用于抑制可溶生物分子的生物活性的組合物以及方法與流程
優先權
本專利申請要求于2014年10月3日提交的美國臨時專利申請號62/059,628、于2015年7月29日提交的美國臨時專利申請號62/198,519和于2015年7月29日提交的美國臨時專利申請號62/198,541的優先權，上述美國臨時專利申請各自以引用方式被整體并入本文。
背景技術：
臨床可用的或正在開發的許多抗癌療法涉及刺激免疫系統以識別或破壞癌癥的能力，或兩者同時兼具。最突出的三個療法是來自百時美施貴寶(bristol-myerssquibb)的抗檢查點抑制劑yervoy(ipilimumab，易普利姆瑪)、來自默克公司(merck)的keytruda(pembrolizumab，原名lambrolizumab)以及來自莫菲特癌癥中心/國家癌癥研究所(moffittcancercenter/nationalcancerinstitute)的被稱為帶有腫瘤浸潤淋巴細胞的過繼性細胞轉移(act/til)的細胞療法。然而，這些和其他途徑涉及受試者的免疫系統的凈上調，誘發與自身免疫病癥類似的潛在嚴重癥狀和/或其他顯著的副作用。
本領域需要更有效的藥理學途徑來克服癌癥，特別是轉移癌，而不擾亂受試者避免自身免疫的能力。除其他之外，本公開提供基于針對利用受試者的自身免疫系統對抗癌癥的可替換的途徑的方法和組合物，包含去抑制腫瘤微環境，即削弱腫瘤的防御系統，而不刺激免疫細胞。
技術實現要素：
除其他之外，本公開提供結合至并且抑制可溶生物分子的生物活性的組合物及其藥物組合物。本公開還提供一些應用，其中所述組合物是有用的。例如，本文中描述的組合物可用于抑制細胞(如癌細胞)的增殖、生長和/或存活。在另一個實施例中，本文中描述的組合物可以用于結合至并且中和受試者的循環中的毒素(例如動物毒素、細菌毒素和/或植物毒素)、病毒或其它外來化合物。
“多肽”、“肽”和“蛋白質”可互換使用并且意味著任何肽連接的氨基酸鏈，而不管長度或轉譯后修飾。
除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本公開所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。優選的方法和材料如下所述，盡管與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可以被用于本發明公開的方法和組合物的實踐或測試中。本文中提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻以引用方式被整體并入本文。
本公開預期任何前述方面和實施方案的所有組合，以及與具體實施方式和實施例中闡述的任何實施方案的組合。
附圖說明
圖1描繪了結合至可溶形式的tnf受體(tnfr)的顆粒的示例性實施方案。顆粒為1立方微米。顆粒的內表面包含被固定的tnf，所述被固定的tnf能夠結合至可溶tnfr并將可溶tnfr從其天然配體隔離(清除)。
圖2描繪了結合至可溶形式的tnf受體(tnfr)的顆粒的示例性實施方案。環狀顆粒的直徑為175nm。顆粒的內表面包含被固定的tnf，所述被固定的tnf能夠結合至可溶tnfr并將可溶tnfr從其天然配體中隔離(清除)。
圖3描繪了結合至可溶形式的tnf受體(tnfr)的顆粒的示例性實施方案。圖左側的顆粒是八面體，所述八面體具有最長尺寸為100至150nm的芯。圖右側的顆粒是二十面體，所述二十面體具有最長尺寸為200至300nm的芯。每個顆粒還包括從芯多面體結構的頂點指向外的分子突起。這些突起用作“細胞排斥劑”，所述“細胞排斥劑”抑制結合至顆粒的tnf與細胞表面tnfr之間的相互作用。
具體實施方式
本公開的特征在于用于將可溶生物分子從它的天然環境隔離的組合物和方法，例如，從而抑制可溶生物分子的生物活性。例如，本公開提供具有包括選擇性地結合至可溶生物分子的藥劑(例如，被固定在顆粒的表面上)的表面的顆粒或多個顆粒。一旦可溶生物分子被藥劑結合，它被顆粒隔離以致于可溶生物分子具有降低的與可溶生物分子的其他天然結合配偶體(partners)相互作用的能力(例如，大幅度降低的能力或無能力)。因此，可溶生物分子變成惰性的。
i.生物分子
可溶生物分子通常是特異性的結合對的第一構件。如本文中使用的，“結合配偶體”、“特異性的結合配偶體”或“特異性的結合對的構件”通常包括以很大程度的親和性和特異性彼此結合的結合構件對中的任何構件。一對結合配偶體可以彼此結合以達到樣品的其他組分的至少大部分或至少基本上樣品的所有其他組分的很大程度的排除，和/或可以具有小于約10-4、10-5、10-6、10-7或10-8m的解離常數等。一對結合配偶體可以以預先確定的方式“配合”在一起，所述預先確定的方式依賴于多個原子相互作用以合作地增加特異性和親和性。結合配偶體可以衍生自生物系統(例如，受體-配體相互作用)、化學相互作用、和/或通過分子烙印技術等。表1中給出了示例性相應的多對結合配偶對，也稱為特異性的結合對，其具有任意的和可互換的名稱“第一”和“第二”。
本文中使用的術語“生物分子”是指可以對活體產生作用的任何分子。在一些實施方案中，生物分子是原子，如鋰或鉛(例如，生物分子可以是金屬陽離子)。在一些實施方案中，生物分子不是原子或金屬離子。例如，生物分子可以是分子，如有機化合物或無機化合物。在一些實施方案中，生物分子是藥物，如華法林。生物分子可以是精神活性藥物，如二乙酰嗎啡。生物分子可以是毒物、毒素或毒液。生物分子可以是過敏原。生物分子可以是致癌物。生物分子可以是化學武器的藥劑，如神經藥劑。生物分子可以是病毒或類病毒。生物分子可以是生物體的內生分子，如激素、細胞因子、神經遞質、可溶胞外受體、抗體或可溶基質蛋白。生物分子可以是肽、多肽、蛋白質、核酸、碳水化合物或糖。生物分子可以包括肽、多肽、蛋白質、核酸、碳水化合物或糖。生物分子可以是脂質、類固醇或膽固醇。
生物分子可以是細胞表面受體的配體。配體可以是天然存在的配體或合成的配體。配體可以是受體的天然配體(例如，由受試者體內產生的配體)或非天然配體(例如，被引入進受試者的配體，如病毒或藥物)。生物分子可以是細胞溶質受體或核受體的配體。
表1.特異性的結合對的實施例
如上所述，已知腫瘤細胞通過排出可溶形式的細胞因子受體來保護自身免受宿主免疫監視，這些可溶受體結合至腫瘤微環境中的免疫細胞產生的細胞因子。例如，癌細胞排出可溶形式的tnf受體和其他細胞因子受體，如il-2受體和trail受體。這些可溶受體通過減輕細胞對tnfα、il-2和trail的促凋亡作用而賦予癌細胞生長優勢。karpatova等報道了由人癌細胞的67kd層粘連蛋白受體的排出，這可能增加腫瘤侵襲和轉移((1996)jcellbiochem60(2):226-234)。因此，本文中描述的顆粒可以被設計用于清除可溶形式的細胞表面受體蛋白，例如，用于治療癌癥。
因此，在一些實施方案中，細胞表面受體蛋白由癌細胞表達，和/或細胞表面受體蛋白是癌細胞以細胞表面受體蛋白的可溶形式排出的蛋白質。在一些實施方案中，細胞表面受體蛋白在被激活時誘導凋亡(例如，死亡受體)。在一些實施方案中，細胞表面受體蛋白是腫瘤壞死因子受體(tnfr)蛋白(例如，tnfr-1或tnfr-2)。在一些實施方案中，細胞表面受體蛋白是fas受體蛋白。在一些實施方案中，細胞表面受體蛋白是tnf相關凋亡誘導配體受體(trailr)蛋白、4-1bb受體蛋白、cd30蛋白、eda受體蛋白、hvem蛋白、淋巴毒素β受體蛋白、dr3蛋白或tweak受體蛋白。在一些實施方案中，細胞表面受體蛋白是白介素受體蛋白，例如il-2受體蛋白。應當理解，在這樣的實施方案中，靶標可溶生物分子可以是可溶形式的細胞表面受體，例如，排出自癌細胞。
本領域技術人員也將會理解本文中描述的顆粒也可用于清除更多種類的可溶生物分子，所述可溶生物分子的生物活性可以是，例如，不期望的。例如，顆粒可以被設計以結合至病毒殼體或包膜的組分，從而從受試者的血液中隔離病毒。在一些實施方案中，顆粒可以被設計在受試者的循環中結合并隔離毒素(例如，細菌毒素、植物毒素和動物毒素(如蛇毒的一種或更多種組分))。在一些實施方案中，顆粒可以被設計結合至并從受試者的循環中隔離小分子(例如，非法藥物或小分子毒素)。在這樣的實施方案中，顆粒可以用于從身體去除毒素，例如，在被蛇或昆蟲咬傷之后。在一些實施方案中，顆粒可以用于治療、預防、延緩發作或降低受試者的過敏性休克的嚴重性(例如，通過清除引起過敏性免疫應答的抗原)。
在一些實施方案中，可溶生物分子是病毒，例如，被藥劑結合的病毒結構蛋白(如病毒殼體或病毒包膜蛋白)。在這樣的實施方案中，顆粒可用作抗病毒療法，例如，用于感染病毒或有被感染病毒的風險的受試者。
在一些實施方案中，可溶生物分子是小分子或大分子。在一些實施方案中，可溶生物分子的最長尺寸不大于600nm(例如，小于550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50或25nm)。生物分子可以具有約
術語“特異性的結合”、“特異性地結合”、“選擇性的結合”、“選擇性地結合”和類似符合語法規則的術語，如本文中使用的，是指形成在生理條件下相對穩定的復合物的兩個分子。典型地，當結合常數(ka)高于106m-1s-1時，結合被認為是特異性的。因此，特異性的結合對的第一構件可以以至少(或大于)106(例如，至少或大于107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015或更高)m-1s-1的ka特異性地結合至所述結合對的第二構件。在一些實施方案中，選擇性的相互作用具有小于或等于10-3(例如，8×10-4、5×10-4、2×10-4、10-4或10-5)s-1的解離常數(kd)。
在一些實施方案中，選擇性的相互作用具有小于10-8、10-9、10-10、10-11或10-12m的kd。平衡常數kd是動力學速率常數的比率，即kd/ka。在一些實施方案中，選擇性的相互作用具有小于1×10-9m的kd。
如本文中使用的，當涉及兩個分子之間的相互作用時，術語“相互作用”是指分子彼此的物理接觸(例如，結合)。通常，這樣的相互作用導致所述分子中的一個或兩個的活性(所述活性產生生物學效應)。抑制這樣的相互作用導致參與相互作用的一個或更多個分子的活性的破壞。
如本文中使用的，術語“抑制”及其符合語法規則的等同物是指特定作用、功能或相互作用的降低、限制和/或阻斷。在一個實施方案中，所述術語是指降低給定輸出或參數的水平至至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％的數量或小于相應對照中的數量的數量(例如，特異性的結合對的兩個構件之間的相互作用的背景水平)。給定輸出或參數的降低的水平無需(盡管其可能)意味著絕對不存在輸出或參數。本發明不需要并且不限于完全消除輸出或參數的方法。很大程度的抑制可以是，例如兩個生物分子(例如結合對的第一和第二構件)之間的相互作用的至少50(例如，55、60、65、70、75、80、85、90或95或更大)％的抑制。
用于檢測相互作用或測量一個生物分子對另一個生物分子的親和性的方法是本領域已知的。例如，兩個生物分子的結合可以使用多種技術(如，但不限于，生物膜干涉(bli)、蛋白質印跡法、斑點雜交、表面等離子體共振法(spr)、酶聯免疫吸附測定(elisa)、
