角蛋白納米材料及其制備方法與流程
相關申請的交叉引用
本申請要求2014年05月01日提交的美國臨時專利申請號61/987,182,和2014年05月02日提交的美國臨時專利申請號61/987,855的優先權和權益，以上各文的全部內容通過引用納入本文。
發明領域
本發明總體涉及角蛋白納米材料領域,包含角蛋白納米材料的生物材料,和制備角蛋白納米材料的方法。具體來說，本發明涉及角蛋白納米材料的制備和應用,其是包含緊密結合的角蛋白單體的二聚體和四聚體的大分子角蛋白復合物。
發明背景
中間纖維(if)包含歸屬于6大類之一的屬于α-螺旋蛋白質超家族的亞單位組件。通常,if蛋白質具有共有二級結構特征，其可概括描述為包含中央α-螺旋結構域(domain)和頭部和尾部球狀結構域的單體形式。if蛋白質中的中央α-螺旋結構域是高度保守的，且變化大部分來自頭部和尾部結構域中一級結構的差異。為了形成中間纖維，這些單體物質聚合形成具有高度有序超結構的細長大分子復合物。兩種主要if蛋白質包含酸性和堿性角蛋白(分別是i型和ii型if蛋白質分類)。i型和ii型角蛋白單體通常在上皮細胞中表達，且i型和ii型角蛋白單體自身都不能裝配成角蛋白纖維。i型和ii型角蛋白單體通常以1:1比例結合來形成異二聚體，其進一步結合以組裝成雜聚角蛋白纖維。
角蛋白if蛋白質可進一步描述為來自“軟”上皮亞家族或來自“硬”毛囊細胞(trichocytic)亞家族。約有20種角蛋白(也稱作細胞角蛋白)來自“軟”亞家族，且由在上皮細胞中組成細胞骨架元件的胞內蛋白質組成。已知約17種角蛋白屬于“硬”毛囊細胞亞家族,且這些角蛋白組成結構附加物，如蹄、指甲、毛皮、羽毛和頭發纖維。
研究表明蛋白質自組裝過程對大分子復合物即二聚體和四聚體中的變化是非常敏感的。此外，僅僅存在損壞的蛋白質片段即可干擾自組裝過程和/或打亂已經形成的超結構-對角蛋白蛋白質亦是如此。角蛋白單體形成特別強的大分子復合物，特別是在二聚體和四聚體水平，其不容易變性或分解成其單體單元。但是，使這些復合物變性的問題是，用于分解角蛋白超結構(主要是二硫鍵)的化學方法以及后續的蛋白質溶劑化技術可導致對角蛋白單體形成顯著損壞。這種損壞通常不被覺察，且對角蛋白生物材料的形成、性質和性能是有害的。重組的角蛋白還沒有對角蛋白生物材料領域提供任何有希望的替代，因為目前重組蛋白制備較困難和昂貴。到目前為止，整個角蛋白生物材料技術基于從例如頭發纖維、羊毛、羽毛等的組織提取角蛋白。
之前描述的角蛋白生物材料由角蛋白單體制成，通常在40-60千道爾頓(kda)的范圍，且沒有披露使用純化的角蛋白納米材料。rousejg,vandykeme.《用于醫療應用的角蛋白基生物材料綜述(areviewofkeratin-basedbiomaterialsforbiomedicalapplications)》.《材料(materials)》2010；3:999-1014；vandykeme.《具有受控的機械、化學和生物性質的水凝膠及其制備方法(hydrogelwithcontrollablemechanical,chemical,andbiologicalpropertiesandmethodformakingsame)》.美國專利號:7,001,987.2006年2月21日；vandykeme,sauljm,smithtl,deguzmanr.《受控的遞送系統(controlleddeliverysystem)》.美國專利申請公開號:2011/0217356.2011年03月7日提交。如本文所述，純化的角蛋白納米材料包括基本上不含結構損壞和缺陷以及與角蛋白納米材料結合(即，連接到，粘結到等)的損壞蛋白質和肽的角蛋白。
此外，描述將角蛋白用于制造先前所述的角蛋白生物材料的方法得到不是純角蛋白納米材料的分子復合物。甚至如上所述的“純化角蛋白”包含具有緊密結合的損壞的蛋白質和蛋白質碎片(即肽)的角蛋白復合物，其對自組裝過程是有害的，和/或在生物材料超結構形成之后使該生物材料超結構不穩定。vandykeme.《含角蛋白生物材料的愈傷組合物(woundhealingcompositionscontainingkeratinbiomaterials)》.美國專利號:8,273,702.2012年9月25日。
已使用本領域普通技術人員熟知的方法通過氧化或還原從人類頭發纖維提取角蛋白(參見，例如crewther,w.g.等,《角蛋白化學(thechemistryofkeratins)》.anfinsen,c.b.,jr.等，編者.《蛋白質化學進展(advancesinproteinchemistry)》1965,學院出版社(academicpress).紐約：191-346)?！兜鞍踪|化學進展》中的這個章節包括參考了關于角蛋白的多過640篇出版的研究，并描述了提取角蛋白的方法。所述方法通常使用兩步法，其中通過氧化或還原分解角蛋白的交聯結構。如果使用氧化處理，所得角蛋白稱作角質物質(keratose)，如果使用還原處理，所得角蛋白稱作還原角蛋白。在這些反應中，裂解胱氨酸氨基酸殘基中的二硫鍵，使角蛋白變成可溶解的。因為許多角蛋白仍然保留在角質層的保護性結構之內，通常使用利用變性溶液的第二步驟來實施皮質蛋白質的有效提取。或者，在還原反應的情況下，可組合這些步驟，或者可使用溶液，例如脲、硫脲、磷酸鹽、磷酸氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸鹽、碳酸氫鹽、過渡金屬氫氧化物、表面活性劑溶液，和/或其組合(例如濃度為0.1-1.0m的三(羥甲基)氨基甲烷的水性溶液，和0.1-10m的脲溶液)。
文獻還進一步表征，通過例如等電沉淀、超濾、層析及其組合的各種方法，角質物質和還原角蛋白的粗提取物可進一步精煉成α-角質物質,γ-角質物質,酸性α-角質物質,堿性α-角質物質,酸性γ-角質物質,堿性γ-角質物質,α-還原角蛋白,γ-還原角蛋白,酸性α-還原角蛋白,堿性α-還原角蛋白,酸性γ-還原角蛋白,堿性γ-還原角蛋白,和角蛋白結合的蛋白質(kap)級分。在粗提取物中，α級分在低于ph6時開始沉淀，且到ph4.2時基本上完成沉淀。kap級分通常與α級分共沉淀，由此形成α/kap混合物。γ級分仍然在溶液中，但可通過添加非溶劑來沉淀。非溶劑是水互溶的，但不溶解角蛋白(例如乙醇)?？赏ㄟ^冷卻乙醇且逐滴添加角蛋白溶液而不是將乙醇添加到角蛋白，來輔助γ級分的沉淀。這些分級步驟已在文獻中描述且是本技術領域所公知的；但是，這些方法不能形成本文所述的角蛋白納米材料。
