技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了雙重delta(δ)和gamma(γ)PI3K蛋白質(zhì)激酶調(diào)節(jié)劑，其制備方法，包含其的藥物組合物以及使用其治療、預(yù)防和/或改善PI3K激酶介導(dǎo)的疾病或病癥的方法。

背景技術(shù)：

磷酸肌醇-3激酶(PI3K)屬于一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)激酶，其使磷酸肌醇脂質(zhì)(PI)的肌醇環(huán)的3-位羥基磷酸化，生成脂質(zhì)第二信使。雖然PI3K的α和β同種型在其分布中是遍在的，但PI3K的δ和γ形式的表達(dá)局限于循環(huán)造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。與PI3Kα或PI3Kβ不同，缺乏PI3Kδ或PI3Kγ的表達(dá)的小鼠未顯示任何不利表型，指示靶向這些特異性同種型將不導(dǎo)致明顯毒性。

近來(lái)，PI3K途徑的靶向抑制劑已提出作為免疫調(diào)節(jié)劑。這個(gè)興趣起源于下述事實(shí)：PI3K途徑在免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮多重功能，主要是通過(guò)磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸鹽(PIP3)的生成，所述PIP3是膜結(jié)合的第二信使。PIP3將蛋白質(zhì)召募至脂質(zhì)雙層的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，包括蛋白質(zhì)激酶和GTP酶，起始在免疫細(xì)胞粘附、遷移和細(xì)胞間通信的調(diào)節(jié)中重要的下游信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

四種I類(lèi)PI3K同種型在其組織分布中顯著不同。PI3Kα和PI3Kβ是遍在的且在受體酪氨酸激酶(RTK)的下游活化，而PI3Kδ和PI3Kγ主要限制于造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并且分別在RTK和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的下游活化。小鼠遺傳研究已揭示PI3Kα和PI3Kβ是正常發(fā)育必需的，而PI3Kδ和/或PI3Kγ的喪失獲得具有選擇性免疫缺陷(deficit)的活后代。

PI3Kδ和PI3Kγ的表達(dá)模式和功能已生成了開(kāi)發(fā)PI3Kδ/γ抑制劑作為用于治療許多疾病的活性劑的很大興趣，所述許多疾病包括例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏、哮喘、慢性阻塞性肺病和多發(fā)性硬化(Hirsch等人，Pharmacol.Ther.，118，192-205，2008；Marone等人，Biochim.Biophys.Acta.，1784，159-185，2008；Rommel等人，Nat.Rev.Immunol.，7，191-201，2007；Ruckle等人，Nat.Rev.Drug Discov.，5，903-918，2006)。使用藥理學(xué)和遺傳方法兩者的研究已顯示這兩種同種型通常證實(shí)與彼此的協(xié)同相互作用(Konrad等人，J.Biol.Chem.，283，33296-33303，2008；Laffargue等人，Immunity，16，441-451，2002)。在肥大細(xì)胞中，例如，PI3Kδ是響應(yīng)Fc受體的IgE交聯(lián)的脫顆粒必需的(Ali等人，J.Immunol.，180，2538-2544，2008)，而PI3Kγ在放大應(yīng)答中起重要作用(Laffargue等人，Immunity，16，441-451，2002)。類(lèi)似效應(yīng)已在其他細(xì)胞功能中看到，包括淋巴細(xì)胞歸巢和嗜中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，其中PI3Kγ起關(guān)鍵作用，并且PI3Kδ放大每個(gè)過(guò)程。PI3Kδ和PI3Kγ的非冗余但相關(guān)作用已使得難以確定兩種同種型中的哪種(單獨(dú)或組合)在特定炎癥病癥中最佳靶向。

使用缺乏PI3Kδ和/或PI3Kγ或表達(dá)PI3Kδ和PI3Kγ的激酶死亡變體的小鼠的研究在理解其作用中是有價(jià)值的工具。例如，PI3Kδ敲除小鼠證實(shí)減少的嗜中性粒細(xì)胞趨化性，減少的抗體生產(chǎn)(T細(xì)胞依賴(lài)性和不依賴(lài)性?xún)烧?(Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591，2002)，以及更低數(shù)目的成熟B細(xì)胞(Clayton等人，J.Exp.Med.，196，753-763，2002；Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591，2002)，以及其響應(yīng)抗IgM的增殖中的減少(Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591，2002)。這種表型在PI3Kδ激酶死亡變體中復(fù)制，并且使用PI3Kδ選擇性抑制劑連同肥大細(xì)胞的數(shù)目和增殖減少，以及減弱的變應(yīng)性應(yīng)答。PI3Kγ敲除含有更高數(shù)目但更少應(yīng)答性的嗜中性粒細(xì)胞，更低數(shù)目和更少應(yīng)答性的巨噬細(xì)胞，以及展示減少的肥大細(xì)胞脫顆粒的樹(shù)突狀細(xì)胞(Laffargue等人，Immunity，16，441-451，2002)，CD4+與CD8+T細(xì)胞的更高比率，增加的胸腺細(xì)胞凋亡，CXCR3對(duì)活化T細(xì)胞的減少誘導(dǎo)和減少的心臟收縮性。對(duì)心臟組織的這種后面一種作用是關(guān)于患者用PI3Kγ抑制劑的長(zhǎng)期給藥的關(guān)注。然而，當(dāng)PI3Kγ激酶死亡變體(其更佳地模擬激酶的抑制而不是蛋白質(zhì)的喪失)顯示相似的免疫細(xì)胞表型，但重要的是沒(méi)有心臟缺陷時(shí)，這種關(guān)注在很大程度上減輕。心臟效應(yīng)隨后顯示是由于支架效應(yīng)而不是PI3Kγ的催化活性(Olusegon等人，Chemistry&Biology，1，123-134，2010，包括其中引用的參考文獻(xiàn))。雙重PI3Kδ/PI3Kγ敲除是可行的，但顯示出在T細(xì)胞發(fā)育和胸腺細(xì)胞存活中的嚴(yán)重缺陷。PI3Kγ敲除/PI3Kδ激酶死亡組合產(chǎn)生相似表型，提示至少在免疫系統(tǒng)內(nèi)，PI3Kδ的作用可能僅是催化作用。使用敲除和激酶死亡小鼠的研究的解釋可能是挑戰(zhàn)性的，因?yàn)檫@些模型僅提供了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)圖像，缺乏瞬時(shí)和劑量控制，并且不允許完全理解動(dòng)態(tài)免疫應(yīng)答如何反應(yīng)以逆轉(zhuǎn)抑制。具有不同概況(PI3Kδ、PI3Kγ和PI3Kδ/γ)的選擇性抑制劑是白細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的研究必要的，以便評(píng)價(jià)每種PI3K對(duì)免疫細(xì)胞活化的相對(duì)貢獻(xiàn)(Olusegon等人，同上，包括其中引用的參考文獻(xiàn))。

δ/γ的雙重抑制強(qiáng)烈牽涉作為氣道的變應(yīng)性和非變應(yīng)性炎癥及其他自身免疫疾病中的干預(yù)策略。關(guān)于哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)潛在的各種細(xì)胞過(guò)程中的PI3Kδ和PI3Kγ牽涉的科學(xué)證據(jù)起源于抑制劑研究和基因靶向方法(William等人Chemistry&Biology，17，123-134，2010和Thompson等人Chemistry＆Biology，17：101-102，2010)。另外，在幾個(gè)COPD患者中對(duì)常規(guī)療法例如皮質(zhì)類(lèi)固醇的抗性已歸于PI3K δ/γ途徑的上調(diào)。PI3Kδ/γ信號(hào)傳導(dǎo)的破壞因此提供了旨在抵抗免疫-炎癥應(yīng)答的新型策略。由于通過(guò)PI3Kδ和PI3Kγ在介導(dǎo)炎癥細(xì)胞功能性(例如白細(xì)胞遷移和活化、以及肥大細(xì)胞脫顆粒)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，阻斷這些同種型同樣還可以是用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效策略。考慮到這些同種型在免疫監(jiān)督中確定的關(guān)鍵性，特異性靶向PI3Kδ和PI3Kγ同種型的抑制劑將預(yù)期減弱在氣道炎癥和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中遇到的免疫應(yīng)答的進(jìn)展(William等人Chemistry&Biology，17，123-134，2010和Thompson等人Chemistry&Biology，17：101-102，2010)。

