一種從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及酪氨酸酶抑制劑的制備方法，特別涉及一種從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法。
【背景技術】
[0002]酪氨酸酶是皮膚黑色素生物合成過程中的關鍵限速酶，該酶催化酪氨酸形成多巴，再以多巴為底物生成多巴醌，多巴醌在非酶促條件下反應最終合成黑色素。酪氨酸酶的活性與黑色素的合成量密切相關，如果酪氨酸酶活力過高，容易導致各種色斑，甚至黑色素瘤的形成。酪氨酸酶也是果蔬酶促褐變的主要酶，果蔬在貯運保鮮的過程中，在氧氣和酪氨酸酶的作用下發生褐變，導致感官和品質下降，影響產品的運銷。抑制酪氨酸酶的活性，不僅可以防止人體黑色素的異常沉著，解決色斑和美白等問題，還對抑制果蔬的酶促褐變，延長貨架期具有重要意義。
[0003]蜂花粉是指蜜蜂從植物花朵采集的花粉，經過蜜蜂加入花蜜和唾液混合而成的團狀物。蜂花粉含有200多種營養成分，被認為是最完美的營養品之一。蜂花粉還含有多種生物活性成分，具有延緩衰老、保肝護肝、提高免疫力、軟化心腦血管、防止貧血、抑制前列腺疾病等保健作用，是一種天然的優質資源。我國蜂花粉資源豐富，但目前市場上的蜂花粉主要是簡單殺菌的粗制品，附加值低，與國際上著名蜂產品相比，價格較低，蜂花粉資源未被充分開發利用。蜂花粉對酪氨酸酶具有明顯的抑制作用，我們前期研究了目前市場上最常見的蜂花粉品種:油菜蜂花粉、荷花蜂花粉、茶花蜂花粉和玫瑰蜂花粉，發現茶花蜂花粉對酪氨酸酶的抑制效果最強。因此，選擇茶花蜂花粉制備一種天然安全高效的酪氨酸酶抑制劑。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，該方法得到的酪氨酸酶抑制劑具有更強的酶抑制效果。
[0005]本發明提供的方法包括以下步驟；
[0006](I)將茶花蜂花粉粉碎，按重量加入5?20倍的石油醚進行超聲脫脂，抽濾得到濾渣，將濾渣干燥，除去殘留的石油醚；
[0007](2)向脫脂后的茶花蜂花粉中加入70?90%的乙醇水溶液作為提取劑，料液比為Ig: 20?40ml，在40?50°C條件下進行超聲提取，提取時間為30?40min，超聲功率為100?200W，提取次數為2?3次，提取后過濾，將濾液濃縮，真空冷凍干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；
[0008](3)將茶花蜂花粉醇提物溶解在6?10倍重量的水中，然后離心分離濾液；
[0009](4)將步驟(3)得到的濾液上大孔樹脂進行吸附，濾液與大孔樹脂的體積比為1:6?8，用濃度為O %，50 %，95 %乙醇溶液依次梯度洗脫，洗脫流速為I?2ml/min，收集95 %乙醇洗脫組分，濃縮后真空冷凍干燥，得到酪氨酸酶抑制劑。
[0010]優選地，步驟(2)中，向脫脂后的茶花蜂花粉中加入80%的乙醇水溶液作為提取劑，料液比為Ig:30ml。
[0011]優選地，步驟(2)中，在50°C條件下進行超聲提取，提取時間為35min，超聲功率為10W，提取次數為3次。
[0012]優選地，步驟(4)中，所述的大孔樹脂為Amberlite XAD 7HP大孔樹脂。
[0013]優選地，步驟(4)中，濾液與大孔樹脂的體積比為1:8，洗脫流速為lml/min。
[0014]本發明的有益效果是:
[0015](I)本發明采用超聲提取、真空冷凍干燥等工藝，全部工藝流程均在較低的溫度條件下進行，從而減少了對活性成分的破壞，并提高了提取效率;采用大孔樹脂純化能有效富集活性成分，提高產品的純度。實驗證明，未經過大孔樹脂工藝純化的茶花蜂花粉提取物對酪氨酸酶的IC5Q(半抑制率濃度)為1.39mg/ml，而利用本發明制備的茶花蜂花粉提取物對酪氨酸酶的IC5q最優為0.35mg/ml，IC5Q值越小說明抑制效果越好。利用本發明提供的方法獲得的茶花蜂花粉提取物對酪氨酸酶的抑制效果明顯提高，可用于制備預防和治療人體黑色素沉著的美白保健品和護膚品，以及抑制食品酶促褐變的食品添加劑。
