NaN3)洗滌兩次；5)以0.4ml結合液(含0.1%的NaN3)重懸；6)激光共聚焦顯微觀察與靶細胞結合的情況（在細胞的定位、數(shù)量）、留圖。實驗結果：GCA-5特異性結合于胃癌細胞株SGC-7901和臨床胃癌細胞的表面，但不與正常胃粘膜細胞GES-1或結腸癌細胞株Lovo結合，從而對胃癌細胞具有選擇性識別作用。由表1和圖1可以得到結論：GCA-5與胃癌細胞株SGC-7901或臨床胃癌標本的細胞高親和力結合，但與正常胃粘膜細胞GES-1或結腸癌細胞Lovo的親和力較低。對照序列RCA和四種細胞結合的親和力均較低。由圖2可以得到結論：GCA-5特異性結合于胃癌細胞株SGC-7901或臨床胃癌標本的細胞表面；但與正常胃粘膜細胞GES-1或結腸癌細胞Lovo幾乎無結合，由圖中A、B、C和D所示。序列的功能和應用：該序列的基本功能：能高親和力、特異性結合于胃癌細胞的表面。推定的應用領域主要包括：示蹤、研究、靶向診斷；靶向治療；其他識別和靶向應用領域。在示蹤技術方面，用放射性物質、熒光素或酶類等示蹤劑標記該DNA核苷酸，利用其特異性識別功能，通過相應的檢測手段即可進行定位甚至定性顯示胃癌細胞的存在，從而應用于實驗研究、腫瘤靶向診斷、定位診斷或大量篩查。在制備靶向治療藥物方面，將放射性治療藥物、細胞毒性藥物等殺腫瘤的藥物與該DNA核苷酸偶聯(lián)，利用其特異性識別功能，就可以達到靶向殺滅腫瘤細胞的作用。在其他涉及到腫瘤特異性識別和靶向作用的應用領域，也可采用該DNA寡核苷酸代替相應的抗體，達到更好的特異性識別和靶向作用的效果。表1平均熒光強度（FITC-GCA-5高親和力結合胃癌細胞）；*P<0.05SEQUENCELISTING<110>重慶市腫瘤研究所<120>特異性識別胃癌細胞的DNA適配子GCA-5及其應用<160>1<210>1<211>88<212>DNA<213>人工序列<400>SEQIDNO.1ataccagcttattcaattgcacccataacaaggcacacgtggaaggtcttttgtacttct60tttcaaatggagatagtaagtgcaatct88