關(guān)于PI3K和相關(guān)蛋白質(zhì)激酶途徑的綜述和研究已由Liu等人，Nature Reviews Drug Discovery，8，627-644，2009)；Nathan等人，Mol Cancer Ther.，8(1)，2009；Marone等人，Biochimica et Biophysica Acta，1784，159-185，2008和2009年8月公開(kāi)的Markman等人，Annals of Oncology Advance Access給出。類(lèi)似地，關(guān)于PI3Kδ和PI3Kγ的作用的綜述和研究已由William等人，Chemistry&Biology，17，123-134，2010和Timothy等人J.Med.Chem.，55(20)，8559-8581，2012給出。所有這些文獻(xiàn)公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式在此全文并入。

化合物例如IPI-145和CAL130已作為Pi3K δ/γ的雙重抑制劑報(bào)道(分別為WO2012/008302&WO2012/121953)。IPI-145處于關(guān)于癌癥、哮喘和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床研究下。IPI-45據(jù)報(bào)道具有75mg BID的最大耐受劑量(MTD)(55th Annual Meeting.New Orleans-LA，Dec 7-10，2013)。不存在CAL-130就臨床目的研究的報(bào)道。

仍存在關(guān)于用于治療與δ/γPI3K激酶介導(dǎo)事件相關(guān)的疾病和病癥的雙重δ/γPI3K調(diào)節(jié)劑的未滿足的需要。

本文進(jìn)一步參考國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 11/055215和WO 12/151525以及美國(guó)公開(kāi)號(hào)2011/0118257和2012/0289496，所述公開(kāi)號(hào)各自以引用的方式全文并入本文。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及PI3K delta(δ)和gamma(γ)蛋白質(zhì)激酶的選擇性雙重抑制劑。這些化合物適用于用于治療PI3K相關(guān)疾病、病癥或狀況，例如增殖性疾病例如癌癥的藥物組合物中。PI3Kδ和PI3Kγ蛋白質(zhì)激酶兩者的抑制均可在某些疾病和病癥的治療中提供有益效應(yīng)。

本發(fā)明的選擇性雙重抑制劑包括N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺、其藥學(xué)可接受的鹽及其藥物前體。例如，選擇性雙重抑制劑可選自下述化合物、其藥學(xué)可接受的鹽及其藥物前體：

(RS)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A)；和

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A1)。

在一個(gè)實(shí)施例中，化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽基本上不含(例如含有按重量計(jì)小于約10％，例如小于約5％、小于約2.5％、小于約1％、小于約0.1％)或不含(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺及其藥學(xué)可接受的鹽。

在另一個(gè)實(shí)施例中，化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽具有大于約90％，例如大于約91％、大于約92％、大于約93％、大于約94％、大于約95％、大于約96％、大于約97％、大于約98％、大于約99％、大于約99.5％、大于約99.9％、或大于約99.99％的對(duì)映體過(guò)量。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A1)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及化合物(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A2)、其藥學(xué)可接受的鹽或其藥物前體。化合物A2是PI3K delta(δ)蛋白質(zhì)激酶的抑制劑。這些化合物適用于用于治療PI3K相關(guān)疾病、病癥或狀況，例如增殖性疾病例如癌癥的藥物組合物中。

N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺、化合物A1和化合物A2的化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示于下文。

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種化合物(例如化合物A1)連同藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物還可包含另外的活性劑(例如抗癌劑和下文討論的活性劑)中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明的一種或多種化合物。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于制備N(xiāo)-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺的方法：

該方法包括下述步驟：

(a)使5-溴-2-甲氧基苯胺

與甲磺酰氯反應(yīng)，以獲得N-(5-溴-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(中間產(chǎn)物1)：

(b)例如在乙酸鉀的存在下，使中間產(chǎn)物1與雙(戊酰)二硼反應(yīng)，以獲得N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼烷-2-基)苯基)甲基磺酰胺(中間產(chǎn)物2)：

(c)在堿(例如碳酸鈉)的存在下使2-(1-(4-氨基-3-碘代-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮

與中間產(chǎn)物2反應(yīng)，以獲得所需化合物N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺；

(d)任選地將N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺轉(zhuǎn)換為其藥學(xué)可接受的鹽或其藥物前體。

另外一個(gè)實(shí)施例涉及用于制備式(A1)的化合物的方法：

該方法包括下述步驟：

(a)使用3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺，使(R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羥乙基)-4H-色烯-4-酮經(jīng)歷Mitsunobu反應(yīng)

(例如，在三苯基膦和偶氮二羧酸二異丙酯的存在下)，以獲得(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(中間產(chǎn)物3)：

(b)例如用還原劑例如Raney Ni使中間產(chǎn)物3還原，以獲得(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(中間產(chǎn)物4)：

(c)用甲磺酰氯處理中間產(chǎn)物4，以獲得所需式(A1)的化合物；和

(d)任選地將化合物(A1)轉(zhuǎn)換為其藥學(xué)可接受的鹽或其藥物前體。

另外一個(gè)實(shí)施例是可用于制備本發(fā)明的化合物例如(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮、(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮及其鹽的中間產(chǎn)物。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是抑制患者中的PI3Kδ和PI3Kγ的方法，所述方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的至少一種化合物。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是抑制患者中的PI3Kδ的方法，所述方法包括給患者施用有效量的(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(化合物A2)、其藥學(xué)可接受的鹽或其藥物前體中的至少一種。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是治療、預(yù)防和/或抑制患者中的PI3K蛋白質(zhì)激酶介導(dǎo)的疾病、病癥或狀況(例如增殖性疾病或病癥，例如癌癥)的方法，所述方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的至少一種化合物。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是用于抑制患者中的PI3K特別是PI3Kδ和PI3Kγ的方法，所述方法包括給患者施用有效量的本發(fā)明的至少一種化合物。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是經(jīng)由蛋白質(zhì)激酶(例如PI3Kδ和PI3Kγ)的調(diào)節(jié)用于治療炎性疾病、自身免疫疾病或增殖性疾病的方法，所述方法包括給需要此類(lèi)治療的患者施用有效量的本發(fā)明的至少一種化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物抑制PI3Kδ和PI3Kγ兩者。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是通過(guò)給需要此類(lèi)治療的患者施用有效量的本發(fā)明的至少一種化合物，與至少一種其他抗炎劑、免疫調(diào)節(jié)劑或抗癌劑或其組合相組合(同時(shí)或序貫)，經(jīng)由蛋白質(zhì)激酶(例如PI3Kδ和PI3Kγ)的調(diào)節(jié)用于治療炎性疾病、自身免疫疾病或增殖性疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物抑制PI3Kδ和PI3Kγ兩者。

本發(fā)明的化合物可用于治療各種癌癥，包括但不限于：

癌，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌包括小細(xì)胞肺癌、食道癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌和皮膚癌包括鱗狀細(xì)胞癌；

淋巴譜系的造血腫瘤，包括但不限于白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛細(xì)胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤；

骨髓譜系的造血腫瘤，包括但不限于急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生異常綜合征和前髓細(xì)胞性白血病；

間充質(zhì)起源的腫瘤，包括但不限于纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；

中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括但不限于星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；和

其他腫瘤，包括但不限于黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、著色性干皮病、角化棘皮瘤、甲狀腺濾泡癌和卡波西氏肉瘤。