此外，許多蛋白質純化技術是本技術領域所公知的，且包括分級沉淀到免疫親和性層析(對于這個主題的更廣泛的理解，參見scopesr.k.(編者).《蛋白純化：原理和實踐(proteinpurification:principlesandpractice)》(第三版，施普林格(springer),紐約.1993)；roes.,《蛋白質純化技術：一種可行方法(proteinpurificationtechniques:apracticalapproach)》.(第二版.牛津大學出版社(oxforduniversitypress),紐約.2001)；或者hatti-kaulr.和mattiassonb.,《蛋白質的分離和純化(isolationandpurificationofproteins)》.(馬賽爾德克公司(marceldekkerag),紐約.2003),通過引用結合于此。例如，crewther等描述了酸性和堿性角蛋白的亞家族可通過移動結合電泳來分離，但沒有廣泛描述這些級分或它們的性質(參見crewther(1965))。已將分離技術應用到角蛋白級分，從而可將它們分離成具有有用性質的子級分，且可重組成具有不同于起始混合物性質的“間-角蛋白(metakeratin)”(參見richterj.r.等,《衍生自人類頭發的變化角蛋白生物材料的結構-性質關系(structure-propertyrelationshipsofmeta-kerateinebiomaterialsderivedfromhumanhair)》.actabiomater.2012；8(1):274-81；vandyke,marke等,《用于治療局部缺血的角蛋白生物材料(keratinbiomaterialsfortreatmentofischemia)》.美國專利號:8,545,893.2013年10月1日；以及nunezf等,《衍生自角蛋白的化合物的血管活性性質(vasoactivepropertiesofkeratin-derivedcompounds)》.《微觀循環(microcirculation)》.2011；18(8):663-9)。在文獻中報道了所得純化角蛋白的凝膠化、結合治療化合物、機械性質和化學性質以及其它特征；然而,提供的提取和純化技術不足以提供無損壞和/或污染物的角蛋白和提供本文所述的角蛋白納米材料。
本領域需要能自組裝成生物材料例如水凝膠、膜、泡沫、涂層和纖維的角蛋白納米材料，以及從含角蛋白的源制備角蛋白納米材料的方法。
角蛋白納米材料是以緊密結合的i型單體和ii型單體的二聚體,和/或由緊密結合的兩個二聚體形成的四聚體形式存在的大分子復合物。本質上，這些大分子復合物是不穩定的，且快速聚合來形成更高的有序結構。現有技術描述的方法不能制備穩定的、純化角蛋白納米材料。在本技術領域所公知的強變性溶液例如濃縮的脲溶液存在下，角蛋白納米材料仍然保持緊密結合。角蛋白納米材料具有不同于天然發現的角蛋白的組織包含頭發纖維、羊毛、羽毛等來源以及如上所述的提取的和純化角蛋白的化學、物理和生物性質。例如，天然發現的角蛋白的組織具有惰性外層，在頭發和毛皮纖維的情況下稱作角質層。角蛋白納米材料不是惰性的，因此可與其它化學化合物、溶劑、細胞和細胞受體等相互作用。此外，從角蛋白納米材料制備的生物材料具有不同于現有技術中描述的常規角蛋白生物材料的化學、物理和生物性質。例如，因為其高度的自組裝，由角蛋白納米材料制備的生物材料形成的網絡結構比常規角蛋白生物材料形成的網絡結構更強。這種性質表現在例如角蛋白納米材料在較低角蛋白濃度下形成水凝膠的能力。此外，因為更高的有序分子結構、分子復合物的穩定性以及不存在可用作降解催化劑的損壞的肽，由角蛋白納米材料形成的生物材料比常規角蛋白生物材料降解更緩慢。最后，因為不含損壞的肽和因為i型和ii型單體的分子復合物的完整的天然結構，由角蛋白納米材料制成的生物材料的免疫原性較低。
技術實現要素：
本發明的主題是角蛋白納米材料,用于制備所述角蛋白納米材料的方法,和由所述角蛋白納米材料制備的生物材料。從例如羊毛、羽毛、頭發纖維等組織提取的角蛋白是本技術領域所公知的；然而,這些方法得到不同角蛋白化合物的絡合混合物。甚至當使用復雜的分離和純化步驟時，現有技術描述的方法最多能制備強力絡合到損壞的角蛋白分子的角蛋白和角蛋白分子的剩余物如肽碎片。現有技術描述的方法沒有改變這些緊密的相互作用，因此制備了不同于主題角蛋白納米材料的化學結構。
這樣,不像角蛋白納米材料，常規角蛋白生物材料不具有相同的自組裝能力，也得不到相同的網絡結構，或具有相似的性質包括網絡結構穩定性。最近我們發現只有控制地操控角蛋白提取物的溶解行為，才能獲得角蛋白納米材料。
本文所述的方法有效地分解這些緊密相互作用，并制備不同化學實體；即角蛋白納米材料。與常規角蛋白生物材料相比，由角蛋白納米材料制備的生物材料例如凝膠、膜、泡沫、海綿、支架、纖維、油灰(putties)、涂層、和顆粒具有優異的性質。
本發明的目的之一是提供一種或多種角蛋白納米材料，所述一種或多種角蛋白納米材料是包含緊密結合的角蛋白單體的二聚體和/或四聚體的大分子角蛋白復合物。
本發明的其它目的是提供用于制備一種或多種角蛋白納米材料的方法。
本發明的又一目的是提供組合物，所述組合物包括本文所述的角蛋白納米材料中的一種或多種。
本發明的又一目的是提供一種或多種生物材料，所述一種或多種生物材料包括本文所述的角蛋白納米材料中的一種或多種。
附圖簡要說明
圖1的示意圖顯示用本文所述的方法獲得的角蛋白納米材料。
圖2a的圖形示意圖表明在緩沖超濾之前存在角蛋白納米材料和角蛋白肽。
圖2b的圖形示意圖表明在緩沖超濾之后存在角蛋白納米材料。
圖3a的圖形示意圖表明在緩沖超濾之前存在角蛋白納米材料和角蛋白肽。
圖3b的圖形示意圖表明在緩沖超濾之后存在角蛋白納米材料。
圖4a的圖形示意圖表明在緩沖超濾之前存在角蛋白納米材料和角蛋白肽。
圖4b的圖形示意圖表明在緩沖超濾之后存在角蛋白納米材料。
圖5a的圖形示意圖表明在緩沖超濾之前存在角蛋白納米材料和角蛋白肽。
圖5b的圖形示意圖表明在緩沖超濾之后存在角蛋白納米材料。
具體描述
定義：
如本文所用，單數形式的“一個”，“一種”和“該”也包括復數形式，除非上下文另有明確說明。
如本文所使用，術語“約”或“大約”可互換使用，且當與所述的數值或范圍聯用時表示比所述的數值或范圍稍微多于或少于至所述數值或范圍的±10％范圍之內。
如本文所使用，術語“生物相容的”指組合物或制品不對生物系統產生或者產生可容忍的或可接受水平的毒性或傷害影響。
如本文所使用，術語“生物材料(s)”指生物相容的組合物或制品。生物材料可包含不同物理形式的組合物或制品，例如涂層、纖維、膜、泡沫、凝膠、移植物、水凝膠、薄膜、網、支架、片材、海綿或網等。這些制品可包含天然產物、合成產物或其組合。在具體方面中，可將生物材料用于醫療治療或診斷應用中。
如本文所使用，術語“載體”指可遞送角蛋白納米材料的任何合適的物質。
如本文所使用，術語“主要由……組成”如果所要求保護的組合物的特征沒有受到實質影響時，可存在未描述的組分。
如本文所使用，術語“角蛋白”指纖維狀結構蛋白質或中間纖維家族。每一i型角蛋白都與特定的ii型角蛋白伴侶共表達。角蛋白蛋白質在從i型單體和ii型單體的二聚作用開始的一系列組裝步驟中形成細絲狀聚合物。二聚體組裝成四聚體和八聚體，并最終組裝成單位長度的細絲，其能進行端部-到-端部退火成長細絲。