在一些實施方案中，可以使用本領域已知的用于表征兩個生物分子的相互作用的動力學參數的任何基于spr的測定來測定結合。任何商業可獲得的spr儀器包含(但不限于)biacore儀器(biacoreab；瑞典烏普薩拉)、lasys儀器(affinitysensors；馬薩諸塞州富蘭克林)、ibis系統(windsorscientificlimited；英國柏克斯郡)、sprcellia系統(日本激光和電子實驗室，日本北海道)和spr檢測器spreeta(德州儀器，德克薩斯州達拉斯)可用于本文中描述的方法。參見，例如，mullettetal.(2000)methods22:77-91；dongetal.(2002)reviewsinmolbiotech82:303-323；fivashetal.(1998)curropinbiotechnol9:97-101；和richetal.(2000)curropinbiotechnol11:54-61。
在一些實施方案中，可以使用octet的bli(fortebio有限公司)測定兩個生物分子之間的生物分子相互作用。bli是一種無標記的光學分析技術，所述bli通過實時測量生物傳感器末梢上的蛋白質層的厚度變化來感測被固定在生物傳感器末梢上的配體與溶液中的分析物之間的結合。
在一些實施方案中，alphascreen(珀金埃爾默儀器有限公司)測定可用于表征兩個生物分子的結合。首字母縮略詞alpha代表放大化學發光親和均相檢測(amplifiedluminescentproximityhomogeneousassay)。alphascreen是一種基于微珠的親和測定，所述測定通過測量供體和受體珠之間的能量轉移產生的信號來感測貼附于供體和受體珠的分子之間的結合。(參見，例如，eglenetal.(2008)currchemgenomics1:2-10)。
在一些實施方案中，
可以使用各種各樣的免疫測定技術，包含競爭的或非競爭的免疫測定。術語“免疫測定”包含技術，所述技術包含(但不限于)流式細胞術、facs、酶免疫分析法(eia)、如酶多種免疫測定技術(emit)、酶聯免疫吸附測定(elisa)、igm抗體捕捉elisa(macelisa)和微粒子酶免疫分析法(meia)、以及毛細管電泳免疫測定(ceia)、放射免疫測定(ria)、免疫放射測定法(irma)、熒光偏振免疫法(fpia)以及化學發光分析(cl)。如果需要的話，這樣的免疫測定可以是自動化的。免疫測定也可以與激光誘發熒光結合使用。脂質體免疫測定(如流動注射脂質體免疫測定和脂質體免疫傳感器)也適合用于本發明。此外，散射比濁分析(其中，例如，生物分子復合物的形成導致增加的光散射，所述光散射作為標志物濃度的函數被轉換峰值速率信號)適合于用于本發明的方法。在本發明的優選實施方案中，溫育產物通過elisa、ria、熒光免疫測定(fia)或可溶顆粒免疫測定(spia)被檢測。
在一些實施方案中，可以使用熱變性方法(涉及差示掃描熒光測定法(dsf)和差分靜態光散射(dsls))測定兩個生物分子的結合。
在一些實施方案中，可以使用基于質譜的方法(如，但不限于，耦合至質譜平臺的親和性選擇(as-ms))測定兩個生物分子的結合。這是一種無標記的方法，其中蛋白質和測試化合物被溫育，未結合的分子被洗掉，并通過ms分析蛋白質-配體復合物以在解絡步驟后進行配體鑒定。
在一些實施方案中，可以使用，例如，可檢測標記的蛋白質，如放射性標記的(例如32p、35s、14c或3h)、熒光標記的(例如fitc)或酶標記的生物分子，通過免疫測定或通過色譜檢測來定量兩個生物分子的結合。
在一些實施方案中，本發明預期了熒光偏振測定和熒光共振能量轉移(fret)測定在直接或間接地測量兩個生物分子之間的相互作用的程度的用途。
ii.顆粒
如本文中使用的，術語“顆粒”是指可以包括任何材料(例如氧化鋁、金屬(例如金或鉑)、玻璃、二氧化硅、乳膠、塑料、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯或任何聚合材料)并且可以為任意尺寸或形狀的小團塊(mass)。在一些實施方案中，顆粒或多個顆粒包括硅。參見，例如，國際專利申請公開號wo2013/011764、wo2013/029278和wo2014/151381以及美國專利申請公開號2014/0271886，其每一個的公開內容以引用方式被整體并入本文。在一些實施方案中，顆粒可以包括或由淀粉組成(參見，例如，國際專利申請公開號wo2010/084088)。
本文的特征也在于顆粒的收集。在一些實施方案中，多個顆粒具有窄的或寬的多分散性。如本文中使用的，“多分散性”是指特定顆粒群內顆粒的尺寸范圍。也就是說，極度多分散的群體可能包含具有1微米的平均尺寸的顆粒，其中單個顆粒的范圍為0.1至4微米。在一些實施方案中，“窄的多分散性”是優選的。也就是說，假定特定的平均顆粒尺寸，目前優選的是群體中的單個顆粒與平均顆粒尺寸的差異不超過±20％，優選地不超過±15％，并且目前最優選地不超過±10％。更具體地，顆粒群優選地具有約1微米或更小的平均顆粒尺寸。因此，如果選擇1微米的平均顆粒尺寸，群體中的單個顆粒將最優選地在約0.8至約1.2微米的范圍內。在一些實施方案中，顆粒群具有約0.3至約1微米的平均顆粒尺寸，例如，約0.4至約0.9、約0.5至0.9、約0.4至0.8、約0.5至0.7、約0.3至0.9或約0.3至約0.7微米。
在一些實施方案中，本公開的特征在于具有確定的平均顆粒尺寸的一些或多個顆粒。如本文中使用的，通過測量單個顆粒的尺寸，然后除以顆粒的總數來獲得“平均顆粒尺寸”。平均顆粒尺寸的測定是本領域公知的。典型地，顆粒的最長平均尺寸不大于1μm。在一些實施方案中，顆粒是納米顆粒。在一些實施方案中，顆粒的最長平均尺寸不大于900(例如850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、450、400、350、250、200或150)nm。在一些實施方案中，顆粒被確定形狀和尺寸以在受試者(例如人類受試者)的血液或脈管系統(例如動脈、靜脈和毛細血管)中循環。示例性顆粒設計在圖1至3中闡述。
在一些實施方案中，多個顆粒是多面體的，例如，立方體的。在一些實施方案中，多個顆粒是球形的。在一些實施方案中，本文中描述的任意顆粒可以是多孔的。這樣的多孔顆粒包括外表面和所述顆粒的孔的多個內表面。藥劑可以，例如，被固定在所述多個內表面上。在一些實施方案中，多個孔具有至少50nm的橫截面尺寸。在一些實施方案中，多個孔具有至少100nm的橫截面尺寸。例如美國專利申請公開號20140199352、20080277346和20040105821已經描述了多孔納米顆粒，其每一個的公開內容以引用方式被整體并入本文。例如美國專利號8,778,830和8,586,096已經描述了球形顆粒，其每一個以引用方式被并入本文。
在一些實施方案中，球形顆粒還可以包括從顆粒的球形表面延伸的兩個相交的脊，其中每個結構的最長尺寸不大于1μm，并且其中脊被確定尺寸并且被定向：(i)以抑制被固定在球形顆粒的表面上的藥劑結合至或激活細胞表面受體蛋白，和/或(ii)當可溶生物分子被結合至藥劑時，以抑制可溶生物分子與特異性的結合對的第二構件的相互作用，可溶生物分子是特異性的結合對的第一構件。
在一些實施方案中，多個顆粒是環形的。在這樣的實施方案中，藥劑可以被固定在顆粒的內周表面上(例如在洞周圍，參見圖2)。在一些實施方案中，顆粒的直徑不大于600(例如，550、500、450、400、350、300、200或150)nm。
在一些實施方案中，本文中描述的顆粒是樹枝狀的。例如，duetal.(2015)small11(4):392-413、美國專利號5,814,272和7,932,311以及美國專利申請公開號no.20040166166描述了這樣的顆粒，其每一個的公開內容以引用方式被并入本文。如下文詳述的，在一些實施方案中，樹枝狀顆粒的幾何結構是這樣以致于被固定在顆粒的內表面上的藥劑具有降低或大幅度降低的與細胞表面上的生物分子相互作用的能力，和/或通過藥劑被結合至顆粒的可溶生物分子具有降低或大幅度降低的與其同源配體(特異性的結合對的第二構件)相互作用的能力。
在一些實施方案中，多個顆粒是多面體的，例如八面體的或二十面體的(參見，例如，圖3)，無論是規則的還是不規則的。顆粒可以包括至少一個來自所述顆粒的頂點中的至少一個的突起(參見，例如，圖3)。顆粒可以包括多于一個(例如2、3、4、5、6、7或8或更多個)的來自所述顆粒的頂點的突起。這樣的突起可以是，例如，被確定尺寸和/或被定向的：(i)以抑制被固定在球形顆粒的表面上的藥劑結合至或激活細胞表面受體蛋白和/或(ii)當可溶生物分子被結合至藥劑時，以抑制可溶生物分子與特異性的結合對的第二構件的相互作用，生物分子是特異性的結合對的第一構件。
ⅲ.包括孔的顆粒
在一些實施方案中，用于制備顆粒的材料(例如硅)可以具有約40％至約95％(如約60％至約80％)的孔隙率。如本文中使用的，孔隙率是材料中的孔隙空間的量度，并且是孔隙體積占材料總體積的分數。在某些實施方案中，載體材料具有至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或甚至至少約90％的孔隙率。在具體實施方案中，孔隙率大于約40％，例如大于約50％、大于約60％或甚至大于約70％。
在某些實施方案中，藥劑從材料表面分布至孔深度至少約0.005微米、至少0.05微米、至少約0.1微米、至少約0.2微米、至少約0.3微米、至少約0.4微米、至少約0.5微米、至少約0.6微米或至少約0.7微米。在某些實施方案中，藥劑大體上均勻地分布在載體材料的孔中。
藥劑可以被裝載至顆粒內至一深度，所述深度被測量為與顆粒的總寬度的比率。在某些實施方案中，藥劑分布至顆粒中至少約10％的深度、至顆粒中至少約20％的深度、至顆粒中至少約30％的深度、至顆粒中至少約40％的深度、至顆粒中至少約50％的深度，或至顆粒中至少約60％的深度。
孔尺寸可以被預先選擇為藥劑和靶標生物分子的尺寸特性，以控制生物分子的釋放。典型地，太小的孔尺寸妨礙藥劑的裝載和/或生物分子的結合。例如，材料的平均孔徑可以選自針對于高分子量分子(例如200,000-500,000amu)的較大的孔(例如15nm至40nm)和針對于具有較低分子量的分子(例如10,000-50,0000amu)的較小的孔(例如2nm至10nm)。例如，直徑約6nm的平均孔尺寸可以適合于分子量為約14,000至15,000amu(如約14,700amu)的分子。分子量約為45,000至50,000amu(如約48,000amu)的分子可以選擇直徑約10nm的平均孔尺寸。分子量約為150,000nm的分子可以選擇直徑約25-30nm的平均孔尺寸。
孔尺寸可以被預先選擇以適應藥劑或生物分子的分子半徑。例如，直徑約25nm至約40nm的平均孔尺寸可以適合于最大分子半徑為從約6nm至約8nm的分子。分子半徑可以通過任何合適的方法計算，例如通過使用基于x射線晶體學數據的分子的物理尺寸或使用代表分子的溶液狀態尺寸的流體動力學半徑來計算。由于溶液狀態計算取決于進行計算的溶液的性質，某些測量可能優選使用基于x射線晶體學數據的分子的物理尺寸。如本文中使用的，最大分子半徑反映了治療劑的最大尺寸的一半。
在某些實施方案中，平均孔徑被選擇以限制孔內分子(例如，蛋白質)的聚集。阻止生物分子(如蛋白質)在載體材料中聚集將是有利的，因為此聚集被認為妨礙了分子受控釋放至生物系統中。因此，由于孔尺寸和生物分子的尺寸之間的關系，允許例如在任何同一時間只有一個生物分子進入孔的孔，將比允許多個生物分子一起進入孔并在孔內聚集的孔更為優選。在某些實施方案中，多個生物分子可以被裝載到孔中，但是由于孔的深度，分布遍及整個孔深度的蛋白質將以較小的程度聚集。
iv.藥劑