在一個(gè)實(shí)施例中，施用有效量的本發(fā)明的化合物，以治療白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛細(xì)胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性和慢性髓性白血病、骨髓增生異常綜合征或前髓細(xì)胞性白血病。

由于蛋白質(zhì)激酶在一般而言的細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，本發(fā)明的化合物可以充當(dāng)可逆細(xì)胞抑制劑，并且因此可用于治療特征在于異常細(xì)胞增殖的任何疾病過(guò)程，例如良性前列腺增生癥、家族性腺瘤性息肉病、神經(jīng)纖維瘤病、動(dòng)脈粥樣硬化、肺纖維化、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、腎小球腎炎、血管成形術(shù)或血管手術(shù)后再狹窄、肥厚性瘢痕形成、炎性腸病、移植排斥、內(nèi)毒素休克和真菌感染。

作為細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑的本發(fā)明的化合物可用于治療癌癥(包括但不限于本文上文提及的那些類(lèi)型)、病毒感染(包括但不限于皰疹病毒、痘病毒、EB病毒、辛德比斯病毒和腺病毒)、自身免疫疾病(包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫介導(dǎo)的腎小球腎炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、炎性腸病和自身免疫性糖尿病)、神經(jīng)變性病癥(包括但不限于阿爾茨海默氏病、AIDS相關(guān)癡呆、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、脊髓性肌萎縮和小腦變性)、骨髓增生異常綜合征、再生障礙性貧血、與心肌梗死相關(guān)的缺血性損傷、中風(fēng)和再灌注損傷、心律不齊、動(dòng)脈粥樣硬化、毒素誘導(dǎo)的或酒精相關(guān)的肝疾病、血液病(包括但不限于慢性貧血和再生障礙性貧血)、肌肉骨骼系統(tǒng)的退行性疾病(包括但不限于骨質(zhì)疏松癥和關(guān)節(jié)炎)、阿司匹林敏感性鼻竇炎、囊性纖維化、多發(fā)性硬化、腎臟疾病和癌癥疼痛。本發(fā)明的化合物還可用于預(yù)防、抑制或壓制HIV感染個(gè)體中的AIDS發(fā)展。

本發(fā)明的化合物可調(diào)節(jié)細(xì)胞RNA和DNA合成的水平。本發(fā)明的化合物因此可用于治療病毒感染，包括但不限于HIV、人乳頭狀瘤病毒、皰疹病毒、痘病毒、EB病毒、辛德比斯病毒和腺病毒。

本發(fā)明的化合物可用于癌癥的化學(xué)預(yù)防。化學(xué)預(yù)防在本文中定義為通過(guò)阻斷起始誘變事件或通過(guò)阻斷已經(jīng)患有損傷的惡化前細(xì)胞的進(jìn)展或抑制腫瘤復(fù)發(fā)，來(lái)抑制侵襲性癌癥的發(fā)展。本發(fā)明的化合物還可用于抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是通過(guò)施用有效量的本發(fā)明的一種或多種化合物，抑制有此需要的患者中的腫瘤血管生成或轉(zhuǎn)移的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是治療免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病或免疫病癥(例如自身免疫疾病)、涉及炎癥的疾病或病癥(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、腎小球腎炎、神經(jīng)炎癥性疾病、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎和免疫系統(tǒng)病癥)、癌癥或其他增殖性疾病、肝臟疾病或病癥、腎臟疾病或病癥的方法。該方法包括施用有效量的本發(fā)明的一種或多種化合物。

免疫病癥的例子包括但不限于銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、炎性腸病、皮炎、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、炎性肌肉疾病、變應(yīng)性鼻炎、陰道炎、間質(zhì)性膀胱炎、硬皮病、骨質(zhì)疏松癥、濕疹、同種異體移植或異種移植(器官、骨髓、干細(xì)胞及其他細(xì)胞和組織)移植物排斥、移植物抗宿主病、紅斑狼瘡、炎性疾病、I型糖尿病、肺纖維化、皮肌炎、干燥綜合征、甲狀腺炎(例如橋本氏甲狀腺炎和自身免疫性甲狀腺炎)、重癥肌無(wú)力、自身免疫性溶血性貧血、多發(fā)性硬化、囊性纖維化、慢性復(fù)發(fā)性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、變應(yīng)性結(jié)膜炎和特應(yīng)性皮炎。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文描述的化合物可用作免疫抑制劑，以預(yù)防移植物排斥、同種異體或異種移植排斥(器官、骨髓、干細(xì)胞、其他細(xì)胞和組織)和移植物抗宿主病。在一個(gè)特定實(shí)施例中，移植物排斥起因于組織或器官移植物。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，移植物抗宿主病起因于骨髓或干細(xì)胞移植。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是預(yù)防或減少移植物排斥、同種異體或異種移植排斥(器官、骨髓、干細(xì)胞、其他細(xì)胞和組織)或移植物抗宿主病的危險(xiǎn)的方法，所述方法包括施用有效量的本發(fā)明的一種或多種化合物。

本發(fā)明的化合物還可與下述組合使用(一起或序貫施用)：已知的抗癌治療例如放射療法或者細(xì)胞抑制劑或細(xì)胞毒性劑或抗癌劑，例如DNA相互作用劑，例如順鉑或多柔比星；拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，例如依托泊苷；拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑如CPT-11或拓?fù)涮婵担惶烊淮嬖诘幕蚝铣傻奈⒐艿鞍紫嗷プ饔脛缱仙即肌⒍辔魉惢虬２┟顾?例如伊沙匹隆)；激素試劑，例如他莫昔芬；胸苷酸合酶抑制劑，例如5-氟尿嘧啶；和抗代謝物，例如甲氨蝶呤，其他酪氨酸激酶抑制劑，例如Iressa和OSI-774；血管生成抑制劑；EGF抑制劑；VEGF抑制劑；CDK抑制劑；SRC抑制劑；c-Kit抑制劑；Her1/2抑制劑和針對(duì)生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體例如愛(ài)必妥(EGF)和赫賽汀(Her2)；BTK抑制劑，例如依魯替尼；和其他蛋白質(zhì)激酶調(diào)節(jié)劑，及其任何組合。

本發(fā)明的化合物還可與一種或多種甾體抗炎藥、非甾體抗炎藥(NSAID)和免疫選擇性抗炎衍生物(ImSAID)及其任何組合相組合使用(一起或序貫施用)。

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種化合物和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物還可包含上文鑒定的活性成分中的一種或多種，例如其他抗癌劑。

另外一個(gè)實(shí)施例是治療有此需要的患者中的白血病的方法，所述方法包括施用治療有效量的本發(fā)明的化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，白血病選自慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、急性髓性白血病(AML)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)和惰性非霍奇金淋巴瘤(I-NHL)。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是治療有此需要的患者中的自身免疫病癥的方法，所述方法包括施用治療有效量的本發(fā)明的化合物。在一個(gè)實(shí)施例中，自身免疫病癥選自哮喘、COPD、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、狼瘡和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)。

本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例是治療有此需要的患者中的變應(yīng)性鼻炎的方法，所述方法包括給患者施用治療有效量的本發(fā)明的化合物。

在上述方法的任一種中，本發(fā)明的化合物和任選的另外的活性劑可以如本文描述的藥物組合物的形式施用。

附圖說(shuō)明

圖1描述了根據(jù)測(cè)定7中所述的脂多糖誘導(dǎo)的肺嗜中性粒細(xì)胞增多癥模型，來(lái)自用10mg/kg化合物A1(po)處理的雌性Wistar大鼠的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的條形圖。

圖2描述了根據(jù)測(cè)定8中所述的脂多糖誘導(dǎo)的大鼠空氣袋炎癥模型，來(lái)自用1、3和10mg/kg化合物A1(po)處理的Wistar大鼠的腹膜灌洗液中的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的條形圖。