如本文所使用，術語“角蛋白納米材料”指i型單體和ii型單體的分子復合物,例如i型單體和ii型單體的二聚體,二聚體具有20-75nm的長度、1-5nm的寬度和100-200kda的分子量,和/或兩個這種二聚體的四聚體,四聚體具有50-100nm的長度、5-10nm的寬度和200-600kda的分子量。
如本文所使用，術語“純化的”指角蛋白納米材料不含不想要的或低劣的組分。術語“純化的”還包括不含來自獲得角蛋白納米材料的源材料的組分的角蛋白納米材料。角蛋白納米材料可為“基本上純的”，即不含來自其中制備角蛋白納米材料的源材料的其它組分，例如羊毛、羽毛、頭發纖維等。在優選的實施方式中,角蛋白納米材料是至少75％(w/w)純的,更優選地至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％純的。在另一優選的實施方式中,角蛋白納米材料是100％純的。
如本文所使用，術語“分離物”和“分離的”指從其天然狀態取出并將其與天然地與之結合的其它分子分離的材料。
如本文所使用，術語“源材料”指起始材料,例如來自動物或人類來源的角蛋白蛋白質的蛋白來源。
角蛋白納米材料
如全文所述，角蛋白納米材料可為任意角蛋白納米材料。在一些實施方式中,角蛋白納米材料可衍生自天然源材料、合成源材料或其組合。在特定方面中,角蛋白納米材料可使用氧化化學、還原化學、重組或其組合來制備。
在具體實施方式中,源材料是蛋白質的角蛋白材料。適用于獲得角蛋白納米材料的蛋白質的角蛋白材料的非限制性例子包含來自動物來源的頭發、羊毛、毛皮、皮膚、角、蹄、嘴、羽毛和鱗片(scale)等。在特定方面中,源材料是人類頭發。在另一方面中，所述來源是從根部切割的人類頭發纖維。又在另一方面中,人類頭發是金色人發或用已知方法漂白的有色頭發。還又在另一方面中,人類頭發不含黑色素,或基本上不含黑色素。在另一特定方面中,源材料是羽毛。又在另一方面中,羽毛是白色羽毛。又在另一方面中,羽毛不含黑色素或基本上不含黑色素。又在另一特定方面中,源材料是羊毛。又在另一方面中,羊毛是白色羊毛。又在另一方面中,羊毛不含黑色素或基本上不含黑色素。源材料可為一種或多種蛋白質的角蛋白材料的組合,例如如上所述的材料中的一種或多種。
在本文提供的一些實施方式中,角蛋白納米材料包含一種或多種i型單體和ii型單體對(例如,至少1種i型單體和ii型單體對,至少2種i型單體和ii型單體對,至少3種i型單體和ii型單體對,至少4種i型單體和ii型單體對等)。
在特定方面中,角蛋白納米材料包含一種或多種i型單體和ii型單體的二聚體,一種或多種2個二聚體的四聚體,或其組合。在特定方面中,角蛋白納米材料包含一種或多種i型單體和ii型單體的二聚體。在更具體的方面中，角蛋白納米材料主要由下述組成：一種或多種i型單體和ii型單體的二聚體。在甚至更具體的方面中,角蛋白納米材料由下述組成：一種或多種i型單體和ii型單體的二聚體。在另一方面中，角蛋白材料包含一種或多種2個i型單體和ii型單體的二聚體的四聚體。在更具體的方面中,角蛋白納米材料主要由下述組成：一種或多種2個i型單體和ii型單體的二聚體的四聚體。在甚至更具體的方面中,角蛋白納米材料由下述組成：一種或多種2個i型單體和ii型單體的二聚體的四聚體。
如圖1所示且如本文所述,角蛋白納米材料自身沒有損壞，且消除或基本上消除不想要的組分，例如結合的(即，連接的、粘結的等)損壞的角蛋白單體或肽和其它污染物。除去結合的損壞的角蛋白單體和肽不能通過本技術領域所公知的方法來實現，且必須使用本文所述的方法來進行。一旦除去這些污染物，就制備穩定的角蛋白納米材料，其能顯著的自組裝成具有所需性質的生物材料，包括這樣形成的生物材料的更大穩定性。在本文提供的一些實施方式中,角蛋白納米材料的純度是約60％-約100％純(例如,約60％純,65％純,70％純,75％純,80％純,85％純,90％純,91％純,92％純,93％純,94％純,95％純,96％純,97％純,98％純,99％純,最高達約100％純)。
此外，如本文提供的角蛋白納米材料包含具有不同長度和直徑的二聚體和四聚體。在一方面中,二聚體的長度是約5nm-約75nm(例如,約5nm長,7.5nm長,10nm長,12.5nm長,15nm長,17.5nm長,20nm長,22.5nm長,25nm長,27.5nm長,30nm長,32.5nm長,35nm長,37.5nm長,40nm長,42.5nm長,45nm長,47.5nm長,50nm長,52.5nm長,55nm長,57.5nm長,60nm長,62.5nm長,65nm長,67.5nm長,70nm長,72.5nm長,最高達約75nm長)，且直徑是約0.5nm-約10nm(例如,約0.5nm的直徑,1nm的直徑,1.5nm的直徑,2nm的直徑,2.5nm的直徑,3nm的直徑,3.5nm的直徑,4nm的直徑,5nm的直徑,5.5nm的直徑,6nm的直徑,6.5nm的直徑,7nm的直徑,7.5nm的直徑,8nm的直徑,8.5nm的直徑,9nm的直徑,9.5nm的直徑,最高達約10nm的直徑)。在特定方面中,二聚體是約50nm長，且具有約2nm的直徑。
在一方面中,四聚體的長度是約25nm-約200nm(例如,約25nm長,30nm長,35nm長,40nm長,45nm長,50nm長,55nm長,60nm長,65nm長,70nm長,75nm長,80nm長,85nm長,90nm長,95nm長,100nm長,105nm長,110nm長,115nm長,120nm長,125nm長,130nm長,135nm長,140nm長,145nm長,150nm長,155nm長,160nm長,165nm長,170nm長,175nm長,180nm長,185nm長,190nm長,195nm長,最高達約200nm長)，且直徑是約1nm-約20nm(例如,約1nm的直徑,1.5nm的直徑,2nm的直徑,2.5nm的直徑,3nm的直徑,3.5nm的直徑,4nm的直徑,4.5nm的直徑,5nm的直徑,5.5nm的直徑,6nm的直徑,6.5nm的直徑,7nm的直徑,7.5nm的直徑,8nm的直徑,8.5nm的直徑,9nm的直徑,9.5nm的直徑,10nm的直徑,11nm的直徑,11.5nm的直徑,12nm的直徑,12.5nm的直徑,13nm的直徑,13.5nm的直徑,14nm的直徑,14.5nm的直徑15nm的直徑,15.5nm的直徑,16nm的直徑,16.5nm的直徑,17nm的直徑,17.5nm的直徑,18nm的直徑,18.5nm的直徑,19nm的直徑,19.5nm的直徑,最高達約20nm的直徑)。在另一方面中,四聚體以不同的參差構象結合，且可為約50-100nm長，直徑可為約5-10nm。
制備角蛋白納米材料的方法