在一些實施方案中，顆粒的幾何結構使得被固定的藥劑具有降低的或大幅度降低的與細胞表面上的生物分子相互作用的能力。例如，在一些實施方案中，被固定在本文中描述的顆粒表面上的tnfα或il-2具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游離tnfα或il-結合至細胞表面上的tnfα受體或il-2受體的能力。在一些實施方案中，結合至顆粒的可溶生物分子具有降低的或大幅度降低的與其同源配體(特異性的結合對的第二構件)相互作用的能力。例如，結合至如本文中描述的顆粒的可溶tnfr具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游離可溶tnfr與游離tnfα相互作用的能力。在另一個實施例中，結合至本文中描述的顆粒的可溶病毒粒子(virion)具有小于50(例如，45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)％的游離病毒粒子與其同源細胞表面受體相互作用并感染細胞的能力。能夠降低或大幅度降低藥劑與細胞表面上的生物分子的相互作用或結合至顆粒的生物分子與其同源配體之間的相互作用的示例性顆粒幾何結構在圖1至3中描述并在本文中描述。
在一些實施方案中，被固定在顆粒表面上的藥劑是小分子、大環化合物、多肽、擬肽化合物、適配子(aptamer)、核酸或核酸類似物。本文中使用的“小分子”是指具有小于約6kda并且最優選小于約2.5kda的分子量的藥劑。許多制藥公司具有廣泛的化學和/或生物混合物庫，所述庫包括小分子陣列，通常包括真菌、細菌或藻類提取物，所述庫可以用應用的任何測定進行篩選。除其他之外，本申請預期了使用小型化學庫、肽庫或天然產物的集。tan等描述了一種具有超過二百萬種合成化合物的庫，所述庫與小型化的基于細胞的測定兼容(jamchemsoc(1998)120:8565-8566)。
擬肽物可以是化合物，其中受試者多肽的至少一部分被修飾，并且擬肽物的三維結構保持與受試者多肽的三維結構基本上相同。擬肽物可以是本公開的受試者多肽的類似物，所述擬肽物本身是在受試者多肽序列內包含一個或更多個取代或其它修飾的多肽。可替換地，受試者多肽序列的至少一部分可以用非肽結構代替，以致于受試者多肽的三維結構被基本上保留。換句話說，受試者多肽序列內的一個、兩個或三個氨基酸殘基可以被非肽結構代替。此外，受試者多肽的其它肽部分可以(但不需要)用非肽結構代替。擬肽物(肽和非肽基類似物兩者都)可以具有改善的性質(例如降低的蛋白水解、增加的固位力或增加的生物利用度)。擬肽物通常具有改善的口服可用性，這使得它們特別適合于治療人或動物。應該注意的是，擬肽物可以具有或可以不具有相似的二維化學結構，但是具有共同的三維結構特征和幾何結構。每個擬肽物可以還具有一個或更多個獨特的附加的結合要素。
適配子是短的寡核苷酸序列，所述適配子可以被用于識別并特異性地結合幾乎任何分子(包含細胞表面蛋白)。指數富集配體系統進化(selex)過程是有力的并且可以被用于容易地鑒定這樣的適配子。適配子可以被制備用于治療和診斷的寬泛范圍的重要的蛋白質(如生長因子和細胞表面抗原)。這些寡核苷酸以與抗體相似的親和性和特異性結合其靶標(參見，例如，ulrich(2006)handbexppharmacol173:305-326)。
如上指出的，術語“抗體”是指包含不同的同種型的抗體的全部抗體，如igm、igg、iga、igd和ige抗體。術語“抗體”包含多克隆抗體、單克隆抗體、被嵌合的或嵌合抗體、人源化抗體、靈長類抗體、去免疫抗體和完全人抗體。抗體可以被制備成或衍生自任意多種物種，例如哺乳動物，如人、非人靈長類(例如猩猩、狒狒或黑猩猩)、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠和小鼠。抗體可以是純化的或重組抗體。
術語“抗體片段”、“生物分子結合片段”或類似術語是指保留結合靶標抗原的能力的抗體的片段。這樣的片段包含，例如，單鏈抗體、單鏈fv片段(scfv)、fd片段、fab片段、fab’片段或f(ab’)2片段。scfv片段是單多肽鏈，所述scfv片段包含衍生scfv的抗體的重鏈和輕鏈可變區兩者。此外，胞內抗體、微抗體(minibodies)、三鏈抗體(triabodies)和雙鏈抗體(diabodies)也包含在抗體的定義中，并且與本文中描述的方法兼容使用(參見，例如，todorovskaetal.(2001)jimmunolmethods248(1):47-66；hudsonandkortt(1999)jimmunolmethods231(1):177-189；poljak(1994)structure2(12):1121-1123；rondonandmarasco(1997)annualreviewofmicrobiology51:257-283，其每一個的公開內容以引用方式被整體并入本文)。雙特異性的抗體(包含dvd-ig抗體)也被術語“抗體”涵蓋。雙特異性的抗體是對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體，優選地是人或人源化抗體。
如本文中使用的，術語“抗體”還包含，例如單結構域抗體，如被嵌合的(camelized)單結構域抗體。參見，例如，muyldermansetal.(2001)trendsbiochemsci26:230-235；nuttalletal.(2000)currpharmbiotech1:253-263；reichmannetal.(1999)jimmunolmeth231:25-38；pct申請公開號wo94/04678和wo94/25591；美國專利號6,005,079、6,015,695和7,794,981，其全部以引用方式被整體并入本文。在一些實施方案中，本公開提供包括具有修飾的兩個vh結構域的單結構域抗體，以致于形成單結構域抗體。
在一些實施方案中，藥劑是非抗體支架蛋白。通常通過預先存在的配體或抗原結合蛋白的組合的基于化學的適應調整來獲得這些蛋白質。例如，人轉鐵蛋白對人轉鐵蛋白受體的結合部位可以使用組合化學被修飾以創造轉鐵蛋白變體的不同的庫，所述庫的一些具有對不同抗原的后天的親和性(參見alietal.(1999)jbiolchem274:24066-24073)。不涉及結合受體的人轉鐵蛋白部分保持不變并且用作支架(類似抗體的框架區)以呈現變體結合部位。然后將庫作為抗體庫針對感興趣的靶標抗原進行篩選以確定具有對靶標抗原的最佳選擇性和親和性的那些變體。非抗體支架蛋白雖然與抗體功能相似，但與抗體相比具有許多優點，所述優點包含(除其他之外)增強的溶解度和組織穿透性、制造成本更低和易于與其他感興趣的分子接合(參見heyetal.(2005)trendsbiotechnol23(10):514-522)。
本領域技術人員將會理解非抗體支架蛋白的支架部分可以包含，例如全部或部分：金黃色葡萄球菌蛋白a的z結構域、人轉鐵蛋白、人第十纖連蛋白iii型結構域、人胰蛋白酶抑制劑的kunitz結構域、人ctla-4、錨蛋白重復蛋白、人脂質運載蛋白、人晶狀體蛋白、人泛素或來自大腸桿菌的胰蛋白酶抑制劑(參見heyetal.(2005)trendsbiotechnol23(10):514-522)。
在一些實施方案中，藥劑是靶標生物分子的天然配體。例如，藥劑可以是細胞因子。如本文中使用的，術語“細胞因子”是指影響細胞的功能的任何分泌的多肽并且是調節免疫、炎癥或造血反應中的細胞之間的相互作用的分子。細胞因子包含(但不限于)單核因子和淋巴因子，不管何種細胞產生它們。例如，單核因子通常是指由單核細胞產生和分泌的，如巨噬細胞和/或單核白細胞。然而很多其他細胞也產生單核因子，例如天然殺傷細胞、纖維母細胞、嗜堿粒細胞、中性粒細胞、內皮細胞、腦星形膠質細胞、骨髓間質細胞、表皮角化細胞和b淋巴細胞。淋巴因子通常是指由淋巴細胞產生的。細胞因子的實施例包含(但不限于)白介素-1(il-1)、白介素-2(il-2)、白介素-6(il-6)、白介素-8(il-8)、腫瘤壞死因子-α(tnf-α)和腫瘤壞死因子β(tnf-β)。
在一些實施方案中，藥劑是腫瘤壞死因子(tnf)家族配體，例如tnf家族配體選自tnfα、tnfβ、fas配體、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1bb配體、cd30配體、eda-a1、light、tla1、tweak、tnfβ和trail。
在一些實施方案中，藥劑是靶標生物分子的天然配體的變體，例如白介素多肽的變體，如變體il-2或變體tnfα。根據本發明的一些實施方案，變體可以包含一種或更多種氨基酸取代、缺失或插入。取代可以是保守的或非保守的。如本文中使用的，術語“保守取代”是指用具有相似的空間性質的天然或非天然存在的氨基酸代替給定的多肽中的天然序列中存在的氨基酸。當待替代的天然氨基酸的側鏈是極性的或疏水性的時，保守取代應該是用也是極性的或疏水性的天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，并且可選地與被代替的氨基酸的側鏈具有相同或相似的空間性質。保守取代典型地包含以下基團中的取代：甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺，絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸、組氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。一個字母氨基酸縮寫如下：丙氨酸(a)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、半胱氨酸(c)、甘氨酸(g)、谷氨酰胺(q)、谷氨酸(e)、組氨酸(h)、異亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、賴氨酸(k)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、脯氨酸(p)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)、色氨酸(w)、酪氨酸(y)和纈氨酸(v)。變體還包含全長野生型天然配體的片段以及相對于衍生出所述片段的野生型全長天然配體，包括一個或更多個氨基酸取代、插入或缺失的片段。
如本文中使用的，短語“非保守取代”是指通過具有不同電化學和/或空間性質的另一天然或非天然存在的氨基酸代替母體序列中存在的氨基酸。因此，取代氨基酸的側鏈可以比被取代的天然氨基酸的側鏈顯著更大(或更小)和/或可以具有與被取代的氨基酸顯著不同的電子性質的官能團。
在一些實施方案中，變體多肽包括相對于衍生出所述變體多肽的野生型全長多肽的至少2個(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或大于100個)氨基酸取代、缺失或插入。在一些實施方案中，變體多肽包含相對于衍生出所述變體多肽的野生型全長多肽的不超過150個(例如不超過145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個)氨基酸取代、缺失或插入。
在一些實施方案中，變體多肽(例如，變體il-2或tnfα多肽)保留至少10(例如，至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100)％的衍生出所述變體多肽的野生型全長多肽結合至靶標生物分子(例如，特異性的結合對的構件，其中野生型全長多肽是所述特異性的結合對的構件)的能力。在一些實施方案中，變體多肽將具有大于衍生出變體的野生型全長多肽的對靶標生物分子的親和性。例如，在一些實施方案中，變體多肽具有比衍生出變體多肽的野生型全長多肽大2(3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、500或甚至1000)倍的對靶標生物分子的親和性。用于檢測或測量兩種蛋白質之間的相互作用的方法是本領域已知的并且如上所述。