圖3A和3B分別描述了根據(jù)測(cè)定11中的程序，在用對(duì)照或10mg/kg/QD化合物A1處理的具有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的Wistar大鼠中，關(guān)于后爪和前爪的個(gè)別臨床得分和關(guān)于臨床得分的AUC的線和條形圖。

圖3C和3D分別描述了根據(jù)測(cè)定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1處理的具有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的Wistar大鼠中，關(guān)于后爪和前爪的個(gè)別臨床得分的線和條形圖。

圖4A和4B分別描述了根據(jù)測(cè)定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1處理的具有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的Wistar大鼠中，關(guān)于后爪的體積和爪體積的AUC的線和條形圖。

圖4C和4D分別描述了根據(jù)測(cè)定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1處理的具有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的Wistar大鼠中，關(guān)于后爪的踝直徑和踝直徑的AUC的線和條形圖。

圖4E至4G分別描述了根據(jù)測(cè)定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1處理的具有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的Wistar大鼠中，所有后爪和前爪的炎癥抑制、軟骨和血管翳的組織病理學(xué)得分的條形圖。

圖4H描述了根據(jù)測(cè)定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1處理的具有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的Wistar大鼠中，所有后爪和前爪的總組織病理學(xué)得分的條形圖。

圖5描述了根據(jù)測(cè)定11中的程序，在用媒介物或10mg/kg/QD化合物A1處理的具有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的Wistar大鼠中，關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率百分比的條形圖。

圖6A和6B描述了條形圖，顯示根據(jù)測(cè)定13中的程序，化合物A1(3、10、30mg/kg)對(duì)Balb/c小鼠中的咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病的抗銀屑病作用。

具體實(shí)施方式

如本文使用的，除非另有說(shuō)明，否則應(yīng)該應(yīng)用下述定義。此外，本文定義的基團(tuán)中的許多可為任選取代的。定義中的取代基列表是示例性的，并且不應(yīng)解釋為限制說(shuō)明書(shū)中其他地方定義的取代基。

本文描述的化合物中的某些含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)中心，并且因此可產(chǎn)生對(duì)映體、非對(duì)映體及其他立體異構(gòu)形式，其可根據(jù)絕對(duì)立體化學(xué)定義為(R)-或(S)-。除非另有說(shuō)明，否則本文的化學(xué)實(shí)體、藥物組合物和方法意欲包括所有此類(lèi)可能的異構(gòu)體，包括外消旋混合物，任選的純形式和中間產(chǎn)物混合物。例如，中間產(chǎn)物混合物的非限制性例子包括以10∶90、13∶87、17∶83、20∶80、或22∶78比率的R∶S或S∶R異構(gòu)體的混合物。光學(xué)活性的(R)-和(S)-異構(gòu)體可使用手性合成子或手性試劑進(jìn)行制備，或使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行分解。當(dāng)本文描述的化合物含有烯屬雙鍵或其他幾何不對(duì)稱(chēng)中心時(shí)，并且除非另有說(shuō)明，否則預(yù)期化合物包括E和Z幾何異構(gòu)體兩者。

術(shù)語(yǔ)“互變異構(gòu)體”指特征在于處于平衡的異構(gòu)體形式的相對(duì)容易的互換的化合物。這些異構(gòu)體預(yù)期由本發(fā)明涵蓋。“互變異構(gòu)體”是通過(guò)互變異構(gòu)化互換的結(jié)構(gòu)上不同的異構(gòu)體。“互變異構(gòu)化”是異構(gòu)化形式，并且包括質(zhì)子轉(zhuǎn)移或質(zhì)子移位互變異構(gòu)化，其視為酸堿化學(xué)的子集。“質(zhì)子轉(zhuǎn)移互變異構(gòu)化”或“質(zhì)子移位互變異構(gòu)化”涉及質(zhì)子的遷移，伴隨鍵級(jí)的變化，通常為單鍵與鄰近雙鍵的互換。當(dāng)互變異構(gòu)化是可能的(例如在溶液中)時(shí)，可實(shí)現(xiàn)互變異構(gòu)體的化學(xué)平衡。互變異構(gòu)化的例子是酮-烯醇互變異構(gòu)化。酮-烯醇互變異構(gòu)化的具體例子是戊烷-2，4-二酮和4-羥基戊-3-烯-2-酮互變異構(gòu)體的互換。互變異構(gòu)化的另一個(gè)例子是酚-酮互變異構(gòu)化。酚-酮互變異構(gòu)化的具體例子是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互變異構(gòu)體的互換。

術(shù)語(yǔ)“藥物前體”指其為化合物的失活前體的化合物，所述化合物通過(guò)正常代謝過(guò)程在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成其活性形式。藥物前體設(shè)計(jì)一般在Hardma等人(編輯)，Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，第11-16頁(yè)(1996)中討論。深入討論在Higuchi等人，Prodrugs as Novel Delivery Systems，第14卷，ASCD Symposium Series，以及Roche(編輯)，Bioreversible Carriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press(1987)中提供。為了舉例說(shuō)明，藥物前體可通過(guò)例如酯鍵或酰胺鍵的水解轉(zhuǎn)換成藥理學(xué)活性形式，由此引入官能團(tuán)或暴露在所得的產(chǎn)物上的官能團(tuán)。藥物前體可設(shè)計(jì)為與內(nèi)源化合物反應(yīng)，以形成水溶性綴合物，其還增強(qiáng)化合物的藥理性質(zhì)，例如增加的循環(huán)半衰期。可替代地，藥物前體可設(shè)計(jì)為經(jīng)歷用例如葡萄糖醛酸、硫酸鹽、谷胱甘肽、氨基酸或乙酸鹽的官能團(tuán)上的共價(jià)修飾。所得到的綴合物可為失活的且在尿中排泄，或致使比母體化合物更有效。高分子量綴合物還可排泄到膽汁內(nèi)，經(jīng)歷酶促切割，并且釋放回循環(huán)內(nèi)，由此有效增加原始施用的化合物的生物半衰期。

術(shù)語(yǔ)“酯”指通過(guò)酸和醇之間的反應(yīng)形成的化合物，伴隨水的消除。酯可由通式RCOOR′(其中R是藥物，并且R’是化學(xué)基團(tuán))表示。

這些藥物前體和酯預(yù)期涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

另外，本發(fā)明還包括區(qū)別僅在于一種或多種同位素富集原子的存在的化合物，例如氫由氘或氚替換，或碳由¹³C-或¹⁴C-富集的碳替換。

本發(fā)明的化合物還可含有在一個(gè)或多個(gè)原子處非天然比例的原子同位素，所述原子構(gòu)成此類(lèi)化合物。例如，化合物可用放射性同位素例如氚(³H)、碘-125(¹²⁵I)或碳-14(¹⁴C)進(jìn)行放射性標(biāo)記。本發(fā)明的化合物的所有同位素變化，無(wú)論是放射性的還是并非放射性的，均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

形成本發(fā)明的部分的藥學(xué)可接受的鹽包括來(lái)源于無(wú)機(jī)堿例如Li、Na、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn和Mn的鹽；有機(jī)堿例如N，N′-二乙酰基乙二胺、葡糖胺、三乙胺、膽堿、氫氧化物、二環(huán)己胺、二甲雙胍、芐胺、三烷基胺和硫胺素的鹽；手性堿例如烷基苯基胺、甘氨醇和苯基甘氨醇；天然氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、組氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸和絲氨酸的鹽；本發(fā)明的化合物與烷基鹵化物的季銨鹽，烷基硫酸鹽例如MeI和(Me)₂SO₄；非天然氨基酸例如D-異構(gòu)體或取代氨基酸；胍；以及取代胍，其中取代基選自硝基、氨基、烷基、烯基、炔基、銨或取代的銨鹽和鋁鹽。鹽可包括適當(dāng)?shù)乃峒映甥}，所述酸加成鹽可為硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、高氯酸鹽、硼酸鹽、氫鹵酸鹽、乙酸鹽、酒石酸鹽、馬來(lái)酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、撲酸鹽(palmoate)、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、苯磺酸鹽、抗壞血酸鹽、甘油磷酸鹽和酮戊二酸鹽。