如全文所提供，所述的角蛋白納米材料可根據本文所述的方法來獲得。根據需要，本文所述的方法步驟可重復許多次，只要制備了角蛋白納米材料(例如,1次,2次,3次,4次,5次,6次,7次,8次,9次,10次,11次,12次,13次,14次,15次,16次,17次,18次,19次,20次等)。
作為主要步驟,本文所述的方法包含獲得可溶性角蛋白的溶液。在特定方面中,溶液是可溶性毛囊細胞角蛋白(trichocytickeratin)、細胞角蛋白及其組合的溶液。在另一特定方面中,溶液是可溶性細胞角蛋白的溶液。又在另一特定方面中，溶液是可溶性毛囊細胞角蛋白的溶液。
可溶性毛囊細胞角蛋白的溶液可使用本技術領域所公知的方法來獲得。這種方法包括例如如crewther等(參見crewther,1965)所述的二硫鍵的裂解。具體來說，二硫鍵可使用氧化性或還原性二硫鍵裂解來進行裂解。
角蛋白納米材料可從任何源材料來獲得。在一些實施方式中,角蛋白納米材料可衍生自天然源材料、合成源材料或其組合。在具體實施方式中,源材料是蛋白質的角蛋白材料。適用于獲得角蛋白納米材料的蛋白質的角蛋白材料的非限制性例子包含來自動物來源的頭發、羊毛、毛皮、皮膚、角、蹄、嘴、羽毛和鱗片等。在特定方面中,源材料是人類頭發。在另一方面中，所述源是從根部切下的人類頭發纖維。又在另一方面中,人類頭發是金發或已用已知方法漂白的有色頭發。還又在另一方面中,人類頭發不含黑色素,或基本上不含黑色素。在另一特定方面中,源材料是羽毛。又在另一方面中,羽毛是白色羽毛。又在另一方面中,羽毛不含黑色素或基本上不含黑色素。又在另一特定方面中,源材料是羊毛。又在另一方面中,羊毛是白色羊毛。又在另一方面中,羊毛不含黑色素或基本上不含黑色素。在一些實施方式中,角蛋白納米材料還可通過常規化學合成技術來獲得，或者通過使用重組技術制備角蛋白納米材料來獲得。
在有效裂解二硫鍵之后,或在鍵裂解同時,可從組織網絡提取角蛋白，并放入合適的溶液。優選的溶液是本技術領域所公知的，且包括例如尿素、硫脲、磷酸鹽、磷酸氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸鹽、碳酸氫鹽、過渡金屬氫氧化物(如氫氧化鈉和氫氧化鉀)、氫氧化銨和三(羥甲基)氨基甲烷(
在另一方面中,溶液是
在一些實施方式中,提取的角蛋白的粗溶液可進行額外的澄清以除去小顆粒材料(例如角質層(cuticle)片)，這可通過本技術領域所公知的方法來實現。非限制性例子包括過濾、重力沉降、傾潷、離心、旋流分離等。在特定方面中，其它凈化可使用離心來進行。在一方面中,離心速度是約2,500rpm(轉/分鐘)-約10,000rpm(例如,約2,500rpm,2,750rpm,3,000rpm,3,500rpm,3,570rpm,4,000rpm,4,250rpm,4,500rpm,4,750rpm,5,000rpm,5,250rpm,5,500rpm,5,750rpm,6,000rpm,6,250rpm,6,500rpm,6,750rpm,7,000rpm,7,250rpm,7,500rpm,7,750rpm,8,000rpm,8,250rpm,8,500rpm,8,750rpm,9,000rpm,9,250rpm,9,500rpm,9,750rpm,最高達約10,000rpm)。在更具體的方面中,離心速度是高速離心(例如>5,000rpm)。
在一些實施方式中,凈化步驟之后還包括過濾過程。過濾的非限制性例子包含重力過濾、真空過濾、膜過濾等。在特定方面中,過濾方法是膜過濾。在更具體的方面中,用于膜過濾的膜的孔徑是約1μm-約50μm(例如,1μm,5μm,10μm,15μm,20μm,25μm,30μm,35μm,40μm,45μm,最高達約50μm)。又在更特定的方面中,過濾方法包含通過具有小于50μm孔徑的膜的過濾。
在其它實施方式中,在凈化之后,粗角蛋白提取溶液可任選地經歷純化過程來形成角蛋白的亞級分(sub-fraction)。在一些實施方式中,亞級分進一步除去總污染物，并形成更適于用于獲得角蛋白納米材料的角蛋白溶液。亞級分方法是本技術領域所公知的，并包括例如等電沉淀、超濾和各種形式的層析(如柱層析、紙層析、薄層層析、置換層析、氣相色譜法、液相色譜法等)。在特定方面中,亞級分使用等電沉淀來進行。在更具體的方面中,等電沉淀方法是酸化。具體來說，在一些實施方式中,將水性酸添加到角蛋白溶液，從而ph到達小于6(例如,ph1,ph1.5,ph2,ph2.5,ph3,ph3.5,ph4,ph4.5,ph5,ph5.5,最高達ph6)，且獲得酸性不可溶解級分的沉淀。在更具體的方面中，酸度范圍是約ph4-約ph6。適用于酸化的酸的非限制性例子包括鹽酸、硫酸和乙酸。在特定方面中,所述酸是鹽酸。然后，可用本技術領域所公知的方法來分離酸不可溶解和酸可溶解的亞級分。用于分離酸可溶解亞級分的非限制性例子方法包括過濾、重力沉降、傾潷、離心、旋流分離等。在特定方面中,可使用離心來進行進一步凈化。在一方面中,離心速度是約2,500rpm-約10,000rpm(例如,約2,500rpm,2,750rpm,3,000rpm,3,500rpm,3,570rpm,4,000rpm,4,250rpm,4,500rpm,4,750rpm,5,000rpm,5,250rpm,5,500rpm,5,750rpm,6,000rpm,6,250rpm,6,500rpm,6,750rpm,7,000rpm,7,250rpm,7,500rpm,7,750rpm,8,000rpm,8,250rpm,8,500rpm,8,750rpm,9,000rpm,9,250rpm,9,500rpm,9,750rpm,最高達約10,000rpm)。在更具體的方面中,離心速度是高速離心(例如>5,000rpm)。
例如,在一些實施方式中,可任選地對角蛋白亞級分溶液進行進一步純化，例如層析。可使用多種層析來純化角蛋白溶液，包含尺寸排阻或凝膠過濾層析,親和性層析,等電聚焦，凝膠電泳，離子交換層析,和免疫親和性層析。層析技術是本技術領域所熟知的，且能通過分子量、化學官能團、等電點、電荷或者與特殊抗體的相互作用的特征，來分離化合物(包括蛋白質)，且可單獨地使用或以任意組合地使用，從而影響高的分離程度和所得純度。在特定方面中,純化使用離子交換(iex)層析來進行。因為蛋白質總體上的兩性性質且特別是角蛋白，iex層析特別適用于蛋白質分離。取決于溶液的起始ph和所需的計劃用于保留的級分，可使用陽離子或陰離子iex(分別是ciex或aiex)技術。例如,在大于或等于ph7時，酸可溶解和不可溶解級分都是可溶解的，且取決于它們的等電點，將顯示不同的樹脂結合特征。雖然無意受限于任何具體理論，但可將角蛋白亞級分溶液滴定到目標ph，并通過ciex或aiex樹脂。本領域普通技術人員將理解，取決于在目標ph下的凈電荷，角蛋白亞級分中包含的分子將與樹脂結合或不與樹脂結合。結果，通過下述可實現其它亞級分之間的分離：單獨地收集通過樹脂、然后通過用于除去粘結到樹脂的化合物的溶液(例如氯化鈉或其它緩沖溶液)的溶液。例如，包含角蛋白納米材料的級分可使用本技術領域所公知的技術如凝膠電泳、凝膠過濾層析,或尺寸排阻層析層析來確定。