在一些實施方案中，野生型全長天然配體調節細胞表面受體的活性。因此，相對于野生型天然配體的活性，天然配體的變體可以具有增強的或降低的調節受體活性的能力。例如，在一些實施方案中，變體多肽具有小于90(例如85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或小于5)％的衍生出所述變體多肽的全長野生型多肽的激活細胞表面受體蛋白的能力。在一些實施方案中，變體多肽不激活其結合的受體。
這樣的示例性變體多肽是本領域已知的。例如，國際專利申請公開號wo2012/085891描述了具有降低的三聚能力并且因此具有降低的激活tnf家族受體的能力的tnf家族配體變體(也參見美國專利申請公開號us2014/0096274，以引用方式并入本文)。然而變體tnf配體保留結合至tnf家族受體的能力。用于比較變體和野生型天然配體之間的活性的合適的方法是本領域已知的。
在一些實施方案中，可溶生物分子是細胞表面受體的配體，例如細胞因子或趨化因子，如任何的本領域已知的或本文中描述的那些。在一些實施方案中，配體是腫瘤壞死因子(tnf)家族配體或其變體。在一些實施方案中，tnf家族配體是tnfα或其變體。在一些實施方案中，tnf家族配體是fas配體、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1bb配體、cd30配體、eda-a1、light、tla1、tweak、tnfβ、trail或前述任一項的變體。
在一些實施方案中，可溶生物分子是表2中鑒定的一個。
表2.示例性可溶生物分子和/或藥劑
“ad”是指自身免疫性病癥和/或炎癥病癥。“oa”是指骨關節炎。
在一些實施方案中，每個顆粒包括多種藥劑。所述多種藥劑可以包括10至約109份藥劑，如約103至約107份藥劑或約104至約106份藥劑。
v.生產抗體的方法
如上所述，在一些實施方案中，被固定在顆粒或多個顆粒的表面上的藥劑是抗體或其抗原結合片段。抗體可以通過本領域已知的方法被引發。例如，可以用免疫原性形式的可溶生物分子(例如，可溶tnfr、毒素或病毒蛋白)免疫哺乳動物(如小鼠、倉鼠或兔子)。可替換地，可以通過使用在體內表達生物分子(例如可溶蛋白質)的核酸進行免疫，從而產生觀察到的免疫原性應答。賦予蛋白質或肽免疫原性的技術包含與載體的接合或本領域公知的其它技術。例如，本發明的多肽的肽基部分可以在佐劑的存在下被施用。通過檢測血漿或血清中的抗體滴度可以監測免疫進展。標準elisa或其他免疫測定可與作為抗原的免疫原一起使用以評估抗體水平。
免疫之后，可以獲得與本發明的多肽反應的抗血清，如果需要，也可以獲得從血清中分離出的多克隆抗體。為了產生單克隆抗體，產生抗體的細胞(淋巴細胞)可以從免疫動物被收獲，并通過標準體細胞融合過程與永生化細胞(如骨髓瘤細胞)融合以產生雜交瘤細胞。這樣的技術在本領域中是公知的，并且包含例如雜交瘤技術(最初由kohler和milstein開發，(1975)nature,256:495-497)、作為人b細胞雜交瘤技術(kozbaretal.,(1983)immunologytoday,4:72)和用于產生人單克隆抗體的ebv雜交瘤技術(coleetal.,(1985)monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.pp.77-96)。可以免疫化學篩選雜交瘤細胞以產生與本發明的多肽特異性地反應的抗體和分離的單克隆抗體。
vi.顆粒清除率
在一些實施方案中，顆粒包括清除劑。清除劑可以通過生物學途徑促進顆粒的清除，如通過尿液中排泄、降解、通過肝膽途徑排泄和/或吞噬作用。
例如，顆粒可以包括儲存器，其中所述儲存器包括清除劑。儲存器可以是顆粒體中的孔或孔隙，例如多孔硅顆粒體中的孔隙。
對于包括孔的顆粒，儲存器可以是孔，或者儲存器可以大于或小于平均孔尺寸。儲存器可以由顆粒體中的凹部(例如淺凹部)組成，其中凹部的寬度或直徑大于平均孔尺寸的寬度或直徑。儲存器的寬度或直徑可以是平均孔尺寸的寬度或直徑的至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400或甚至是約500倍。儲存器的寬度或直徑可以是平均孔尺寸的寬度或直徑的約2倍至約10倍，如約2倍至約8倍或約2倍至約6倍。儲存器的寬度或直徑可以是平均孔徑的寬度或直徑的約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400或甚至是約500倍。
儲存器可以包括開口。開口可被蓋或構件覆蓋，從而抑制清除劑與細胞和/或胞外蛋白(例如，抗體)之間的相互作用。蓋或構件可以包括聚合物，如可生物降解的聚合物。蓋或構件可以在預定時間段后降解(例如通過水解)，從而將清除劑暴露于細胞和/或胞外蛋白。蓋或構件可以在暴露于生物流體(如血漿或細胞外液)約1天至約5年后(如約1天至約3年或約1天至約1年)降解。
預定時間段可以是顆粒處于液體(例如，水液體)中的時間段。預定時間段可以是顆粒體內滯留的時間段(例如，暴露于生物流體、ph、酶和/或溫度)。可以通過將顆粒結合至生物分子至少部分地來確定預定時間段。例如，顆粒可以被配置以致于生物分子的結合將清除劑暴露于細胞和/或胞外蛋白(參見例如pct專利申請公開號wo2014/170899，其以引用方式并入本文)。預定時間段可以是約1天至約5年，如約1天至約3年或約1天至約1年。
美國專利號7,918,842描述了適合用作蓋或膜的示例性材料，其以引用方式并入本文。通常，這些材料通過酶水解或在體內或體外暴露于水或通過表面或體積侵蝕而降解或溶解。代表性的合成的可生物降解的聚合物包含：聚(酰胺)，如聚(氨基酸)和聚(肽)；聚(酯)，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(己內酯)；聚(酸酐)；聚(原酸酯)；聚(碳酸酯)；及其化學衍生物(化學基團的取代、添加，例如烷基、亞烷基、羥基化、氧化和本領域技術人員常規制備的其它修飾)、其共聚物和混合物。可用于蓋或膜的其它聚合物包含：聚(醚)，如聚(環氧乙烷)、聚(乙二醇)和聚(四氫呋喃)；乙烯基聚合物-聚(丙烯酸酯)和聚(甲基丙烯酸酯)，如甲基、乙基、其它烷基、甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸和甲基丙烯酸，以及其他，如聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和聚(醋酸乙烯酯)；聚(氨酯)；纖維素及其衍生物，如烷基、羥烷基、醚、酯、硝化纖維素和各種醋酸纖維素；聚(硅氧烷)；及其任何化學衍生物(化學基團的取代、添加，例如，烷基、亞烷基、羥基化、氧化和本領域技術人員常規制備的其它修飾)、其共聚物和混合物。在某些實施方案中，儲存器蓋由一種或更多種交聯聚合物(如交聯的聚乙烯醇)形成。
在一些實施方案中，顆粒包括覆層。在一些實施方案中，覆層包括清除劑。覆層可以遮蔽清除劑。
顆粒可以包括第一表面和第二表面；藥劑可以被固定在第一表面上；并且覆層可以覆蓋第二表面的至少一部分。第一表面可以是內表面或內部表面，例如，第一表面可以被定向以致于藥劑具有降低的結合至細胞表面上的分子的能力。內表面或內部表面的實施例包含孔、儲存器或管的內壁、環形線圈的內周表面或凹面的中空。內表面或內部表面的其它實施例包含顆粒的外部表面，其中通過一個或更多個突起來保護外表面免受與細胞的相互作用。第二表面可以是外表面，例如，第二表面可以被定向以致于覆層可以與細胞相互作用。
覆層可以抑制顆粒之間的相互作用，例如，覆層可以降低顆粒形成聚集體的傾向。覆層可以抑制顆粒與細胞之間的相互作用，例如，通過呈現生物惰性表面。覆層可以抑制與胞外分子的非特異性的相互作用，例如，生物分子的非特異性的吸附。覆層可以抑制與細胞或胞外分子的特異性的相互作用，例如，覆層可能不利于或延緩顆粒的排泄或吞噬作用。覆層可以靶向顆粒以進行排泄或吞噬作用。靶向顆粒以進行排泄或吞噬作用的覆層或其他特征(例如，“排泄誘導化合物”)可以通過延緩顆粒的排泄或吞噬作用的覆層(例如，第二覆層)被遮蔽，例如，以促進血流中的顆粒維持預定量的時間。
顆粒可以包括第二覆層，例如，其中第二覆層由第二多個覆層分子組成。顆粒可以包括第二多個覆層分子。第二覆層和/或第二多個覆層分子可以減小顆粒的體內清除率，例如，通過遮蔽覆層和/或多個覆層分子。第二覆層和/或第二多個覆層分子可以是可生物降解的，例如，在預定時間段后將覆層和/或多個覆層分子暴露于細胞和/或胞外蛋白。第二覆層和/或第二多個覆層分子可以包括可生物降解的聚合物，例如第二多個覆層分子的每個分子可以包括可生物降解的聚合物。第二覆層和/或第二多個覆層分子可以包括抑制吞噬作用的cd47。
在一些實施方案中，顆粒包括第一表面(例如，內表面)和第二表面(例如，外表面)；藥劑被固定在第一表面上；并且覆層覆蓋第二表面的至少一部分。第一表面的定向可以降低藥劑與細胞表面上的分子相互作用的能力。第二表面的定向可以允許覆層與細胞、胞外分子和/或不同顆粒之間的相互作用。覆層與細胞、胞外分子和/或不同顆粒之間的“相互作用”可以是弱的、中性的或不利的相互作用，例如，不利于顆粒與細胞、胞外分子或其它顆粒的穩定結合。可替換地，覆層與細胞和/或胞外分子之間的相互作用可以是特異性的或被設計的相互作用，例如，有利于通過生物學途徑(如吞噬作用)進行顆粒的清除。在某些優選實施方案中，第二表面基本上不含藥劑。在某些優選實施方案中，第一表面基本上不含覆層。在某些優選實施方案中，覆層覆蓋基本上全部的第二表面。
在一些實施方案中，顆粒包括第一表面(例如，內表面)和第二表面(例如，外表面)；藥劑被固定在第一表面和第二表面上；并且覆層覆蓋第二表面的至少一部分。在這樣的實施方案中，覆層(和/或第二覆層)可以抑制藥劑與細胞表面上的分子之間的相互作用。在某些優選實施方案中，覆層覆蓋基本上全部的第二表面。
在一些實施方案中，顆粒包括第一表面(例如，內表面)和第二表面(例如，外表面)；藥劑被固定在第一表面上；并且覆層覆蓋第一表面的至少一部分和第二表面的至少一部分。在這樣的實施方案中，覆層優選地不會影響藥劑特異性地結合至生物分子的能力。在某些優選實施方案中，覆層覆蓋基本上全部的第二表面。
在一些實施方案中，顆粒包括表面；藥劑被固定在表面上；并且覆層覆蓋表面的至少一部分。在這樣的實施方案中，覆層可以不影響藥劑特異性地結合至生物分子的能力。覆層可以允許藥劑中的一些特異性地結合至生物分子并抑制藥劑中的一些與生物分子之間的相互作用。覆層可以抑制藥劑與細胞表面上的分子之間的相互作用。在某些優選的實施方案中，覆層覆蓋基本上全部的表面。
覆層可以包括覆層分子，例如，覆層可以由多個覆層分子組成，或覆層可以由覆層分子群組成。如本文中使用的，術語“多個覆層分子”和“覆層分子群”每個都是指覆層。然而，術語“覆層”可以是指附加的組合物，如水凝膠。覆層分子可以是清除劑(并且因此清除劑可以是覆層分子)。
顆粒可以包括多個覆層分子。顆粒可以包括表面和被固定在所述表面上的多種藥劑，并且多個覆層分子中的至少一個分子可以被結合至表面。例如，多個覆層分子的全部或基本上全部的分子可以被結合至表面。
顆粒可以包括表面和第二表面，其中被固定在表面上的多種藥劑和多個覆層分子中的至少一個分子可以被結合至第二表面。例如，多個覆層分子的全部或基本上全部的分子可以被結合至第二表面。在一些實施方案中，多個覆層分子中的一些分子被結合至表面，并且多個覆層分子中的一些分子被結合至第二表面。
在一些實施方案中，覆層分子增加顆粒的體內清除率。例如，覆層分子可以包括病原體相關分子模式。