當(dāng)范圍在本文中用于物理性質(zhì)例如分子量或化學(xué)性質(zhì)例如化學(xué)式時(shí)，預(yù)期包括范圍以及其中的具體實(shí)施例的所有組合和子組合。當(dāng)指數(shù)目或數(shù)目范圍時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”意指數(shù)目或數(shù)目范圍指的是實(shí)驗(yàn)變異性?xún)?nèi)(或統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi))的近似值，并且因此數(shù)目或數(shù)目范圍可例如在所述數(shù)目或數(shù)目范圍的1％至15％之間變化。術(shù)語(yǔ)“包含(comprising)”(和相關(guān)術(shù)語(yǔ)例如“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“具有”或“包括”)包括“由所述特征組成”或“基本上由所述特征組成”的那些實(shí)施例，例如任何物質(zhì)組成、組合物、方法或過(guò)程等等的實(shí)施例。

下述縮寫(xiě)和術(shù)語(yǔ)自始至終具有所示含義：PI3-K＝磷酸肌醇3-激酶；PI＝磷脂酰肌醇；AIDS＝獲得性免疫缺陷綜合征；HIV＝人免疫缺陷病毒；MeI＝碘代甲烷；ND：未測(cè)定。

本文使用的縮寫(xiě)具有其在化學(xué)領(lǐng)域和生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)含義。

術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖”指通過(guò)其細(xì)胞數(shù)目由于分裂而改變的現(xiàn)象。該術(shù)語(yǔ)還包含通過(guò)其細(xì)胞形態(tài)已與增殖信號(hào)一致改變(例如大小增加)的細(xì)胞生長(zhǎng)。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“共施用”、“與......組合施用”及其語(yǔ)法等價(jià)物包含兩種或更多種試劑對(duì)動(dòng)物的施用，使得兩種試劑和/或其代謝產(chǎn)物同時(shí)存在于動(dòng)物中。共施用包括在分開(kāi)組合物中的同時(shí)施用，在分開(kāi)組合物中在不同時(shí)間的施用，或在其中存在兩種試劑的組合物中的施用。

術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”指本文描述的化合物的量，所述量足以實(shí)現(xiàn)預(yù)期應(yīng)用包括但不限于疾病治療，如下文定義的。治療有效量可取決于預(yù)期應(yīng)用(體外或體內(nèi))、或被治療的受試者和疾病狀況例如受試者的重量和年齡、疾病狀況的嚴(yán)重性、施用方式等等而改變，所述治療有效量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)用于在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)特定應(yīng)答的劑量，所述特定應(yīng)答例如血小板粘附和/或細(xì)胞遷移的減少。取決于所選的特定化合物、待遵循的給藥方案(無(wú)論它是否與其他化合物組合施用)、施用時(shí)機(jī)、它施用于其的組織、以及它在其中攜帶的物理遞送系統(tǒng)，具體劑量將改變。

如本文使用的，“治療”、“處理”或“改善”可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)指用于獲得有益或所需結(jié)果的方法，所述有益或所需結(jié)果包括但不限于治療利益和/或預(yù)防利益。治療利益意指被治療的潛在病癥的根除或改善。另外，治療利益伴隨與潛在病癥相關(guān)的生理學(xué)癥狀中的一種或多種的根除或改善實(shí)現(xiàn)，使得在患者中觀察到改善，盡管患者可能仍患有潛在病癥。對(duì)于預(yù)防利益，組合物可施用于處于發(fā)展特定疾病的危險(xiǎn)中的患者，或報(bào)告疾病的生理學(xué)癥狀中的一種或多種的患者，即使可能仍未作出疾病的診斷。

如該術(shù)語(yǔ)在本文中使用的，“療效”包含如上文所述的治療利益和/或預(yù)防利益。預(yù)防效應(yīng)包括延遲或消除疾病或狀況的出現(xiàn)，延遲或消除疾病或狀況的癥狀的發(fā)作，減慢、停止或逆轉(zhuǎn)疾病或狀況的進(jìn)展，或其任何組合。

術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”指動(dòng)物(例如犬、貓、馬或豬)，例如哺乳動(dòng)物例如人。本文描述的方法可用于人治療學(xué)和獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。在一些實(shí)施例中，患者是哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，患者是人。

“放射療法”意指使用從業(yè)者已知的常規(guī)方法和組合物，使患者暴露于輻射發(fā)射器例如α粒子發(fā)射放射性核素(例如錒和釷放射性核素)，低線性能量轉(zhuǎn)移(LET)輻射發(fā)射器(即β發(fā)射器)，轉(zhuǎn)換電子發(fā)射器(例如鍶-89和釤-153-EDTMP)，或高能輻射包括但不限于x-射線、γ射線和中子。

“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”是在其期間刺激或抑制信號(hào)被傳遞進(jìn)入細(xì)胞且在細(xì)胞內(nèi)，以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答的過(guò)程。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑指調(diào)節(jié)對(duì)相同特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑映射的一種或多種細(xì)胞蛋白質(zhì)的活性的化合物。調(diào)節(jié)劑可增強(qiáng)(激動(dòng)劑)或壓制(拮抗劑)信號(hào)傳導(dǎo)分子的活性。

如應(yīng)用于生物學(xué)活性劑，術(shù)語(yǔ)“選擇性抑制”或“選擇性地抑制”指與脫靶信號(hào)傳導(dǎo)活性相比較，經(jīng)由與靶的直接或間接相互作用，試劑選擇性地減少靶信號(hào)傳導(dǎo)活性的能力。

術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的載體”或“藥學(xué)可接受的賦形劑”包括但不限于任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、一種或多種合適的稀釋劑、填料、鹽、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、濕潤(rùn)劑、控制釋放基質(zhì)、著色劑/調(diào)味料、載體、賦形劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑及其組合。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性成分不相容，否則考慮其在本發(fā)明的治療組合物中的使用。補(bǔ)充性活性成分也可摻入組合物內(nèi)。

在其他實(shí)施例中，如體外激酶測(cè)定中測(cè)量的，本發(fā)明的化合物以約100nM或更少、約50nM或更少、約10nM或更少、約5nM或更少、約100pM或更少、約10pM或更少、或約1pM或更少的IC₅₀值選擇性地抑制I型或I類(lèi)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)的一個(gè)或多個(gè)成員。

在另外一個(gè)方面，選擇性地抑制I型PI3激酶的一個(gè)或多個(gè)成員的抑制劑，或選擇性地抑制一個(gè)或多個(gè)I型PI3激酶介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制劑，可替代地可理解為指就給定I型PI3激酶而言顯示出50％抑制濃度(IC₅₀)的化合物，所述IC₅₀是就其他I型PI3激酶的剩余部分而言的抑制劑的IC₅₀的至少10倍低、至少20倍低、至少50倍低、至少100倍低、或至少1000倍低。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“雙重PI3激酶δ/γ抑制劑”和“雙重PI3激酶δ/γ選擇性抑制劑”指比PI3K家族的其他同工酶更有效地抑制PI3激酶δ和γ同工酶兩者的活性的化合物。雙重PI3激酶δ/γ抑制劑因此對(duì)于PI3激酶δ和γ比常規(guī)PI3K抑制劑(例如其為非選擇性PI3K抑制劑的CAL-130、渥曼青霉素和LY294002)更選擇性。

PI3激酶δ和γ的抑制可能在各種狀況的治療中具有治療利益，所述各種狀況例如特征在于炎癥應(yīng)答的狀況，包括但不限于自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病和關(guān)節(jié)炎疾病。重要的是，PI3激酶δ和γ功能的抑制看起來(lái)不影響生物學(xué)功能例如活力和能育性。