[0016](2)本發明提取的酪氨酸酶抑制劑產率高，得率達到4?8%，制備過程操作簡單，周期短，易于推廣應用，可進行工業化生產。
[0017](3)本發明可以提高蜂花粉的附加值和經濟效益，促進蜂產品企業和蜂農增收。
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例1?3制備的酪氨酸酶抑制劑對酪氨酸酶的抑制效果試驗結果。
【具體實施方式】
[0019]下面通過具體實施例對本發明進行詳細地說明。
[0020]實施例1:
[0021](I)將干燥的茶花蜂花粉粉碎，加入10倍重量的石油醚，超聲lh，脫脂3次，抽濾得到濾渣，將濾渣干燥，除去殘留的石油醚；
[0022](2)脫脂后的茶花蜂花粉中加入80%的乙醇水溶液作為提取劑，料液比為Ig:30ml，在50°C條件下進行超聲提取，提取時間為35min，超聲功率為100W，提取次數為3次，提取后抽濾，將提取液旋蒸濃縮，真空冷凍干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；
[0023](3)以上述得到的茶花蜂花粉醇提物和蒸餾水按Ig:1Oml的比例，向茶花蜂花粉醇提物中加入蒸餾水，超聲1min使茶花蜂花粉醇提物均勻分散到蒸餾水中，然后以4000r/min離心5min后，得到濾渣和濾液；
[0024](4)將上述得到的濾液上Amberlite XAD 7HP大孔樹脂進行吸附，濾液與大孔樹脂的體積比為I: 8，用濃度為O %,50%,95%乙醇水溶液依次梯度洗脫，洗脫流速為lml/min，收集95%乙醇洗脫組分，濃縮后真空冷凍干燥，得到酪氨酸酶抑制劑，產率為8%。
[0025]實施例2:
[0026](I)將干燥的茶花蜂花粉粉碎，加入5倍重量的石油醚，超聲2h，脫脂3次，抽濾得到濾渣，將濾渣干燥，除去殘留的石油醚；
[0027](2)脫脂后的茶花蜂花粉中加入70 %的乙醇水溶液作為提取劑，料液比為Ig:40ml，在40 °C條件下進行超聲提取，提取時間為40min，超聲功率為200W，提取次數為3次，提取后抽濾，將提取液旋蒸濃縮，真空冷凍干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；
[0028](3)以上述得到的茶花蜂花粉醇提物和蒸餾水為lg:6ml的比例，向茶花蜂花粉醇提物中加入蒸餾水，超聲1min使茶花蜂花粉醇提物均勻分散到蒸餾水中，然后離心分離濾液；
[0029](4)將上述得到的濾液上Amberlite XAD 7HP大孔樹脂進行吸附，濾液與大孔樹脂的體積比為I: 6，用濃度為O %,50%,95%乙醇水溶液依次梯度洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集95%乙醇洗脫組分，濃縮后真空冷凍干燥，得到酪氨酸酶抑制劑，產率為4.2%。
[0030]實施例3:
[0031](I)將干燥的茶花蜂花粉粉碎，加入20倍重量的石油醚，超聲脫脂I次，抽濾得到濾渣，將濾渣干燥，除去殘留的石油醚；
[0032 ] (2)脫脂后的茶花蜂花粉中加入90 %的乙醇水溶液作為提取劑，料液比為I g: 20ml在45 °C條件下進行超聲提取，提取時間為30min，超聲功率為100W，提取次數為2次，提取后抽濾，將提取液旋蒸濃縮，真空冷凍干燥后得到茶花蜂花粉醇提物；
[0033](3)以上述得到的茶花蜂花粉醇提物和蒸餾水為lg:8ml的比例，向茶花蜂花粉醇提物中加入蒸餾水，超聲溶解后離心，分離濾液；
[0034](4)將上述得到的濾液上Amberlite XAD 7HP大孔樹脂進行吸附，濾液與大孔樹脂的體積比為I: 7，用濃度為O %,50%,95 %乙醇水溶液依次梯度洗脫，洗脫流速為1.5ml/min，收集95%乙醇洗脫組分，濃縮后真空冷凍干燥，得到酪氨酸酶抑制劑，產率為6.8%。