在一些實施方案中，本文中描述的顆粒具有包括排泄誘導化合物的覆層，所述排泄誘導化合物促進從循環中去除顆粒，例如，通過腎臟、肝臟/腸(例如，通過膽汁)，或吞噬作用(例如，通過抗原遞呈細胞)。多個覆層分子可以是多種排泄誘導化合物。例如，在其中顆粒是環形的實施方案中，內周表面(例如，第一表面)可以包括被固定的藥劑，并且外部表面(例如，第二表面)可以包括誘導顆粒清除的化合物，例如，通過腎臟、肝臟或巨噬細胞。在一些實施方案中，排泄誘導化合物被編程。也就是說，化合物可以被覆層覆蓋，所述覆層隨時間(例如，預定量的時間)降解(例如，通過酶的作用、水解或逐漸溶解)，最終暴露排泄誘導化合物或提高清除率的其它特征。在暴露于生物流體(例如，血漿或細胞外液)約1天至約5年(如約1天至約3年或約1天至約1年)后，覆層可以降解。因此，可以修飾和/或控制顆粒的體內滯留。
覆層可以包括有機聚合物，如聚乙二醇(peg)。有機聚合物可以附于顆粒，例如，附于顆粒的表面。有機聚合物可以包含peg、聚乳酸酯(polylactate)、聚乳酸、糖、脂質、聚谷氨酸、聚乙醇酸(pga)、聚乳酸(pla)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚醋酸乙烯酯(pva)及其組合。在某些實施方案中，顆粒與peg共價共軛，所述peg不利于血清蛋白的吸附，促進有效的尿排泄并減小顆粒的聚集(參見，例如，burnsetal.nanoletters,9(1):442-448(2009)以及美國專利申請公開號2013/0039848和2014/0248210，其中的每個以引用方式被并入本文)。
在一個實施方案中，覆層包括至少一個親水部分，例如，普朗尼克
覆層可以包含聚羥基聚合物，如天然聚合物或含羥基聚合物，所述含羥基聚合物包含多羥基聚合物、多糖、碳水化合物、多元醇、聚乙烯醇、聚氨基酸(如聚絲氨酸)或其它聚合物(如2-(羥乙基)甲基丙烯酸酯)或其組合。在一些實施方案中，聚羥基聚合物是多糖。多糖包含甘露聚糖、普魯蘭、麥芽糖糊精、淀粉、纖維素和纖維素衍生物、樹膠、黃原膠、刺槐豆膠或果膠、其組合(參見，例如，美國專利申請公開號2013/0337070，其以引入方式并入本文)。
在一些實施方案中，覆層包括兩性離子聚合物(參見，例如，美國專利申請公開號2014/0235803、2014/0147387、2013/0196450和2012/0141797；以及美國專利號8,574,549，其中的每個以引用方式被并入本文)。
其它合適的覆層包含聚α羥基酸(包含聚乳酸或聚丙交酯、聚乙醇酸或聚乙交酯)、聚-β羥基酸(如聚羥基丁酸酯或聚羥基戊酸酯)、環氧聚合物(包含聚氧化乙烯(peo))、聚乙烯醇、聚酯、聚原酸酯、聚酰胺酯、聚酯酰胺、聚磷酸酯和聚磷酸酯-聚氨酯。可降解的聚酯的實施例包含：聚(羥基鏈烷酸酯)，包含聚(乳酸)或(聚丙交酯，pla)、聚(乙醇酸)或聚乙交酯(pga)、聚(3-羥基丁酸酯)、聚(4-羥基丁酸酯)、聚(3-羥基戊酸酯)和聚(己內酯)或聚(戊內酯)。聚氧雜酯的實施例包含聚(亞烷基草酸酯)(如聚(草酸乙烯酯))和含酰氨基的聚氧雜酯。其它合適的覆層材料包括包含聚乙二醇的聚醚、醚-酯共聚物(共聚(醚-酯))和聚碳酸酯。可生物降解的聚碳酸酯的實施例包含聚原碳酸酯、聚亞氨基碳酸酯、聚烷基碳酸酯(如聚(三亞甲基碳酸酯))、聚(1,3-二氧環己烷-2-酮)、聚(對二氧環己酮)、聚(6,6-二甲基-1,4-二氧環己烷-2-酮)、聚(1,4-二氧環庚烷-2-酮)和聚(1,5-二氧環庚烷-2-酮)。合適的可生物降解的覆層還可以包含聚酸酐、聚亞胺(如聚(乙烯亞胺)(pei))、聚酰胺(包含聚-n-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺)、聚(氨基酸)(包含聚賴氨酸(如聚-l-賴氨酸)或聚谷氨酸(如聚-l-谷氨酸))、聚磷腈(如聚(苯氧基-共-羧基苯氧基磷腈)、聚有機磷腈、聚氰基丙烯酸酯和聚氰基丙烯酸烷基酯(包含聚氰基丙烯酸丁酯)、聚異氰酸酯和聚乙烯吡咯烷酮。
聚合的覆層分子的鏈長可以是約1至約100個單體單元，如約4至約25個單元。
顆粒可以用天然存在的聚合物(包含纖維蛋白、纖維蛋白原、彈性蛋白、酪蛋白、膠原、殼聚糖、胞外基質(ecm)、角叉菜膠、軟骨素、果膠、藻酸鹽、藻酸、白蛋白、糊精、葡聚糖、明膠、甘露醇、正鹵胺、多糖、聚-1,4-葡聚糖、淀粉、羥乙基淀粉(hes)、二醛淀粉、糖原、淀粉酶、羥乙基淀粉酶、支鏈淀粉、葡萄糖-聚糖、脂肪酸(及其酯)、透明質酸、魚精蛋白、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、d-甘露糖醛酸、l-古洛糖酸、玉米醇溶蛋白和其他醇溶谷蛋白、藻酸、瓜爾豆膠和磷酸膽堿、以及其共聚物及衍生物)蓋覆。覆層還可以包括改性多糖，如纖維素、殼多糖、葡聚糖、淀粉、羥乙基淀粉、聚葡萄糖酸酯、透明質酸和鹽酸高飛燕草堿(elatin)，以及其共聚物及衍生物。
顆粒可以用水凝膠蓋覆。水凝膠可以例如使用選自任何合適的聚合物(如聚(羥烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚酯、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(乙烯基吡咯烷酮)或聚乙烯醇)的基礎聚合物形成。交聯劑可以是過氧化物、硫、二氯化硫、金屬氧化物、硒、碲、二胺、二異氰酸酯、二硫化烷基苯、二硫化四乙基秋蘭姆、4,4’-二硫代嗎啡啉、對奎寧二肟和四氯對苯醌中的一種或更多種。此外，含硼酸的聚合物可以被并入水凝膠中，并具有可選的可光聚合性基團。
在某些優選的實施方案中，覆層包括被美國食品和藥物管理局(fda)批準使用的材料。這些fda批準的材料包含聚乙醇酸(pga)、聚乳酸(pla)、聚糖乳酸復合物910(每丙交酯單元包括比率為9:1的乙交酯，也稱為vicryltm)、聚葡糖酸酯(每三亞甲基碳酸酯單元包括9:1比率的乙交酯，也稱為maxontm)和聚二氧環己酮(pds)。
覆層與顆粒的附著可以通過共價鍵或非共價鍵實現，如通過離子鍵、氫鍵、疏水鍵、配位、粘合劑或物理吸收或相互作用。
常規納米顆粒蓋覆方法包含干法和濕法。干法包含：(a)物理氣相沉積(zhang,y.etal.solidstatecommun.115:51(2000))，(b)等離子體處理(shi,d.etal.appl.phys.lett.78:1243(2001)；vollath,d.etal.j.nanoparticleres.1:235(1999))，(c)化學氣相沉積(takeo,o.etal.j.mater.chem.8:1323(1998))以及(d)用于基質內原位沉淀納米顆粒的聚合或非聚合有機材料的熱解(sglavo,v.m.etal.j.matersci.28:6437(1993))。用于蓋覆顆粒的濕法包含：(a)溶膠-凝膠法以及(b)乳化和溶劑揮發法(cohen,h.etal.genether.7:1896(2000)；hrkach,j.s.etal.biomaterials18:27(1997)；wang,d.etal.j.control.rel.57:9(1999))。可以通過電鍍、噴涂、浸涂、濺射、化學氣相沉積或物理氣相沉積來蓋覆覆層。此外，用多糖蓋覆各種納米顆粒的方法是本領域已知的(參見例如美國專利號8,685,538和美國專利申請公開號2013/0323182，其中的每個以引用方式被并入本文)。
在一些實施方案中，顆粒可以適于通過腎排泄促進清除。具有正常腎功能的受試者的腎清除通常需要至少一個維度小于15nm的顆粒(參見，例如，choi,h.s.,etal.natbiotechnol25(1):1165(2007)；longmire,m.etal.,nanomedicine3(5):703(2008))。然而，較大的顆粒可以在尿液中被排泄。對于其中顆粒對于腎清除太大的實施方案，顆粒則可以在體內降解到更小尺寸后被清除。
在一些實施方案中，顆粒可以適于通過肝膽排泄促進清除。包含在肝臟中的枯否細胞的單核吞噬系統(mps)涉及肝攝取和隨后的納米顆粒的膽汁排泄。已知納米顆粒的某些尺寸和表面性質可增加肝臟中mps的攝取(參見choietal.,j.ofdispersionsci.tech.24(3/4):475-487(2003)；和brannon-peppasetal.,j.drugdeliverysci.tech.14(4):257-264(2004)，其中的每個以引用方式被并入本文)。例如，已知增加顆粒的疏水性可增加mps的攝取。因此，本領域普通技術人員可以選擇具有某些特征的顆粒以調節膽汁排泄。肝膽系統允許比可以通過腎臟系統排泄的顆粒稍微大的顆粒(例如，10至20nm)的排泄。對于其中顆粒對于肝膽排泄太大的實施方案，則顆粒可以在體內降解到更小尺寸后被清除。在這樣的實施方案中，通過肝膽排泄促進清除的覆層可以覆蓋顆粒內部表面的一部分，以致于覆層在顆粒降解后變得暴露。顆粒可以包括覆蓋表面的一部分的多個覆層分子，例如，疏水性分子。表面可以在顆粒降解后被暴露，以允許被降解的顆粒的清除。
在一些實施方案中，顆粒適于通過吞噬作用促進清除。例如，顆粒可以包括清除劑，其中清除劑包括病原體相關分子模式，例如，通過巨噬細胞用于識別。病原體相關分子模式(pamps)包含未甲基化的cpgdna(細菌)、雙鏈rna(病毒)、脂多糖(細菌)、肽聚糖(細菌)、脂阿拉伯甘露糖(細菌)、酵母聚糖(酵母)、支原體脂蛋白(如malp-2(細菌))、鞭毛蛋白(細菌)、聚(肌苷酸-胞苷酸)酸(細菌)、脂磷壁酸(細菌)和咪唑喹啉(合成)。在優選的實施方案中，pamp清除劑被遮蔽，以致于巨噬細胞在顆粒結合至一個或更多個靶標之前不會吞噬所述顆粒。例如，pamp清除劑可以被任何一種上述覆層(例如，聚合的覆層，如可生物降解的聚合的覆層)遮蔽。巨噬細胞可以吞噬與20μm一樣大的顆粒(參見，例如，cannon,g.j.andswanson,j.a.,j.cellscience101:907-913(1992)；champion,j.a.,etal.pharmres25(8):1815-1821(2008))。在一些實施方案中，通過吞噬作用促進清除的清除劑可以覆蓋顆粒的內部表面的一部分，以致于清除劑在顆粒降解后變得暴露。顆粒可以包括覆蓋表面的一部分的多種清除劑，例如，pamps。表面可以在顆粒降解后暴露，以允許被降解的顆粒的清除。清除劑可以覆蓋表面的一部分，所述表面與包括藥劑的表面重疊。清除劑(例如，pamps)可以引發針對顆粒的免疫應答，例如在第二覆層的降解之后或在顆粒降解之后。
在一些實施方案中，針對清除劑(例如，pamps)的免疫應答可以超過針對藥劑和/或藥劑/生物分子復合物的免疫應答，從而抑制或延緩針對藥劑和/或藥劑/生物分子復合物的免疫應答的開始。例如，顆粒的降解可以將清除劑和藥劑(和/或藥劑/生物分子復合物)兩者暴露于白細胞。pamp清除劑可以允許由巨噬細胞快速清除被降解的顆粒，從而延緩針對藥劑和/或藥劑/生物分子復合物的免疫應答(例如，b細胞介導的免疫應答)。
清除劑可以是誘導吞噬作用的鈣網蛋白。
在一些實施方案中，顆粒可以在約1天至約5年(如約1天至約3年，或約1天至約1年)內被生物體清除。
vii.給藥方法
本公開預期本文描述的組合物(例如，本文描述的任何大體或具體地描述的顆粒或多個顆粒)可以在體外和/或體內被施用于細胞和組織。體內給藥包含對疾病的動物模型的給藥，如癌癥的動物模型，或對有需要的受試者的給藥。合適的細胞、組織或受試者包含動物，如伴侶動物、家畜、動物園動物、瀕危物種，稀有動物、非人靈長類動物和人類。示例性伴侶動物包含狗和貓。