如本文使用的，“炎癥應(yīng)答”的特征在于發(fā)紅、熱、腫脹和疼痛(即炎癥)，并且通常涉及組織損傷或破壞。炎癥應(yīng)答通常為通過(guò)組織的損傷或破壞引發(fā)的局限性、保護(hù)性應(yīng)答，所述保護(hù)性應(yīng)答作用于破壞、稀釋或隔開(kāi)(隔離)有害劑和受傷組織兩者。炎癥應(yīng)答與白細(xì)胞的流入和/或白細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞)趨化性顯著相關(guān)。炎癥應(yīng)答可起因于由致病性生物和病毒的感染，非傳染性方式例如在心肌梗死或中風(fēng)后的創(chuàng)傷或再灌注、對(duì)外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答和自身免疫疾病。順應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法和化合物的治療的炎癥應(yīng)答包含與特異性防御系統(tǒng)的反應(yīng)相關(guān)的狀況，以及與非特異性防御系統(tǒng)的反應(yīng)相關(guān)的狀況。

本發(fā)明的治療方法包括用于改善與炎癥細(xì)胞活化相關(guān)的狀況的方法。“炎癥細(xì)胞活化”指通過(guò)增殖性細(xì)胞應(yīng)答的刺激(包括但不限于細(xì)胞因子、抗原或自身抗體)的誘導(dǎo)、可溶性介質(zhì)(包括但不限于細(xì)胞因子、氧自由基、酶、前列腺素類(lèi)或血管活性胺)的產(chǎn)生、或炎癥細(xì)胞(包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞(多形核白細(xì)胞包括嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)、肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)中新的或增加數(shù)目的介質(zhì)(包括但不限于主要組織相容性抗原或細(xì)胞粘附分子)的細(xì)胞表面表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解在這些細(xì)胞中的這些表型之一或組合的活化可促成炎癥狀況的起始、持續(xù)或惡化。

如本文使用的，“自身免疫疾病”指其中組織損傷與體液或細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)機(jī)體自身組成成分的應(yīng)答的任何病癥組。

如本文使用的，“移植排斥”指針對(duì)移植組織(包括器官或細(xì)胞(例如骨髓)，特征在于移植和周?chē)M織的功能喪失、疼痛、腫脹、白細(xì)胞增多癥和血小板減少癥)的任何免疫應(yīng)答。

如本文使用的，“過(guò)敏性疾病”指起因于過(guò)敏反應(yīng)的任何癥狀、組織損害、或組織功能的喪失。

如本文使用的，“關(guān)節(jié)炎疾病”指特征在于可歸于各種病因?qū)W的關(guān)節(jié)炎性病變的任何疾病。

如本文使用的，“皮肌炎”指特征在于可歸于各種病因?qū)W的皮膚炎癥的皮膚疾病大家族中的任一種。

如先前描述的，術(shù)語(yǔ)“雙重PI3激酶δ/γ選擇性抑制劑”一般指比PI3K家族的其他同工酶更有效地抑制PI3激酶δ和γ同工酶的活性的化合物。化合物作為酶活性(或其他生物活性)的抑制劑的相對(duì)功效可通過(guò)下述進(jìn)行確定：測(cè)定在其下每種化合物抑制活性至預(yù)定程度的濃度且隨后比較結(jié)果。通常，優(yōu)選組合是在生物化學(xué)測(cè)定中抑制50％活性的濃度，即50％抑制濃度或″IC₅₀″。IC₅₀測(cè)定可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)完成。一般而言，IC₅₀可通過(guò)測(cè)量在處于研究下的抑制劑的濃度范圍的存在下給定酶的活性進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)獲得的酶活性的值隨后針對(duì)使用的抑制劑濃度進(jìn)行標(biāo)繪。顯示50％酶活性(與在不存在任何抑制劑的情況下的活性相比較)的抑制劑濃度視為IC₅₀值。類(lèi)似地，其他抑制濃度可通過(guò)活性的適當(dāng)測(cè)定進(jìn)行定義。例如，在一些設(shè)置下，可期望確定90％抑制濃度，即IC₉₀等。

相應(yīng)地，雙重PI3激酶δ/γ選擇性抑制劑可替代地可理解為指就PI3激酶δ和γ而言顯示出50％抑制濃度(IC₅₀)的化合物，所述IC₅₀是就其他I類(lèi)PI3K家族成員中的任一種或全部而言的IC₅₀值至少10倍低、至少20倍低、或至少30倍低。在本發(fā)明的一個(gè)替代實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)雙重PI3激酶δ/γ選擇性抑制劑可理解為指就PI3激酶δ和γ而言顯示出IC₅₀的化合物，所述IC₅₀是就其他PI3K I類(lèi)家族成員中的任一種或全部而言的IC₅₀至少30倍低、至少50倍低、至少100倍低、至少200倍低、或至少500倍低。雙重PI3激酶δ/γ選擇性抑制劑通常以這樣的量施用，使得它選擇性地抑制PI3激酶δ和γ活性?xún)烧撸缟纤觥?/p>

在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物顯示出幾乎相等(～1∶1)或以1∶5的最大比的PI3激酶δ和γ抑制，即本發(fā)明的化合物對(duì)于PI3激酶δ和γ酶兩者顯示出幾乎相等的IC₅₀值，或兩者之間的至多3至8倍差異。

本發(fā)明的方法可應(yīng)用于體內(nèi)或離體細(xì)胞群體。“在體內(nèi)”意指在活個(gè)體內(nèi)，如在動(dòng)物或人內(nèi)或者受試者體內(nèi)。在這個(gè)背景下，本發(fā)明的方法可在個(gè)體中治療或預(yù)防使用。“離體”或“在體外”意指活個(gè)體的外部。離體細(xì)胞群體的例子包括體外細(xì)胞培養(yǎng)和生物樣品，包括但不限于得自個(gè)體的流體或組織樣品。此類(lèi)樣品可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得。示例性生物學(xué)流體樣品包括血液、腦脊髓液、尿和唾液。示例性組織樣品包括腫瘤及其活組織檢查。在這個(gè)背景下，本發(fā)明可用于各種目的，包括治療和實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹＠纾景l(fā)明可離體或在體外用于測(cè)定PI3激酶δ選擇性抑制劑對(duì)于給定適應(yīng)癥、細(xì)胞類(lèi)型、個(gè)體及其他參數(shù)的最佳施用時(shí)間表和/或給藥。由此類(lèi)使用收集的信息可用于實(shí)驗(yàn)或診斷目的或者用于臨床中，以設(shè)置用于體內(nèi)治療的方案。本發(fā)明可能適合于其的其他離體用途在下文描述或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。

本發(fā)明的化合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備，所述方法例如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 2011/055215、WO 2012/151525和WO 2013/164801中所述的那些，所述國(guó)際公開(kāi)號(hào)各自以引用的方式在此全文并入。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種化合物和一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明的一種或多種化合物。藥物組合物可包括如本文描述的一種或多種另外的活性成分。

藥學(xué)載體和/或賦形劑可選自例如稀釋劑、填料、鹽、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、濕潤(rùn)劑、控制釋放基質(zhì)、著色劑、調(diào)味料、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑及其組合。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文描述的藥物組合物含有約0.1mg至約1,000mg，例如約1mg至約1,000mg、約20mg至約800mg、約50mg至約600mg、或約50mg至約600mg的本發(fā)明的一種或多種化合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文描述的藥物組合物含有約100mg至約400mg的本發(fā)明的一種或多種化合物。

本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)或與一種或多種其他活性劑組合施用。需要時(shí)，主題化合物及其他試劑可混合到制劑內(nèi)，或兩種組分可配制成分開(kāi)的制劑，以分開(kāi)或同時(shí)組合使用它們。