在其它實施方式中,超濾單獨地或與上述方法組合地用于粗角蛋白溶液的總分級。超濾可用于分離粗角蛋白溶液或具有不同分子尺寸特征的角蛋白亞級分溶液。雖然無意受限于角蛋白性能的任何具體理論，但認為如上所述的酸不可溶解亞級分具有比酸可溶解亞級分相對更高的分子量。本領域普通技術人員認識到可如何施加例如超濾的方法，以基于蛋白質分子尺寸來影響蛋白質之間的分離，并選擇合適的超濾條件。
在特定實施方式中,超濾膜具有下述的標稱低分子量截斷(cutoff)(nlmwco)：約10kda-約300kda(例如,約10kda,20kda,30kda,40kda,50kda,60kda,70kda,80kda,90kda,100kda,110kda,120kda,130kda,140kda,150kda,160kda,170kda,180kda,190kda,200kda,210kda,220kda,230kda,240kda,250kda,260kda,270kda,280kda,290kda最高達約300kda)。在特定方面中,用于分離更高分子量可溶解角蛋白級分的方法是使用具有約30kda的nlmwco的膜超濾。又在另一特定方面中,用于分離更高分子量可溶解角蛋白級分的方法是使用具有約100kda的nlmwco的膜超濾。
本領域普通技術人員將理解，滲透進入超濾膜的角蛋白也可進行收集，從而還可分離低于某些標稱分子量的分子?？梢来问褂枚鄠€超濾步驟，使用不同nlmwco膜，以分離多個分子量的角蛋白級分。這些步驟可在如上所述的其它分離技術之前或之后使用，可以許多不同的組合使用，從而影響許多分離和純化策略。
在初始純化之后,進一步從角蛋白溶液純化和制備(即，分離)角蛋白納米材料。通過用緩沖劑處理角蛋白溶液來制備角蛋白納米材料。適用于處理角蛋白溶液的緩沖劑的非限制性例子包括一價和/或二磷酸鹽(如磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等),硼酸鹽(如硼酸鈉,硼酸鉀等)，檸檬酸鹽(如檸檬酸鈉,檸檬酸二鈉等),醋酸鹽(如醋酸鈉、醋酸鉀等)，碳酸鹽(如碳酸鈉、碳酸氫鈉等)等。在特定方面中,緩沖劑是一價磷酸鹽緩沖劑、二價磷酸鹽緩沖劑或其組合。又在更具體的方面中,緩沖劑是磷酸鈉緩沖劑、磷酸鉀緩沖劑或其組合。
用于處理角蛋白溶液的緩沖劑濃度可為約1mm-約200mm(例如,1mm,5mm,10mm15mm,20mm,25mm30mm,35mm,40mm,45mm,50mm,55mm,60mm,65mm,70mm,75mm,80mm,85mm,90mm,100mm,105mm,110mm115mm,120mm,125mm130mm,135mm,140mm,145mm,150mm,155mm,160mm,165mm,170mm,175mm,180mm,185mm,190mm,最高達約200mm)。在特定實施方式中,緩沖劑濃度是約1mm-100mm。又在更特定實施方式中,緩沖劑濃度是約5mm-約50mm。緩沖溶液的ph也影響純化。在一些方面中，本文提供的緩沖溶液的ph是約ph7-約ph12(例如,約ph7,ph7.5,ph8,ph8.5,ph9,ph9.5,ph10,ph10.5,ph11,ph115,最高達約ph12)。在更具體的方面中,ph是約ph7-約ph10。
本文所用的緩沖溶液還可包含其它溶質，例如氯化物鹽。氯化物鹽的非限制性例子包括例如氯化鈉或氯化鉀。在特定實施方式中,氯化鈉與磷酸鈉緩沖劑一起使用，氯化鉀與磷酸鉀緩沖劑是氯化鉀一起使用，或使用它們的組合。在特定方面中,氯化物鹽的濃度是約1mm-約1m(例如,約1mm,50mm,100mm,150mm,200mm,250mm,300mm,350mm,400mm,450mm,500mm,550mm,600mm,650mm,700mm,750mm,800mm,850mm,900mm,950mm,最高達約1m)。在更具體的方面中,氯化物鹽的濃度是約50mm-約200mm。
雖然無意受限于任何具體理論，但使用本文所述的濃度范圍的磷酸鹽緩沖劑用于使結合的(即，粘結到)損壞的蛋白質和肽與核角蛋白納米材料之間的粘結失穩，同時提高角蛋白納米材料自身的穩定性。在一些實施方式中,將緩沖劑鹽添加到角蛋白溶液，并允許在角蛋白納米材料發生分子重排時靜置。在一種實施方式中,允許角蛋白溶液靜置約30秒-約30天的時間段。又在其它實施方式中，通過添加補償(make-up)緩沖液，在超濾過程中添加鹽。在特定實施方式中,緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑，且磷酸鹽緩沖劑的濃度是1mm-100mm。在特定方面中,磷酸鹽緩沖劑的濃度是5mm-50mm。在其它方面中,用于磷酸鹽緩沖溶液的ph范圍是ph7到ph12。在更具體的方面中,用于磷酸鹽緩沖溶液的ph范圍是ph7到ph10。又在更具體的方面中,用于磷酸鹽緩沖溶液的ph是ph7.4到ph10。在甚至更具體的實施方式中，磷酸鹽緩沖溶液包含一種或多種氯化物鹽。在特定方面中,與磷酸鈉緩沖劑一起使用的氯化物鹽是氯化鈉,與磷酸鉀緩沖劑一起使用的氯化物鹽是氯化鉀。在特定方面中,氯化物鹽的濃度是10mm-1m,例如50mm-200mm。
在這些分子發生重排之后(或在它們發生重排時),可再次進行超濾，來除去現已解離的損壞的角蛋白和肽分子。在特定實施方式中,使用具有下述nlmwco的膜來進行切向流動超濾：約10kda-約300kda(例如,約10kda,20kda,30kda,40kda,50kda,60kda,70kda,80kda,90kda,100kda,110kda,120kda,130kda,140kda,150kda,160kda,170kda,180kda,190kda,200kda,210kda,220kda,230kda,240kda,250kda,260kda,270kda,280kda,290kda最高達約300kda)。在特定方面中,使用nlmwco為約30kda的膜來進行切向流動超濾。又在另一特定方面中，使用nlmwco為約100kda的膜來進行切向流動超濾。本領域普通技術人員認識到分子尺寸為約50nm-約100nm的角蛋白納米材料可利用具有不同nlmwco數值的超濾膜來進一步分離。
如有需要，在分離之后,可通過如上所述的使用超濾、酸沉淀或其它方法除去緩沖劑鹽，來進一步純化角蛋白納米材料。在具體實施方式中,用于除去緩沖劑鹽的方法是超濾，具體來說，是相對于純水的超濾。在一些實施方式中,可優選地以不同組合重復緩沖劑超濾和純水超濾循環，從而應更有利的角蛋白納米材料純化。此外,可有益地使用特殊緩沖劑來結束超濾，從而樣品是滲透地平衡的。