為了在體外遞送，如對培養物中的細胞或組織和/或在培養物中的細胞或組織的周圍，可以將組合物加入到培養基中，如接觸微環境或接觸培養基中的可溶材料或接觸細胞甚至滲透細胞。期望的活性部位影響用于施用組合物(例如，本文中描述的顆粒)的遞送機制和方式。
為了在體內遞送，如對體內細胞或組織(包含對細胞和組織的微環境)和/或對有需要的受試者，可以想到許多給藥方法。可以基于顆粒組合物和特定的應用和患者來選擇特定的方法。各種遞送系統是已知的并且可以用于施用本公開的藥劑。任何這樣的方法可以用于施用本文中描述的任何藥劑。引入方法可以是腸內或腸胃外，包含但不限于，皮內、肌內、腹膜內、心肌內、靜脈內、皮下、肺、鼻內、眼內、硬膜外和口服途徑。本公開的組合物可以通過任何方便的途徑施用，例如通過輸注或彈丸式注射(bolusinjection)、通過憑借上皮或皮膚粘膜襯里(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并且可以與其他生物活性藥劑一起(同時或連續地)被施用。給藥可以是系統的或局部的。
在某些實施方案中，組合物通過靜脈內被施用，如通過彈丸式注射或輸注。在某些實施方案中，組合物在口腔、皮下、肌內或腹膜內被施用。
在某些實施方案中，將本公開的組合物局部施用于需要治療的區域(例如，腫瘤部位，如通過注射到腫瘤中)可以是符合期望的。
肝臟是轉移的常見部位。因此，在某些實施方案中，本文中描述的組合物的遞送指向肝臟。例如，靜脈導管可以放置在肝門靜脈中以遞送本公開的藥劑至肝臟。經由肝門靜脈遞送的其它方法同樣被預期。
在某些實施方案中，本公開的組合物通過靜脈內輸注被施用。在某些實施方案中，組合物在至少10、至少15、至少20或至少30分鐘的時間段內輸注。在其他實施方案中，藥劑在至少60、90或120分鐘的時間段內輸注。在某些實施方案中，無論輸注時間段，本公開預期每次輸注是總體治療計劃的一部分，其中根據規律的時間表(例如，每周、每月等)施用藥劑一段時間。然而，在其它實施方案中，組合物通過彈丸式注射遞送，例如，作為整體治療計劃的一部分，其中根據規律的時間表施用藥劑一段時間。
對于前述任何一種，預期了本公開的組合物(包含一種藥劑或兩種或更多種這樣的藥劑的組合)可以通過任何合適的途徑或方法在體外或體內被施用。組合物可以作為治療方案的一部分被施用，其中組合物被一次或多次施用，包含根據特定的時間表施用。此外，預期了本公開的組合物將被配制適用于給藥途徑和特定的應用。本公開預期了前述特征的任何組合，以及與本文中描述的本公開的任何方面和實施方案的組合。
前述適用于單獨使用或組合使用的以及用于本文中描述的任何方法的本公開的任何組合物(例如，顆粒或多個顆粒)。本公開具體地預期了本公開的這樣的組合物的特征、組合物以及本部分和具有針對以下描述的各種藥物組合物和給藥途徑的特征的方法的任何組合。
viii.藥物組合物
在某些實施方案中，本公開的主題顆粒或多個顆粒與藥學上可接受的載體被配制。一種或更多種組合物(例如，包括本文中描述的顆粒或多個顆粒)可以單獨或作為藥物制劑(組合物)的組分被施用。如本文中描述的，本文大體或具體地描述的本公開的任何組合物可以被配制。在某些實施方案中，組合物包含兩種或更多種本公開的顆粒或與第二治療劑配制的本公開的顆粒。
本公開的組合物可以以任何方便的方式被配制用于人或獸用藥物的給藥。潤濕劑、乳化劑和潤滑劑(如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂)、以及著色劑、脫模劑、包衣劑、甜味劑、風味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可以存在于組合物中。
主題顆粒或多個顆粒的制劑包含例如適用于口服、鼻腔、局部、胃腸外、直腸和/或陰道內給藥的那些。制劑可以方便地以單位劑量形式存在，并且可以通過藥學領域熟知的任何方法制備。可以與載體材料組合以產生單一劑量形式的活性成分的量將根據待治療的宿主和給藥的具體方式而變化。可以與載體材料組合以產生單一劑量形式的活性成分的量將通常是產生治療效果的化合物的量。
在某些實施方案中，制備這些制劑或組合物的方法包含組合一種或更多種顆粒和載體以及可選的一種或更多種輔助成分。通常，制劑可以用液體載體或細分散的固體載體或兩者制備，然后如果需要的話，可以使產品成形。
用于口服給藥的制劑可以是膠囊、扁囊劑、藥丸、片劑、糖錠(使用風味基，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)、散劑、顆粒劑的形式，或作為水性液體或非水性液體中的溶液或懸混劑，或作為水包油或油包水液體乳劑，或作為酏劑或糖漿，或作為錠劑(使用惰性基，如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)和/或作為漱口水等，每一種均含有預定量的本公開的顆粒。除了活性化合物之外，懸混劑可以還包含懸浮劑如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酯、微晶纖維素、氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃芪膠及其混合物。
在用于口服給藥的固體劑型(膠囊、片劑、藥丸、糖衣丸、散劑、顆粒劑等)中，本公開的一種或更多種組合物可與一種或更多種藥學上可接受的載體混合，如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣、和/或以下任何一種：(1)填充劑或增充劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合劑，如，例如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)濕潤劑，如甘油；(4)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，如石蠟；(6)吸收促進劑，如季銨化合物；(7)潤濕劑，如，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，如白陶土和膨潤土粘土；(9)潤滑劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；和(10)著色劑。在膠囊、片劑和藥丸的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。類似類型的固體組合物也可以用作軟和硬填充的明膠膠囊中的填充劑，所述膠囊使用諸如乳糖或乳糖之類的賦形劑，以及高分子量聚乙二醇等。用于口服給藥的液體劑型包含藥學上可接受的乳劑、微乳液、溶液、懸混劑、糖漿和酏劑。除了活性成分之外，液體劑型可以包含本領域通常使用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇和山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀釋劑之外，口服組合物還可以包含佐劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、風味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。
在某些實施方案中，本公開的方法包含局部對皮膚或粘膜(如在子宮頸和陰道上的那些)給藥。局部制劑可以還包含一種或更多種已知作為皮膚或角質層滲透增強劑有效的各種各樣的助劑。這些的實施例是2-吡咯烷酮、n-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或異丙醇、二甲亞砜和氮酮。還可以包含附加的助劑以使制劑在美容上可接受。這些的實施例是脂肪、蠟、油、染料、香料、防腐劑、穩定劑和表面活性劑。也可以包含本領域已知的角質層分離劑。實施例是水楊酸和硫磺。用于局部或經皮給藥的劑型包含散劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、藥物貼片和吸入劑。本公開的主題藥劑可以在無菌條件下與藥學上可接受的載體混合，以及與可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。除了本公開的主題藥劑之外，軟膏、糊劑、乳膏和凝膠可以包含賦形劑，如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅，或其混合物。除了本公開的主題藥劑之外，散劑和噴霧劑可以包含賦形劑，如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或這些物質的混合物。噴霧劑可以另外包含常規推進劑，如氯氟烴和揮發性未取代的碳氫化合物，如丁烷和丙烷。
適合于非消化道給藥的藥物組合物可以包括一種或更多種本公開的組合物與一種或更多種藥學上可接受的無菌等張水性溶液或非水性溶液、分散液、懸混液或乳劑或無菌散劑的組合，所述無菌散劑可以僅在使用之前重新配制成無菌可注射溶液或分散液，所述無菌散劑可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、溶質，所述溶質與預期的受者的血液或懸混劑或增稠劑等張。可以用于本公開的藥物組合物中的合適的水性載體和非水性載體的實施例包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(如橄欖油)和可注射有機酯(如油酸乙酯)。例如通過使用覆層材料(如卵磷脂)、通過在分散液的情況下維持所需的顆粒尺寸，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當的流動性。
這些組合物可以還包含佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過包含各種抗菌和抗真菌劑(如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等)來確保預防微生物活動。將等張劑(如糖、氯化鈉等)包含在組合物中也可以是符合期望的。此外，可注射藥物形式的延長吸收可以通過包含延緩吸收的藥劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。
通過在可生物降解的聚合物(如聚交酯-聚乙交酯)中形成一種或更多種顆粒的微囊劑基質來制備可注射的藥性持久的形式。取決于藥物與聚合物的比率以及所使用的特定的聚合物的性質，可以控制釋藥速率。其它可生物降解的聚合物的實施例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。藥性持久的可注射的制劑也通過將藥物包埋在與身體組織兼容的脂質體或微乳劑中來制備。
在優選的實施方案中，本公開的組合物根據常規程序被配制為適于對人或動物(如伴侶動物)靜脈內給藥的藥物組合物。必要時，組合物也可以包含增溶劑和局部麻醉劑(如利多卡因)以緩解注射部位的疼痛。當通過輸注施用組合物時，可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶分發。當通過注射施用組合物時，可以提供安瓿的無菌注射用水或鹽水，以致于成分可以在給藥前被混合。
在另一個實施方案中，將本文中描述的組合物(例如，顆粒或多個顆粒)配制用于皮下、腹膜內或肌內對人或動物(如伴侶動物)給藥。
在某些實施方案中，本公開的藥劑和顆粒被配制用于局部遞送至腫瘤，如用于對瘤內注射的遞送。
在某些實施方案中，組合物旨在通過肝門靜脈局部對肝臟給藥，并且可以相應地配制藥劑和顆粒。
在某些實施方案中，特定的制劑適合于在經由多于一種途徑遞送的情況下使用。因此，例如，適于靜脈內輸注的制劑也可以適合于經由肝門靜脈遞送。然而，在其它實施方案中，制劑適合于在一種遞送途徑的情況下使用，但不適合于在第二遞送途徑的情況下使用。