本發(fā)明的化合物和藥物組合物可通過(guò)任何途徑進(jìn)行施用，所述任何途徑允許化合物遞送至作用部位，例如經(jīng)口、鼻內(nèi)、局部(例如經(jīng)皮)、十二指腸內(nèi)、腸胃外(包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)或者通過(guò)注射或輸注)、皮內(nèi)、通過(guò)乳房?jī)?nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)(例如氣霧化藥物)或皮下(包括用于長(zhǎng)期釋放的貯庫(kù)施用，例如嵌入脾囊下、腦或角膜中)、舌下、肛門(mén)、直腸、陰道或通過(guò)手術(shù)植入(例如嵌入脾囊下、腦或角膜中)。

組合物可以固體、半固體、液體或氣體形式施用，或可在干粉中，例如凍干形式。藥物組合物可以對(duì)于遞送方便的方式進(jìn)行包裝，包括例如固體劑型例如膠囊、小藥囊、扁囊劑、明膠、紙、片劑、栓劑、丹劑、丸劑、錠劑和糖錠劑。包裝類(lèi)型一般取決于所需施用途徑。還考慮了可植入的持續(xù)釋放制劑，如經(jīng)皮制劑。

治療方法

待施用的化合物的量取決于被治療的哺乳動(dòng)物、病癥或狀況的嚴(yán)重性、施用速率、化合物的處置和開(kāi)處方醫(yī)生的判斷。然而，有效劑量在單一或分份劑量中約0.001至約100mg/kg體重/天，優(yōu)選約1至約35mg/kg/天的范圍內(nèi)。對(duì)于70kg人，這將總計(jì)達(dá)到約0.05至約7g/天，優(yōu)選約0.05至約2.5g/天。本發(fā)明的化合物的有效量可在單一或多重劑量中施用(例如每天兩次或三次)。

本發(fā)明的化合物可與抗癌劑(例如化學(xué)治療劑)、治療抗體和輻射治療中的一種或多種組合使用。

本發(fā)明的化合物可與其他試劑結(jié)合配制或施用，所述其他試劑作用于減輕炎性狀況例如腦脊髓炎、哮喘以及本文描述的其他疾病的癥狀。這些試劑包括非甾體抗炎藥(NSAID)。

實(shí)例

下文提供的實(shí)例和制劑還示出且例證了本發(fā)明的化合物和制備此類(lèi)化合物的方法。應(yīng)理解本發(fā)明的范圍決不受下述實(shí)例和制劑的范圍限制。在下述實(shí)例中，除非另有說(shuō)明，否則具有單一手性中心的分子作為外消旋混合物存在。除非另有說(shuō)明，否則具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心的那些分子作為非對(duì)映體的外消旋混合物存在。單一對(duì)映體/非對(duì)映體可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得。

本文描述的中間產(chǎn)物可通過(guò)國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 11/055215和WO 12/151525中所述的方法進(jìn)行制備，所述兩個(gè)國(guó)際公開(kāi)號(hào)均以引用的方式在此并入。

中間產(chǎn)物1：N-(5-溴-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺：向5-溴-2-甲氧基苯胺(1.00g，4.94mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中，加入吡啶(0.800ml，9.89mmol)且冷卻至0℃。加入甲磺酰氯(0.40ml，5.19mmol)且攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物用水淬滅，用乙酸乙酯提取，在無(wú)水硫酸鈉上干燥，并且在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物用乙酸乙酯：石油醚進(jìn)行層析，以提供作為淡紅色固體的標(biāo)題化合物(1.20g，87％)。

中間產(chǎn)物2：N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼烷-2-基)苯基)甲基磺酰胺：將乙酸鉀(0.841g，8.57mmol)和雙(戊酰)二硼(1.190g，4.71mmol)加入中間產(chǎn)物1(1.20g，4.28mmol)的二噁烷(17.5ml)溶液中，并且使溶液除氣30分鐘。在氮大氣下加入[1，1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II).CH₂Cl₂(0.104g，0.128mmol)，并且加熱至80℃。在2小時(shí)后，使反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾且濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)用乙酸乙酯：石油醚的柱層析進(jìn)行純化，以提供作為黃色固體的標(biāo)題化合物(1.00g，71％)。¹H-NMR(δppm，CDCl₃，400MHz)：7.91(d，J＝1.2Hz，1H)，7.62(dd，J＝8.1，1.2Hz，1H)，6.92(d，J＝8.1Hz，1H)，6.73(s，1H)，3.91(s，3H)，2.98(s，3H)，1.32(s，12H).

中間產(chǎn)物3：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：向(R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羥乙基)-4H-色烯-4-酮(0.500g，1.64mmol)的THF(5ml)溶液中，加入3-(4-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺(0.564g，1.97mmol)和三苯基膦(0.649g，2.47mmol)，隨后加入偶氮二羧酸二異丙酯(0.50ml，2.47mmol)。((R)-5-氟-3-(3-氟苯基)-2-(1-羥乙基)-4H-色烯-4-酮可如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 2012/0151525中對(duì)于中間產(chǎn)物23、25和26中所述進(jìn)行制備。)。在室溫下4小時(shí)后，使混合物濃縮且通過(guò)用乙酸乙酯：石油醚的柱層析純化殘?jiān)蕴峁┳鳛楹稚腆w的標(biāo)題化合物(0.270g，29％)。¹H-NMR(δppm，DMSO-d6，400MHz)：8.04(s，1H)，7.83(m，1H)，7.63-7.50(m，3H)，7.29(m，2H)，7.06(dt，J＝8.7，2.2Hz，1H)，6.94(m，2H)，6.75(dd，J＝8.1，2.1Hz，1H)，5.95(q，J＝7.0Hz，1H)，4.98(s，2H)，3.81(s，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，3H).

中間產(chǎn)物4：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：(S)-2-(1-(4-氨基-3-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮：向中間產(chǎn)物3(0.260g，0.455mmol)的乙醇(5ml)的溶液中，加入RaneyNi(0.130g)且在20psi下在50℃下氫化24小時(shí)。使反應(yīng)混合物穿過(guò)硅藻土墊且濃縮，以提供作為褐色固體的標(biāo)題化合物(0.150g，60％)。質(zhì)量：540.8(M⁺)。

實(shí)例A

N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

向2-(1-(4-氨基-3-碘代-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮(0.200g，0.366mmol)在DME(2.1ml)和水(0.67ml)中的溶液中，加入中間產(chǎn)物2(0.179g，0.550mmol)和碳酸鈉(0.116g，1.10mmol)，并且使系統(tǒng)除氣30分鐘。(2-(1-(4-氨基-3-碘代-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)乙基)-5-氟-3-(3-氟苯基)-4H-色烯-4-酮可如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 2012/0151525中對(duì)于中間產(chǎn)物23、25和26中所述進(jìn)行制備)。加入雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(0.059g，0.075mmol)，并且在微波輻射下(微波功率＝100W，溫度＝100℃)保持45分鐘。使反應(yīng)混合物硅藻土過(guò)濾，濃縮且用乙酸乙酯提取。有機(jī)層在硫酸鈉上干燥且在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)用甲醇：二氯甲烷的柱層析進(jìn)行純化，以提供作為褐色固體的標(biāo)題化合物(0.080g，35％)。MP：216-218℃。¹H-NMR(δppm，CDCl₃，400MHz)：8.20(s，1H)，7.73(s，1H)，7.53(m，2H)，7.31(m，2H)，7.07-6.73(m，6H)，6.07(q，J＝6.2Hz，1H)，3.98(s，3H)，3.14(s，3H)，2.01(d，J＝6.0Hz，3H)。