在純化完成之后,可用于本技術領域所公知的方法來分離角蛋白納米材料。這些方法包含濃縮溶液，然后固化。可使用冷凍干燥、臨界點干燥、降膜蒸發、噴涂干燥等從溶液獲得固體角蛋白納米材料。在特定方面中,使用例如臨界點干燥和冷凍干燥的方法來分離角蛋白納米材料,在更具體的方面中，使用冷凍干燥來分離角蛋白納米材料。本領域普通技術人員認識到冷凍干燥的多個參數例如冷凍溫度,冷凍速率，干燥溫度和干燥速率將影響所得固體角蛋白納米材料。
冷凍干燥的一種優選的方法是使用受控的冷凍速率和干燥速率。在特定方面中,冷凍速率范圍是約0.01℃到10℃/分鐘(例如,約0.01℃,0.05℃,0.10℃,0.15℃,0.20℃,0.25℃,0.30℃,0.35℃,0.40℃,0.45℃,0.50℃,0.55℃,0.60℃,0.65℃,0.70℃,0.75℃,0.80℃,0.85℃,0.90℃,0.91℃,0.92℃,0.93℃,0.94℃,0.95℃,0.96℃,0.97℃,0.98℃,0.99℃,1.0℃,1.5℃,2℃,2.5℃,3℃,3.5℃,4℃,4.5℃,5℃,5.5℃,6℃,6.5℃,7℃,7.5℃,8℃,8.5℃,9℃,9.5℃,最高達10℃/分鐘)。在特定方面中,冷凍速率幾乎是瞬時的，例如可通過在液氮、異丙醇/干冰等中淬冷角蛋白納米材料溶液。在更具體的方面中,冷凍速率范圍是約0.1℃-約1℃/分鐘(例如,約0.10℃,0.15℃,0.20℃,0.25℃,0.30℃,0.35℃,0.40℃,0.45℃,0.50℃,0.55℃,0.60℃,0.65℃,0.70℃,0.75℃,0.80℃,0.85℃,0.90℃,0.91℃,0.92℃,0.93℃,0.94℃,0.95℃,0.96℃,0.97℃,0.98℃,0.99℃,最高達約1.0℃/分鐘)。
在具體實施方式中,優選的干燥速率是當樣品在高真空下且在水的冰點以下獲得的干燥速率。在特定實施方式中，真空是約1毫托(millitorr)-約100毫托(例如,約1毫托,5毫托,10毫托,15毫托,20毫托,25毫托,30毫托,35毫托,40毫托,45毫托,50毫托,55毫托,60毫托,65毫托,70毫托,75毫托,80毫托,85毫托,90毫托,95毫托,最高達約100毫托)。在更具體實施方式中，真空是低于100毫托。在甚至更具體的方面中,真空是低于80毫托。
對于冷凍干燥,樣品溫度或樣品所暴露的溫度可為約-200℃到約0℃(例如,約-20℃,-19℃,-18℃,-17℃,-16℃,-15℃,-14℃,-13℃,-12℃,-11℃,-12℃,-10℃,-9℃,-8℃,-7℃,-6℃,-5℃,-4℃,-3℃,-2℃,-1℃,最高達約0℃)。在特定方面中,樣品溫度或樣品所暴露的溫度低于0℃。在更具體的方面中,樣品溫度或樣品所暴露的溫度低于-4℃。本領域普通技術人員將認識到在冷凍干燥過程中可通過下述來從樣品除去殘留的水：使用樣品溫度和真空的不同組合來影響升華過程，且最快速有效的那些升華過程是其中優化了升華速率的那些。優選的升華速率是其中樣品沒有融解從而只通過升華且不通過蒸發來除去水的那些升華速率。
組合物
本發明的組合物包含本文所述的至少一種角蛋白納米材料。在其它實施方式中,組合物可任選地包含載體。組合物可用于進一步制備角蛋白生物材料。
在一些實施方式中,本文所述的組合物可為下述形式：凝膠、泡沫、固體(例如粉末、細粒、顆粒等)、漿料或液體。在特定方面中,組合物是凝膠形式。在另一特定方面中,組合物是泡沫形式。又在另一特定方面中，組合物是固體(例如粉末、細粒、顆粒等)形式。又在另一特定方面中,組合物是漿料形式。又在另一特定方面中,組合物是液體形式。
載體：
包含載體的組合物將具有用于流變學測量(例如，粘度、屈服值，儲存模量和損耗模量)的正確的數值(和數值范圍)。本文所述的載體的非限制性例子包括液體、凝膠、泡沫、漿料或固體(包括可潤濕粉末或干燥粉末)。
載體材料的選擇將取決于預期應用。在具體實施方式中，所述載體是液體。在一方面中,液體可為水性或非水性液體載體。可用作本文所述的方法組合物的載體的液體的非限制性例子包含水、水性溶液(例如,糖水)、非水性液體或非水性溶液。在特定方面中,載體是水。在另一方面中載體是水性溶液。又在另一方面中,載體是非水性液體。
在特定方面中,載體是非水性液體(例如,油等)。非水性液體可為可生物降解的非水性液體。非水性液體可為“低蒸氣壓揮發性有機化合物(lvp-voc)”，其是包括下述的化學“化合物”或“化合物的混合物”：(1)20℃下小于0.1mmhg的蒸氣壓,(2)包括具有大于12個碳原子的化學化合物，和/或(3)大于216℃的沸點。參見加州空氣資源委員會(carb)提供的lvp-voc的定義。非水性液體可為可生物降解的lvp-voc非水性液體。
適于用作本文所述的組合物的載體的非水性液體的非限制性例子包括：硅酮油、石蠟/石蠟油、礦物油、己二醇、甘油、亞油酸、油酸及其任意組合。
在另一種實施方式中,載體是漿料。適用于漿料的液體的非限制性例子可包含水、水性溶液、非水性液體或非水性溶液。在一方面中,漿料可包含粘著劑(stickingagent)、液體或其組合。粘著劑的非限制性例子包含藻酸鹽、礦物油、糖漿、阿拉伯樹膠、蜂蜜、甲基纖維素、牛奶、墻紙糊料及其組合。
在另一種實施方式中,載體是固體。在一方面中,固體是粉末。在一方面中，粉末是可潤濕粉末。在另一方面中,粉末是干燥粉末。又在另一方面中,固體是細粒?？捎米鞅疚乃龅慕M合物的載體的固體的非限制性例子包括泥煤、小麥、小麥殼、研磨的小麥秸稈、糠(bran)、蛭石、纖維素、淀粉、土壤(巴氏殺菌或未經巴氏殺菌的)、石膏、滑石、粘土(如高嶺土、膨潤土、蒙脫土)和硅膠。
角蛋白生物材料
可進一步加工或合成、分離、純化或以本領域所公知的方法的其它技術來制備角蛋白納米材料?？蓪⒔堑鞍准{米材料添加到液體溶液、固體(例如,粉末,可潤濕的粉末等)、漿料、半固體、糊料、乳化物(emulsification)等。
在特定實施方式中,可通過將干燥的角蛋白納米材料研磨(例如粉碎、碾磨等)成粉末，來進一步加工角蛋白納米材料。碾磨設備是本技術領域所公知的。在優選的實施方式中，使用利用錐和絲網技術的藥物磨機來研磨角蛋白納米材料。更具體來說，是具有錐和絲網磨機，能減少靜電電荷的藥物磨機。
可從角蛋白納米材料、包含角蛋白納米材料的組合物或其組合，來制備角蛋白生物材料。在特定實施方式中,使用加工的角蛋白納米材料(例如,粉末化角蛋白納米材料)，根據本技術領域所公知的方法，可形成包含角蛋白納米材料的一種或多種生物材料。包含角蛋白納米材料的生物材料的非限制性例子包含膜、泡沫、纖維、涂層、凝膠、水凝膠、支架、海綿、顆粒等。在更具體實施方式中，本文提供的包含角蛋白納米材料的生物材料還包括油灰、膠粘劑、敷料(例如醫學敷料或醫學敷料的組分)、繃帶或繃帶組分、藥物遞送裝置、細胞遞送裝置等。