本公開的將有效治療病況(如癌癥)，和/或將有效中和可溶tnfr，和/或將有效減小可溶tnfr的量或可溶tnfr的tnfα結合活性，特別是存在于腫瘤微環境中和可選地在血漿中的可溶tnfr，和/或將有效抑制體外或體內腫瘤細胞增殖、生長或存活的藥劑或顆粒的量可以通過標準臨床技術或實驗室技術來確定。此外，可以可選地使用體外測定來幫助確定最佳劑量范圍。制劑中使用的精確劑量還將取決于給藥途徑和病況的嚴重程度，并且應該根據醫師的判斷和每個受試者的情況來決定。用于對人或動物給藥的有效劑量可以從來自體外或動物模型測試系統的劑量效應曲線外推。
在某些實施方案中，本公開的組合物(包含藥物制劑)是非熱原的。換句話說，在某些實施方案中，組合物基本上是無熱原的。在一個實施方案中，本公開的制劑是無熱原的制劑，所述無熱原的制劑基本上不含內毒素和/或相關的熱原物質。內毒素包含被限制于微生物內并且只有當微生物破裂或死亡時才被釋放的毒素。熱原物質還包含來自細菌的外膜和其他微生物的發熱誘導的熱穩定物質(糖蛋白)。如果對人施用，這些物質都會引起發熱、低血壓和休克。由于潛在的有害影響，必須從通過靜脈內施用藥物溶液中去除即使是少量的內毒素。食品和藥物管理局(“fda”)對在靜脈內的藥物應用的一個小時內每千克體重的每份劑量設定了5個內毒素單位(eu)的上限(美國藥典委員會，藥典論壇26(1):223(2000))。當以相對大的劑量和/或跨延長的時間段(例如，如對于患者的整個壽命)施用治療蛋白質時，即使少量的有害和危險的內毒素可能也是危險的。在某些具體實施方案中，組合物中的內毒素和熱原水平小于10eu/mg，或小于5eu/mg，或小于1eu/mg，或小于0.1eu/mg，或小于0.01eu/mg，或小于0.001eu/mg。
前述內容適用于本公開的任何藥劑、本文中描述的組合物和方法。本公開具體地預期了本文中描述的本公開的藥劑、組合物和方法(單獨或組合)的特征與針對本部分及以上所述的各種藥物組合物和給藥途徑所描述的特征的任何組合。
本公開提供了適合用于本公開的方法(“本公開的藥劑”)的藥劑和藥劑的類別的很多概述和具體的實施例。本公開預期了任何這樣的藥劑或藥劑的類別可以如本文中描述的被配制用于體外或體內給藥。
此外，在某些實施方案中，本公開預期了組合物，包含藥物組合物，所述藥物組合物包括與一種或更多種藥學上可接受的載體和/或賦形劑配制的本文中描述的本公開的任何藥劑。可以使用本文中提供的本公開的藥劑的任何功能和/或結構特征來描述這樣的組合物。可以以本公開的任何方法在體內或體外使用任何這樣的組合物或藥物組合物。
類似地，本公開預期了本公開的分離的或純化的藥劑。基于本文中描述的藥劑的任何功能和/或結構特征描述的本公開的藥劑可以作為分離的藥劑或純化的藥劑被提供。這樣的分離的或純化的藥劑在體外或體內具有很多用途，包含用于本文中描述的任何體外或體內方法。
ix.應用
本文中描述的組合物(例如，顆粒和其藥物組合物)在各種各樣的診斷和治療應用中是有用的。例如，本文中描述的顆粒可以用于治療癌癥、使受試者解毒或治療病毒或細菌感染。
治療應用包含使用各種各樣的部分取決于于給藥途徑的方法將一種或更多種本文中描述的組合物施用于受試者(例如，人受試者)。途徑可以是，例如，靜脈內注射或輸注(iv)、皮下注射(sc)、腹腔內(ip)注射或肌肉注射(im)。
可以通過例如局部輸注、注射或借助于植入物實現給藥。植入物可以是多孔的、無孔的或凝膠狀的材料，包括膜，如硅橡膠膜或纖維。植入物可以被配置為用于持續的或定期的釋放組合物至受試者。參見例如美國專利申請公開號20080241223；美國專利號5,501,856、5,164,188、4,863,457和3,710,795；ep488401和ep430539，其中的每一個的公開內容以引用方式被整體并入本文。組合物可以通過基于例如擴散的、易受侵蝕的或對流的系統的可植入裝置(例如滲透泵、可生物降解的植入物、電擴散系統、電滲系統、蒸氣壓泵、電解泵、泡騰泵、壓電泵、基于腐蝕的系統或機電系統)遞送至受試者。
如本文中使用的，在體內環境中，術語“有效量”或“治療有效量”意味著足以治療、抑制或減輕待治療的病癥的一種或更多種癥狀或以另外的方式提供期望的藥物和/或生理作用(例如，調節(例如增強)對抗原的免疫應答)的劑量。精確的劑量將根據各種各樣的因素而變化，如取決于受試者的變量(例如，年齡、免疫系統健康等)、疾病和正在進行的治療。
如本文中使用的，哺乳動物可以是人、非人靈長類(例如，猴子、狒狒或黑猩猩)、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠或小鼠。在一些實施方案中，哺乳動物是嬰兒(例如，人類嬰兒)。
如本文中使用的，“需要預防”、“需要治療”或“有需要”的受試者哺乳動物是指由適當的醫師(例如，在人的情況下是醫生、護士或護師；在非人類哺乳動物的情況下是獸醫)的判斷，將合理地從給定的治療中獲益的那些。
術語“預防”是本領域公認的，并且當與病況相關使用時，在本領域中是很好理解的，并且包含組合物的給藥，相對于不接收組合物的受試者，所述組合物降低受試者哺乳動物中的身體狀況的癥狀的頻率或延緩癥狀的開始。
本文中描述的任何組合物的合適的人劑量還可以在例如i期劑量擴大研究中被評價。參見，例如，vangurpetal.(2008)amjtransplantation8(8):1711-1718；hanouskaetal.(2007)clincancerres13(2,part1):523-531；和hetheringtonetal.(2006)antimicrobialagentsandchemotherapy50(10):3499-3500。
這樣的組合物的毒性和治療功效可以通過細胞培養物或實驗動物(例如，癌癥、毒性或感染的動物模型)中的已知藥物程序來確定。這些程序可以用于例如測定ld50(對群體的50％致死的劑量)和ed50(在群體的50％中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數，所述治療指數可以表達為比率ld50/ed50。表現出高治療指數的藥劑是優選的。雖然表現出毒性副作用的組合物可以被使用，但應該注意，應設計將這樣的化合物靶向受影響組織的部位的遞送系統，并最小化對正常細胞的潛在損傷，從而降低副作用。
從細胞培養測定和動物研究獲得的數據可以被用于配制用于人的劑量范圍。這樣的組合物的劑量通常在組合物的循環濃度的范圍內，所述組合物的循環濃度包含具有很少或沒有毒性的ed50。劑量可以根據所用的劑型和使用的給藥途徑在這個范圍內變化。最初可以從細胞培養測定估計治療有效劑量。可以在動物模型中配制劑量以獲得循環血漿濃度范圍，所述循環血漿濃度范圍包含在細胞培養中測定的ic50(即實現癥狀的半最大抑制的抗體的濃度)。這樣的信息可以被用于更精確地確定人的有用劑量。血漿中的水平可以例如通過高性能液相色譜來測量。在一些實施方案中，例如，當需要局部給藥時，可以使用細胞培養或動物模型來確定在局部部位內獲得治療有效濃度所需的劑量。
在本文中描述的任何方法的一些實施方案中，顆粒可以與一種或更多種附加的治療劑(例如，用于治療感染或治療癌癥的治療劑)共同施用于哺乳動物。
在一些實施方案中，可以使用不同的給藥途徑向哺乳動物施用顆粒和附加的治療劑。例如，附加的治療劑可以皮下或肌內施用，并且顆粒可以通過靜脈內施用。
x.與腫瘤相關的選擇的應用
在一些實施方案中，本文中描述的顆粒可以用于治療患有癌癥的受試者。用于本文中描述的顆粒組合物的示例性藥劑和/或可以被這樣的顆粒清除的可溶生物分子在本文中描述(例如表2)并且是本領域已知的。例如，能夠清除stnfr、mmp2、mmp9、sil-2r、sil-1受體等的顆粒可用于通過緩解免疫去抑制來治療癌癥和/或增強對癌癥的免疫應答。
免疫治療的免疫去抑制途徑在某種程度上基于許多癌癥患者通常總體上具有免疫學能力，但他們的免疫系統在他們的腫瘤的微環境中被局部抑制的概念。如果通過施用本公開的顆粒減輕免疫系統的這種抑制，則患者自身的免疫系統可以作用于腫瘤。因此，在某些實施方案中，本公開的顆粒提供免疫治療途徑，而無需通過添加意圖結合細胞表面受體以引發免疫應答的外源性活性細胞因子來超刺激患者的免疫系統，和/或無需以其他方式超刺激患者的免疫系統。
不受理論束縛，因為癌癥患者通常具有免疫學能力，淋巴細胞識別腫瘤抗原的能力一般不受腫瘤的影響。因此，淋巴細胞被吸引到腫瘤微環境中，就像對任何異常的細胞群集一樣，在該點細胞因子和細胞毒性因子(如腫瘤壞死因子(tnf，如tnfα、免疫系統的主要細胞毒性“sword”))從淋巴細胞切割到微環境中。如果是病毒感染的細胞而非癌細胞，tnf(如tnfα)將占用(engage)被感染的細胞表面上的tnf受體(tnfr)，導致由細胞凋亡或氧化應激產生的快速破壞，這取決于用于tnf的r1或r2型受體是否被占用。換句話說，在不被腫瘤和/或腫瘤抗原的存在刺激的正常免疫應答的情況下，淋巴細胞部署的tnf將可被利用結合細胞表面tnf受體(r1和/或r2受體)作為增加免疫應答的一部分。即使在腫瘤的情況下，淋巴細胞被部署到腫瘤部位。
然而，許多類型的癌細胞與其他異常的細胞類型(如病毒感染的細胞)表現不同，因為它們過度產生tnf受體(兩種類型均是)并將它們排出到腫瘤周圍的云狀物(cloud)中。因此，癌細胞和/或腫瘤的微環境包含大量的可溶tnf受體。不受理論的束縛，腫瘤微環境中的可溶tnf受體水平超過了健康細胞(如相同組織類型的健康細胞)的微環境中發現的水平。額外地或可替換地，tnf受體排出的速率和程度對于癌細胞來說比從健康細胞更大。此外，不受理論的束縛，在某些實施方案中，癌癥患者的血漿中發現的可溶tnf受體的水平可以高于健康患者(healthypatients)。
不管何種機制，在這個模型中，這些排出的可溶tnf受體結合至由被募集的淋巴細胞內生地釋放的tnf，中和內生的tnf并且有效地創建腫瘤周圍免疫特權的泡狀區(bubble)，在所述泡狀區之內腫瘤繼續生長并且排出更多的tnf受體。換句話說，排出的可溶tnf受體吸收由淋巴細胞內生地產生的tnfα，并且阻止或抑制tnf結合癌細胞上的細胞表面tnf受體。這減小或消除可被利用于結合癌細胞上的細胞表面tnf受體的tnf。可溶tnf受體實質上超出結合至tnfα，因此減小了tnf的活性，如用于結合細胞表面tnf受體的tnfα。
上述情況可以類似地在il-2和排出的可溶il-2受體的情況下完成。
本公開提供了藥理學途徑，所述藥理學途徑可以被系統地或局部地部署以減輕由癌癥中的排出的受體產生的免疫系統的抑制(例如，免疫去抑制)。本公開提供了用于減小可溶tnf受體和/或可溶il-2受體(或導致免疫去抑制的任何其他可溶生物分子)(如在癌細胞和腫瘤的微環境中)的量和/或活性(例如，中和活性)的方法和組合物。不受理論的束縛，減少例如可溶tnf受體(例如，如在腫瘤微環境中)的量和/或活性可以被用作抑制細胞(如癌細胞)增殖、生長或存活的方法的一部分。在某些實施方案中，它可以用于抑制細胞(如癌細胞)的存活。本文中描述了示例性方法和藥劑。
調節性t細胞(tregs)可以分泌與癌細胞相同的配體，作為抑制免疫應答的方式，以避免例如由過度活性化t細胞或延長的t細胞功能引起的自身免疫疾病。例如，cd80/b7-1和cd86/b7-2結合至t細胞上的ctla-4受體并抑制t細胞活性。本文中描述的顆粒不阻滯ctla-4受體，而是可以被設計為清除cd80/b7-1和/或cd86/b7-2。同樣，本文中描述的顆粒可以被設計成清除其它免疫檢查點抑制劑(如pd-1l)，例如，使用包括pd-1受體的顆粒。與刺激免疫系統治療癌癥的其他途徑相比，這樣的顆粒組合物提供了幾個好處。