[0035]試驗例:
[0036]將上述3個實施例的酪氨酸酶抑制劑進行酪氨酸酶抑制效果驗證:將產物用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，50mM)配制成不同濃度的受試物。取20μI上述受試物于酶標板中，加入50μ?酪氨酸酶溶液(200U/ml)，37°C孵育2min，然后加入180μ1 L-多巴溶液(0.5mM)，用酶標儀在5m i η內測定47 5nm波長下的OD值變化。
[0037]酪氨酸酶抑制率(% ) = [ 1_(受試物OD值變化速率/酶活OD值變化速率)]X 100%
[0038]測試結果如圖1所示，3個實施例酪氨酸酶抑制劑的IC5q值分別為0.35，0.39，
0.38mg/ml。從實驗結果可以看出，應用本發明技術從茶花蜂花粉中制備的酪氨酸酶抑制劑對酪氨酸酶具有明顯的抑制作用，并且呈劑量依賴效應，可以用于美白祛斑保健品和護膚品，以及食品護色劑等領域。
【主權項】
1.一種從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將茶花蜂花粉粉碎，按重量加入5?20倍的石油醚進行超聲脫脂，抽濾得到濾渣，將濾渣干燥，除去殘留的石油醚； (2)向脫脂后的茶花蜂花粉中加入70?90%的乙醇水溶液作為提取劑，料液比為Ig: 20?40ml，在40?50°C條件下進行超聲提取，提取時間為30?40min，超聲功率為100?200W，提取次數為2?3次，提取后過濾，將濾液濃縮，真空冷凍干燥后得到茶花蜂花粉醇提物； (3)將茶花蜂花粉醇提物溶解在6?10倍重量的水中，然后離心分離濾液； (4)將步驟(3)得到的濾液上大孔樹脂進行吸附，濾液與大孔樹脂的體積比為1:6?8，用濃度為O %,50%,95%乙醇溶液依次梯度洗脫，洗脫流速為I?2ml/min，收集95 %乙醇洗脫組分，濃縮后真空冷凍干燥，得到酪氨酸酶抑制劑。2.如權利要求1所述的從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于:步驟(2)中，向脫脂后的茶花蜂花粉中加入80%的乙醇水溶液作為提取劑，料液比為lg:30ml。3.如權利要求1所述的從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于:步驟(2)中，在50°C條件下進行超聲提取，提取時間為35min，超聲功率為100W，提取次數為3次。4.如權利要求1所述的從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于:步驟(4)中，所述的大孔樹脂為Amberlite XAD 7HP大孔樹脂。5.如權利要求1所述的從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于:步驟(4)中，濾液與大孔樹脂的體積比為1:8，洗脫流速為lml/min。
【專利摘要】本發明公開了一種從茶花蜂花粉中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，該方法是將茶花蜂花粉先粉碎脫脂，然后采用乙醇進行超聲提取，得到的醇提物再經過大孔樹脂進行純化。采用該方法獲得的茶花蜂花粉提取物對酪氨酸酶的抑制效果明顯提高，半抑制率濃度最優可達到0.35mg/ml，因此可廣泛用于制備預防和治療人體黑色素沉著的美白保健品和護膚品，以及抑制食品酶促褐變的食品添加劑。
【IPC分類】A61K35/64, A23L5/41, A61K8/98, A23L33/10, A61P17/00, A61K8/97, A61K36/82, A61Q19/02
【公開號】CN105708971
【申請號】CN201610154204
【發明人】魯群, 雷潤梅, 劉睿, 杜鳴陽, 蘇佳
【申請人】華中農業大學