又在更具體實施方式中，本文提供的包含角蛋白納米材料的生物材料還包括在醫療裝置上的涂層、包括含有治療細胞(如干細胞)的細胞的水凝膠顆粒、包含治療劑如藥物或生物分子如生長因子的固體顆粒、用作組織工程支架的海綿和/或泡沫、如復蘇液和/或用于器官保護液體的液體、如傷口敷料的敷料、如真皮填充物的軟組織膨脹劑以及在化妝品和個人護理產品中的添加劑。
實施例
提供下面的實施例僅僅是為了闡述的目的，而不是為了限制如本文所要求保護的本發明的范圍。本領域普通技術人員可進行的示例性實施例中的任何變化都預期落入本發明的范圍之內。
實施例1:制備氧化角蛋白納米材料
從商業供應商獲得中國人頭發的樣品，并未經處理直接使用。將100g的頭發纖維放置進入2升2重量/體積百分比過乙酸中，并在37℃下在150rpm下振搖8小時。通過篩子回收氧化的頭發，并通過在37℃下在150rpm下振搖15小時使用4升100mm的tris堿來提取氧化的頭發。通過篩子回收頭發，保留提取物溶液，且通過在37℃下在150rpm下振搖2小時使用4升的純水來進一步提取頭發纖維。用篩子回收頭發并丟棄，保留提取物溶液。組合兩種提取物溶液來形成粗角蛋白提取物的溶液，其通過下述來凈化顆粒物質：通過在40000rpm下運行的固體分離器的離心，隨后通過具有20-25微米平均孔徑的膜的過濾。通過使用100kdanlmwco聚砜，螺旋纏繞過濾器濾筒的超濾，從這個粗溶液獲得角蛋白納米材料。所用的緩沖劑由在ph7.5下的5mm磷酸氫二鈉和150mm氯化鈉組成，且超濾進行5體積洗滌。超濾的第二階段使用純水的5體積洗滌來進行。濃縮純化的角蛋白納米材料溶液，滴定到ph7.4，冷凍，并進行冷凍干燥來制備角蛋白納米材料粉末。使用純水在10，8和5重量百分數下，重建粉末。所有3個樣品形成粘性、自支持的水凝膠，其在自身重力下不流動。
在緩沖劑超濾之前和之后，通過尺寸排阻層析(sec)分析角蛋白納米材料樣品來測定其分子量分布。在包含ultimate3000四元分析泵、具有20微升螺旋環(loop)的rheodyne手動注射器和ultimate3000uv/vis檢測器的dionexsec色譜系統上分析樣品。以1毫升/分鐘的速度流動的流動相是ph7.5的15mm磷酸氫二鈉/150mm氯化鈉。在280nm下檢測，且使用運行chromeleonv6.8色譜軟件的筆記本電腦來進行數據收集。將樣品制備為0.2毫克/毫升在流動相緩沖劑中的溶液。
結果表明在緩沖劑超濾之前(圖2a)，主要是角蛋白多肽和其它低分子量化合物。在緩沖劑超濾之后，清楚地存在大量角蛋白納米材料(圖2b)。
實施例2:制備氧化角蛋白納米材料
從商業供應商獲得中國人頭發的樣品，并未經處理直接使用。將200g的頭發纖維放置進入4升2重量/體積百分比過乙酸中，并在37℃下在125rpm下振搖8小時。通過篩子回收氧化的頭發，并通過在37℃下在125rpm下振搖14小時使用8升100mm的tris堿來提取氧化的頭發。通過篩子回收頭發，保留提取物溶液，且通過在37℃下在125rpm下振搖2小時使用8升的純水來進一步提取頭發纖維。用篩子回收頭發并丟棄，保留提取物溶液。組合兩種提取物溶液來形成粗角蛋白提取物的溶液，其通過下述來凈化顆粒物質：通過在43,000rpm下運行的固體分離器的離心，隨后通過具有20-25微米平均孔徑的膜的過濾。通過使用100kdanlmwco聚砜，螺旋纏繞過濾器濾筒的超濾，從這個粗溶液獲得角蛋白納米材料。所用的緩沖劑由在約ph9.1下的10mm磷酸氫二鈉和100mm氯化鈉組成，且超濾進行12體積洗滌。超濾的第二階段使用純水的4體積洗滌來進行。濃縮純化的角蛋白納米材料溶液，滴定到ph7.4，冷凍，并進行冷凍干燥來制備角蛋白納米材料粉末。在緩沖劑超濾之前和之后，通過尺寸排阻層析(sec)分析角蛋白納米材料樣品來測定其分子量分布。
在包含ultimate3000四元分析泵、具有20微升螺旋環(loop)的rheodyne手動注射器和ultimate3000uv/vis檢測器的dionexsec上分析樣品。流動相以1毫升/分鐘的速度流動，且是在ph7.5下的10mm磷酸氫二鈉/100mm氯化鈉。在280nm下檢測，且使用運行chromeleonv6.8色譜軟件的筆記本電腦來進行數據收集。將角蛋白納米材料和常規角質物質的樣品制備成0.2毫克/毫升在流動相緩沖劑中的溶液，并分析分子量。
結果表明使用常規的水超濾時(圖3a)，主要是角蛋白多肽和其它低分子量化合物。使用緩沖劑超濾時，清楚地存在大量角蛋白納米材料(圖3b)。
實施例3:制備還原角蛋白納米材料
從商業供應商獲得中國人頭發的樣品，并未經處理直接使用。通過如下所述的多步還原工藝來實現角蛋白的提?。簩?00克的頭發放入ph調節到為10.5的2升的0.5m巰基乙酸(tga)溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖15小時。用篩子回收頭發，并保留提取溶液。然后，將頭發纖維放入4升100mmtris的溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。保留所得提取溶液，將頭發放入4升的純水中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。用篩子回收頭發，將頭發放入新鮮制備的ph調節到為10.5的1升的0.5mtga溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖15小時。用篩子回收頭發，并保留提取溶液。然后，將頭發放入2升100mmtris的溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。保留所得提取溶液，然后將頭發放入2升的純水中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。用篩子回收頭發并丟棄。保留提取溶液，并與在之前步驟中獲得的提取溶液合并，以形成粗角蛋白提取物的溶液。所述提取物通過下述來凈化顆粒物質：通過在30000rpm下運行的固體分離器的離心，隨后通過具有20-25微米平均孔徑的膜的過濾。通過使用100kdanlmwco聚砜，螺旋纏繞過濾器濾筒的超濾，從該凈化的粗角蛋白提取物獲得角蛋白納米材料。使用相對于緩沖劑的10體積洗滌、隨后相對于純水的3體積洗滌來進行超濾，所述緩沖劑由在ph9.1下的5mm磷酸氫二鈉和150mm氯化鈉組成。濃縮純化的角蛋白納米材料溶液，滴定到ph8.5，冷凍，并進行冷凍干燥來制備角蛋白納米材料粉末。
使用sec分析在超濾之前和之后收集的樣品，以測定角蛋白納米材料的相對分子量分布。在具有20微升螺旋環的dionex手動注射器和設定在280nm下的ultimate3000uv/vis檢測器上分析樣品。使用chromeleonv6.8色譜軟件來進行數據收集。