在一些實施方案中，受試者是患有、被懷疑患有或有發展癌癥的風險的受試者。在一些實施方案中，受試者是被懷疑患有或有發展自身免疫疾病的風險的受試者。
如本文中使用的，“有風險發展”癌癥的受試者是具有發展癌癥的一個或更多個(例如，二、三、四、五、六、七、八個或更多個)危險因素的受試者。例如，有發展癌癥風險的受試者可能具有發展癌癥的傾向(即，發展癌癥的遺傳易感性，如腫瘤抑制基因(例如，brca1、p53、rb或apc中的突變)或已經暴露于可以導致病況的條件下。因此，當受試者已經暴露于某些化合物(例如，香煙煙霧中的致癌化合物，如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽、苯并芘、釙210(氡)、尿烷或氯乙烯)的誘變或致癌水平時，受試者可以是“有發展癌癥的風險”的受試者。此外，當受試者已經暴露于例如大劑量的紫外光或x射線照射，或暴露(例如感染)于引起腫瘤的/腫瘤相關的病毒(如乳頭瘤病毒)、eb病毒、b型肝炎病毒或人t細胞白血病淋巴瘤病毒，受試者可以是“有發展癌癥的風險”。癌癥是一類疾病或病癥，其特征在于，不受控制的細胞分裂及其通過入侵直接生長進入相鄰組織中或通過遠處轉移(其中癌細胞通過血流或淋巴系統轉運)植入到遠隔的部位來擴散的能力。癌癥可以影響所有年齡段的人，但風險有隨著年齡增加的趨勢。癌癥的類型可以包含，例如肺癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神經組織癌(例如，惡性膠質瘤，如多形成性膠質細胞瘤)、黑素瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、宮頸癌、陰道癌或膀胱癌。
類似地，有發展感染風險的受試者是具有增加暴露于病原微生物的可能性的一個或更多個危險因素的受試者。
“被懷疑患有”癌癥或感染的受試者是具有癌癥或感染的一種或更多種癥狀的受試者。應當理解，有發展的危險或被懷疑患有癌癥或感染的受試者不包含感興趣物種內的所有受試者。
在一些實施方案中，所述方法包含確定受試者是否患有癌癥或自身免疫疾病。
xi.與炎癥和自身免疫病癥相關的選擇的應用
在一些實施方案中，本文中描述的顆粒可以用于治療炎性病癥和/或自身免疫病癥。可用于本文中描述的顆粒組合物的示例性藥劑和/或可以被這樣的顆粒清除的可溶生物分子在本文中描述(例如表2)并且是本領域已知的。例如，能夠清除細胞因子(例如，tnfα或白介素，如il-2、il-6或il-1)或趨化因子(例如，cxcl8或cxcl1)的顆粒可以用于治療各種各樣的自身免疫和/或炎性病癥。
在一些實施方案中，自身免疫或炎性病癥是超敏反應。如本文中使用的，“超敏反應”是指不期望的免疫系統應答。超敏反應分為四類。i型超敏反應包含過敏(例如，特應性反應、過敏性反應或哮喘)。ii型超敏反應是細胞毒性的/抗體介導的(例如，自身免疫溶血性貧血、血小板減少癥、胎兒成紅細胞增多病或肺出血腎炎綜合癥)。iii型是免疫復合物疾病(例如，血清病、阿蒂斯反應或sle)。iv型是延遲型超敏反應(dth)，細胞介導的免疫記憶應答和抗體無關(例如，接觸性皮炎、結核菌素皮試或慢性移植排斥)。如本文中使用的，“過敏”是指通過ige肥大細胞和嗜堿粒細胞的過度激活為特征的病癥。在某些情況下，通過ige的肥大細胞和嗜堿粒細胞過度激活導致(部分或全部)炎性應答。在某些情況下，炎癥應答是局部的。在某些情況下，炎癥應答導致氣道變窄(即支氣管縮小)。在某些情況下，炎癥應答導致鼻子中的炎癥(即鼻炎)。在某些情況下，炎癥應答是全身性的(即過敏反應)。
xii.與病原體和毒素相關的選擇的應用
在一些實施方案中，本文中描述的顆粒可以被設計成結合至微生物(例如，病毒或細菌)或微生物的組分(如內毒素)。因此，本文中描述的顆粒可以用于治療，例如傳染病(例如，病毒感染性疾病，包含hpv、hbv、丙型肝炎病毒(hcv)、逆轉錄酶病毒(如人體免疫缺損病毒(hiv-1和hiv-2))、皰疹病毒(如eb病毒(ebv))、巨細胞病毒(cmv)、hsv-1和hsv-2以及流感病毒。此外，包含細菌、真菌和其他致病性感染，如曲霉屬真菌、布魯格絲蟲屬、假絲酵母、衣原體、球蟲亞綱、隱球菌、惡絲蟲屬、淋球菌、組織胞漿菌屬、利什曼蟲、分枝桿菌、支原體、草履蟲屬、百日咳、瘧原蟲、肺炎球菌、肺囊蟲屬、立克次體、沙門氏菌、志賀氏桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、弓形蟲和霍亂弧菌。示例性物種包含淋病奈瑟氏菌、結核分枝桿菌、白念珠菌、熱帶假絲酵母、陰道毛滴蟲、陰道嗜血桿菌、b族鏈球菌、人支原體(microplasmahominis)、杜氏嗜血菌、腹股溝肉芽腫、腹股溝淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、流產布魯桿菌、羊布魯氏桿菌、豬布魯氏菌、犬布氏桿菌、胎兒彎曲菌屬、胎兒彎曲菌腸亞種單、鉤端螺旋體、單核細胞增多性李斯特氏菌、綿羊布魯氏桿菌、鸚鵡熱衣原體、胎毛滴蟲、弓形蟲、大腸桿菌、馬駒放線桿菌、羊流產沙門菌、馬流產沙門菌、銅綠假單胞菌、馬棒狀桿菌、化膿棒狀桿菌、精氨酸放線桿菌、牛生殖道支原體、煙曲霉菌、分棘狀棘子須霉菌、馬媾疫錐蟲、巴西貝蟲、破傷風芽孢梭菌、肉毒桿菌；或真菌，如，例如，巴西芽生菌；或其他病原體，例如，惡性瘧原蟲。還包含國家過敏和傳染病研究所(niaid)優先病原體。這些包含a類藥劑，如天花(天花)、炭疽桿菌(炭疽)、鼠疫耶爾森菌(鼠疫)、肉毒桿菌毒素(肉毒中毒)、土拉弗朗西斯菌(土拉菌病)、絲狀病毒屬(埃博拉出血熱、馬爾堡出血熱)、沙狀病毒屬(拉沙熱(拉沙熱))、junin(阿根廷出血熱)和相關病毒；b類藥劑，如伯納特氏立克次氏體(qfever)、布魯氏菌(普魯氏菌病)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽)、甲病毒(委內瑞拉腦脊髓炎、東部和西部馬腦脊髓炎)、來自蓖麻(蓖麻籽)的蓖麻毒素、蓖麻毒素產氣莢膜梭菌；葡萄球菌腸毒素b、沙門氏菌屬、痢疾志賀氏菌、大腸桿菌菌株o157:h7、霍亂弧菌、隱孢子蟲；c類藥劑，如尼帕病毒、漢坦病毒、蜱傳播出血熱病毒、蜱傳腦炎病毒、黃熱病和多重耐藥性結核病；蠕蟲，如血吸蟲和絳蟲；和原生動物，例如，利什曼原蟲(例如，墨西哥利什曼原蟲)和瘧原蟲。
xiii.施用藥劑的藥盒
在某些實施方案中，本公開還提供包括填充有本公開的至少一種組合物(例如，顆粒或多個顆粒)的一個或更多個容器的藥物包裝或藥盒。可選地與這樣的一個或多個容器相關聯的可以是由管理制造、使用或銷售藥物或生物制品的政府機構規定的形式的通知，所述通知反映(a)用于人給藥的制造、使用或銷售機構的批準，(b)使用說明，或兩者均具備。
在某些實施方案中，藥盒包含附加的材料以便利主題藥劑的遞送。例如，藥盒可以包含導管、管、輸液袋、注射器等中的一種或更多種。在某些實施方案中，組合物(例如，包括本文中描述的顆粒)以凍干形式包裝，并且藥盒包含至少兩個容器：包括凍干組合物的容器和包括適量的水、緩沖液或適合于重構凍干材料的其它液體的容器。
上述適用于本文中描述的任何組合物和方法。本公開具體地預期了這樣的組合物和方法(單獨或組合)的特征與用于描述本節中描述的各種藥盒的特征的任何組合。
在考慮以下實施例時，將進一步理解本公開的這些和其它方面，所述實施例旨在說明本公開的某些特定實施方案，但不旨在限制本公開的范圍，本公開的范圍由權利要求書限定。
范例
實施例1-用于治療癌癥的方法
人類患者由醫師鑒定為患有排出可溶tnfr或可溶il-2r的癌癥(例如，肺癌、結腸癌、乳腺癌、腦癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌或血液癌)。患者被施用包括以有效治療癌癥的量結合至并且隔離可溶tnfr或il-2r的顆粒(本文中描述的)的組合物。可選地，患者被給予組合物的“維持劑量”以維持對可溶tnfr或il-2r的作用的抑制，從而繼續增強患者中對癌癥的免疫監視。
實施例2-使人解毒的方法
存在具有與肉毒毒素相關的毒性癥狀的人類患者。患者被施用包括以有效改善與毒性相關的一種或更多種癥狀的量結合至并且隔離可溶肉毒毒素的顆粒(本文中描述)的組合物。
實施例3-用于治療病毒性感染的方法
人類患者被醫師鑒定為患有hiv-1感染。患者被施用包括以有效降低患者循環中病毒滴度的量結合至并且隔離可溶hiv-1病毒粒子的顆粒(本文中描述)的組合物。患者被給予組合物的“維持劑量”以維持hiv-1病毒粒子滴度的降低，從而抑制患者的感染，以及降低病毒傳播至另一個的可能性。
實施例4-制造硅顆粒的方法
多孔硅盤被制造具有1000nm×400nm以及1000nm×800nm的尺寸和可變的孔尺寸。盤的尺寸和形貌以及孔直徑通過掃描電子顯微鏡進行表征。金納米顆粒(au)沉積在多孔硅盤的孔中。腫瘤壞死因子(tnfs)通過配位共價鍵與金納米顆粒的表面接合。評估配體密度和tnf-au結合穩定性。
實施例5-制造聚合物顆粒的方法
通過乳狀液制備聚(交酯-共-乙交酯)(plga)顆粒。plga顆粒的尺寸和形貌通過掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡來表征。顆粒用季銨β-環糊精蓋覆，用于巨噬細胞募集(即吞噬)。通過原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡驗證覆層。覆層密度和均勻性通過透射電子顯微鏡和動態光散射進行表征。
將β-環糊精蓋覆的plga顆粒與巨噬細胞一起溫育，并且通過熒光顯微鏡和流式細胞儀監測吞噬作用。
β-環糊精蓋覆的plga顆粒用聚乙二醇(peg)和硫醇部分的共混物蓋覆，以允許阻止巨噬細胞吸收的調理素作用和逃避，以及結合至其他顆粒。peg和硫醇覆層的均勻性和密度通過原子力顯微鏡進行表征。覆層穩定性通過將顆粒在介質中溫育不同的時間段進行表征。如上文中描述的，通過將顆粒與巨噬細胞一起溫育，在不同的時間點監測顆粒的逃避和吸收。
用腫瘤壞死因子(tnf)蓋覆plga顆粒，并且顆粒通過二硫鍵組合以形成“海綿”，所述“海綿”包括在海綿的內表面上的tnf。海綿的外表面可選地被不包括tnf的顆粒封閉，以阻止海綿的tnf與細胞之間的相互作用。
實施例6-基于聚合物的顆粒的藥代動力學
實施例5的海綿(即，包括實施例5的“海綿”(如103至1012海綿)的組合物)通過靜脈內或瘤內施用至原發性和轉移性癌癥的小鼠模型以及健康對照。通過確定每個給藥途徑的ld50來確定海綿的毒性。通過lc/ms和icp針對每種給藥途徑監測海綿血漿濃度來確定海綿的半衰期。通過采取小鼠的活組織檢查和通過lc/ms、icp和共聚焦顯微鏡分析海綿組織及其組分來確定海綿的生物分布。
實施例7-基于聚合物的顆粒的功效
實施例5的海綿(即，包括實施例5的“海綿”(如103至1012海綿)的組合物)施用至包括mda-mb-231或4t1異種移植的小鼠。mda-mb-231模型被用于評估腫瘤尺寸和生長的降低，4t1模型被用于評估轉移的抑制。海綿被每周一次持續6周瘤內施用至mda-mb-231小鼠，并且定期監測體重和腫瘤尺寸。海綿被每周一次持續6周靜脈內施用至4t1小鼠，并且監測轉移的數量。
實施例8-基于硅/金的顆粒的藥代動力學和功效
用實施例5的多孔硅顆粒重復實施例6和7的實驗。
雖然本公開已經參考其具體實施方案被描述，但本領域技術人員應當理解，在不脫離本公開的真實精神和范圍的情況下，可以進行各種改變并且可以取代以等同物。此外，可以進行許多修改使特定情況、材料、物質的組成、過程、工藝步驟或多個步驟適合于本公開的目標、精神和范圍。所有這樣的修改被意圖在本公開的范圍之內。
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