所得色譜圖表明在超濾之前(圖4a)在角蛋白提取物中主要存在角蛋白多肽和其它低分子量化合物，而在超濾之后(圖4b)收集的樣品清楚地顯示存在角蛋白納米材料。
實施例4:角蛋白樣品的尺寸排阻層析
從商業供應商獲得中國人頭發的樣品，并未經處理直接使用。通過如下所述的多步還原工藝來實現角蛋白的提?。簩?0克的頭發放入ph調節到為10.5的1升的0.5mtga溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖15小時。在保溫之后，用篩子回收頭發，并保留提取溶液。然后，將頭發纖維放入2升100mmtris的溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。保留所得提取溶液，將頭發放入2升的純水溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。用篩子回收頭發，將頭發放入新鮮制備的ph調節到為10.5的0.5升的0.5mtga溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖15小時。用篩子回收頭發，并保留提取溶液。然后，將頭發放入1升100mmtris的溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。保留所得提取溶液，然后將頭發放入1升的純水溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖2小時。用篩子回收頭發并丟棄。保留提取溶液，并與在之前步驟中獲得的提取溶液合并，以形成粗角蛋白提取物的溶液。所述提取物通過下述來凈化顆粒物質：通過在30000rpm下運行的固體分離器的離心，隨后通過具有20-25微米平均孔徑的膜的過濾。通過使用100kdanlmwco聚砜，螺旋纏繞過濾器濾筒的超濾，從該凈化的粗角蛋白提取物獲得角蛋白納米材料。使用相對于緩沖劑的8體積洗滌、隨后相對于純水的3體積洗滌來進行超濾，所述緩沖劑由在ph9.1下的5mm磷酸氫二鈉和150mm氯化鈉組成。濃縮純化的角蛋白納米材料溶液，滴定到ph8.5，冷凍，并進行冷凍干燥來制備角蛋白納米材料粉末。
使用sec來分析來自緩沖劑超濾和使用常規水超濾的重復提取過程的樣品，以評估純化角蛋白納米材料的存在。在具有20微升螺旋環的dionex手動注射器和設定在280nm下的ultimate3000uv/vis檢測器上分析樣品。使用chromeleonv6.8色譜軟件來進行數據收集。
sec色譜圖表明使用常規水超濾主要得到低分子量多肽(圖5a)，而緩沖劑超濾得到純化的角蛋白納米材料(圖5b)。
實施例5:通過na2s/脲的還原溶液提取的角蛋白樣品的尺寸排阻層析
從商業供應商獲得中國人頭發的樣品，并未經處理直接使用。將100克的頭發放入4升0.042m硫化鈉和1m脲(ph12.6)溶液中，并在37℃下在150rpm下振搖1.5小時。在保溫之后，用篩子回收頭發，并保留提取溶液。然后，通過在37℃下在150rpm下振搖30分鐘，來用1升純水進一步提取頭發纖維。用篩子回收頭發并丟棄，同時保留并混合提取溶液。然后，粗角蛋白提取物通過下述來凈化顆粒物質：通過在30000rpm下運行的固體分離器的離心，隨后通過具有20-25微米平均孔徑的膜的過濾。通過使用100kdanlmwco聚砜，螺旋纏繞過濾器濾筒的超濾，從這個凈化的粗角蛋白提取物獲得角蛋白納米材料。使用用于10體積洗滌的在ph9.1下的由5mm磷酸氫二鈉和150mm硫化鈉組成的緩沖劑，和隨后相對于純水的3體積洗滌，在一半的提取物上進行超濾。濃縮純化的角蛋白納米材料溶液，滴定到ph8.5，冷凍，并進行冷凍干燥來制備角蛋白納米材料粉末。利用角蛋白納米材料粉末來形成穩定的水凝膠和支架。
使用sec來分析來自緩沖劑超濾和使用常規水超濾的重復提取過程的樣品，以評估純化角蛋白納米材料的存在。在具有20微升螺旋環的dionex手動注射器和設定在280nm下的ultimate3000uv/vis檢測器上分析樣品。使用chromeleonv6.8色譜軟件來進行數據收集。sec色譜圖表明與所用的提取過程無關，使用常規的水超濾主要得到低分子量多肽，而緩沖劑超濾得到純化的角蛋白納米材料。
實施例6:制備角蛋白納米材料水凝膠
從商業供應商獲得中國人頭發的樣品，并未經處理直接使用。將100g的頭發纖維放置進入2升2重量/體積百分比過乙酸中，并在37℃下在150rpm下振搖8小時。通過篩子回收氧化的頭發，并通過在37℃下在150rpm下振搖16小時使用4升100mm的tris堿來提取氧化的頭發。通過篩子回收頭發，保留提取物溶液，且通過在37℃下在150rpm下振搖2小時使用4升的純水來進一步提取頭發纖維。用篩子回收頭發并丟棄，并保留提取物溶液。組合兩種提取物溶液來形成粗角蛋白提取物的溶液，其通過下述來凈化顆粒物質：通過在40000rpm下運行的固體分離器的離心，隨后通過具有20-25微米平均孔徑的膜的過濾。通過使用100千道爾頓(kilodalton)nlmwco聚砜，螺旋纏繞過濾器濾筒的超濾，從該粗溶液獲得角蛋白納米材料。所用的緩沖劑由在約ph7.4下的10mm磷酸氫二鈉和100mm氯化鈉組成，超濾進行5體積洗滌。超濾的第二階段使用純水的5體積洗滌來進行。濃縮純化的角蛋白納米材料溶液，滴定到ph7.4，冷凍，并進行冷凍干燥來制備角蛋白納米材料粉末。在10、8和5重量/重量百分比角蛋白和純水下，將干燥的角蛋白納米材料粉末重組成粘性水凝膠。全部3個水凝膠都不流動，且在于37℃下保溫24小時之后是完整的。
應理解，說明書和實施例闡述本發明的實施方式，且對于本領域普通技術人員而言暗示了在所要求保護的實施方式的精神和范圍之內的其它實施方式。雖然結合具體的形式及其實施方式描述了本發明，應理解在不偏離如在所附權利要求所限定的實施方式的精神或范圍的情況下，可訴諸于除了如上所述的那些以外的各種修改。例如，可取代那些具體描述的等同物，且在一些情況下，步驟的具體應用可顛倒或插入，全部不偏離如在所附權利要求所限定的本發明的實施方式的精神或范圍。此外，本領域技術人員會認識到本發明的特征可基于給定的應用或設計的要求和特點單獨使用、以任意組合使用或省略。當實施方式指“包括”某些特征時，應理解該實施方式可替代的“由所述特征中的任意一種或多種組成”或“主要由所述特征中的任意一種或多種組成”。
特別要指出的是，在本說明書中提供數值范圍時，還具體披露了在該范圍的上限和下限之間的每一數值。且在該范圍中可獨立地包括或排除這些較小范圍的上限和下限。此外，本發明中引用的參考文獻各自單獨地通過全文引用結合于此，這樣用于提供有效的補充實現本發明披露的方式，以及用于提供細化本領域普通技術人員水平的背景。
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