實(shí)例A1和A2

方法A

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

和(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

兩種對(duì)映體純的異構(gòu)體通過(guò)在CHIRALPAK AS-H柱(250x 30mm；5μm)上的制備型SFC(超臨界流體)條件由N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(0.500g)分開(kāi)，使用甲醇：CO₂(55∶45)作為以80g/分鐘的流速的移動(dòng)相。

實(shí)例A1(S異構(gòu)體)：褐色固體(0.247g)。對(duì)映體過(guò)量：97.4％。保留時(shí)間：2.14分鐘。質(zhì)量：619.1(M⁺+1)。MP：156-158℃。

實(shí)例A2(R異構(gòu)體)：褐色固體(0.182g)。對(duì)映體過(guò)量：99.3％。保留時(shí)間：3.43分鐘。質(zhì)量：619.1(M⁺+1)。MP：168-171℃。

方法A1

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

和(R)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

兩種對(duì)映體純的異構(gòu)體通過(guò)在CHIRALPAK AS-H柱(250x 20mm；5μm)上的制備型SFC(超臨界流體)條件由N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺(15.0g)分開(kāi)，使用甲醇：CO₂(45∶55)作為以120g/分鐘的流速的移動(dòng)相。

實(shí)例A1(S異構(gòu)體)：對(duì)映體過(guò)量：100％。保留時(shí)間：2.21分鐘。質(zhì)量：619.1(M⁺+1)。MP：175-178℃。比旋光度(C＝1在氯仿中，在25℃下)：[α]_D＝+147.16。

實(shí)例A2(R異構(gòu)體)：對(duì)映體過(guò)量：99.3％。保留時(shí)間：3.72分鐘。質(zhì)量：619.1(M⁺+1)。MP：154-157℃。比旋光度(C＝1在氯仿中，在25℃下)：[α]_D＝-159.54。

方法B

實(shí)例A1

(S)-N-(5-(4-氨基-1-(1-(5-氟-3-(3-氟苯基)-4-氧代-4H-色烯-2-基)乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基)-2-甲氧基苯基)甲基磺酰胺

向冷卻至0℃的中間產(chǎn)物4(0.500g，0.923mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)中，加入吡啶(0.200ml，1.84mmol)且攪拌10分鐘。加入甲磺酰氯(0.100ml，0.923mmol)，攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物用水淬滅，用二氯甲烷提取且在硫酸鈉上干燥。粗產(chǎn)物用甲醇：二氯甲烷進(jìn)行柱層析，以提供作為灰白色固體的標(biāo)題化合物(0.240g，42％)。MP：211-213℃。¹H-NMR(δppm，DMSO-d6，400MHz)：9.15(s，1H)，8.06(s，1H)，7.83(m，1H)，7.49(m，4H)，7.28(m，4H)，7.08(dt，J＝8.6，1.7Hz，1H)，6.92(s，2H)，5.98(q，J＝6.9Hz，1H)，3.88(s，3H)，2.99(s，3H)，1.88(d，J＝7.0Hz，3H)。對(duì)映體過(guò)量：85.4％，如通過(guò)HPLC在chiralpak AS-3R柱上測(cè)定的，富含快速洗脫異構(gòu)體(保留時(shí)間＝7.46分鐘)。

代謝穩(wěn)定性

使用小鼠、大鼠、犬、猴和人肝微粒體，對(duì)化合物A、A1和A2以及WO 2012/151525的實(shí)例128進(jìn)行代謝穩(wěn)定性研究。關(guān)于用小鼠、大鼠和人肝微粒體(全部來(lái)自BD Gentest，USA)的研究方案在下文提供。0.4mg蛋白質(zhì)與2mM NADPH(輔因子)一起在磷酸鹽緩沖液(pH～7.4)中在37℃下預(yù)溫育15分鐘，并且隨后加入1μM測(cè)試項(xiàng)目且一式三份進(jìn)一步溫育60分鐘。反應(yīng)混合物用含有甲醇的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)終止且進(jìn)一步離心，以通過(guò)LC-MS/MS分析在上清液中剩余的測(cè)試項(xiàng)目。剩余的母體化合物百分比與在0分鐘時(shí)終止的相似樣品比較進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果在下表1中提供。

關(guān)于化合物A1的代謝穩(wěn)定性數(shù)據(jù)指示它顯示出優(yōu)良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)概況。

表1

蛋白質(zhì)結(jié)合

下文提供的是用于測(cè)量血漿蛋白質(zhì)結(jié)合的程序(使用平衡透析方法)。將745μL血漿轉(zhuǎn)移到2ml微量離心管內(nèi)。向其中加入5μL化合物A1(150μM)。樣品在臺(tái)面渦流器中混合2分鐘。50μL血漿(n＝2)轉(zhuǎn)移至作為0小時(shí)樣品處理的預(yù)標(biāo)記的1.5mL微量離心管中。

剩余650μL血漿樣品在37℃下在水浴中溫育30分鐘。在30分鐘溫育后，50μL血漿(n＝2)在作為0.5小時(shí)樣品處理的預(yù)標(biāo)記的1.5mL微量離心管中取出。將200μL血漿樣品(n＝2)轉(zhuǎn)移到通過(guò)紅色環(huán)指示的樣品室內(nèi)。將紅色插入物置于基板內(nèi)，并且將350μL緩沖液轉(zhuǎn)移到緩沖液室內(nèi)。板在37℃下以大約100RPM在定軌振蕩器上或以20RPM在上下振蕩器上溫育4小時(shí)。來(lái)自緩沖液和血漿室的50μL透析后樣品轉(zhuǎn)移到預(yù)標(biāo)記的微量離心管內(nèi)。將50μL血漿加入緩沖液樣品中，并且將等體積的緩沖液(KH₂PO₄緩沖液pH 7.4)加入收集的血漿樣品中。加入150μL含有甲醇的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(甲苯磺丁脲250ng/ml)，以沉淀蛋白質(zhì)且釋放化合物。使樣品在臺(tái)面渦流器中渦旋3分鐘，并且以14,000RPM離心5分鐘。對(duì)上清液實(shí)施LC-MS/MS分析。

關(guān)于化合物A1的血漿蛋白質(zhì)結(jié)合數(shù)據(jù)在下表2中提供。

表2

藥物代謝動(dòng)力學(xué)

化合物A1(游離堿)的經(jīng)口生物利用度在大鼠和小鼠中進(jìn)行評(píng)估。關(guān)于大鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的方案在下文提供。

所有動(dòng)物均在給藥前禁食過(guò)夜(12小時(shí))且繼續(xù)直至測(cè)試項(xiàng)目施用后4.0小時(shí)。測(cè)試項(xiàng)目制劑在1％Tween 80和99％培養(yǎng)基(0.5％甲基纖維素，4000cPs，pH 2.2)中進(jìn)行制備。血樣(來(lái)自每只動(dòng)物150μL)由眶竇進(jìn)行收集，且置于含有EDTA二鈉作為抗凝血?jiǎng)┑奈⒘侩x心管內(nèi)。血樣立即用1000g的速度在4℃下離心10分鐘，并且分開(kāi)的血漿樣品在-80℃以下冷凍且貯存直至分析時(shí)。所有制劑中的測(cè)試項(xiàng)目的濃度通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。所有樣品中的測(cè)試項(xiàng)目的血漿濃度通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行分析。藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)(C_max、AUC_0-t、T_max和t_1/2)通過(guò)使用WinNonlin軟件進(jìn)行估計(jì)。關(guān)于大鼠中的化合物A、A1和WO 2012/151525的實(shí)例128以及小鼠中的化合物A1的結(jié)果在表3中提供。

表3

與WO 2012/151525的實(shí)例128相比較，化合物A和A1顯示了優(yōu)良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)概況。例如，與WO 2012/151525的實(shí)例128相比較，化合物A顯示C_max中的～1.5倍增加、AUC_0-t中的～4倍增加、以及t_1/2中的～2.8倍增加。與WO 2012/151525的實(shí)例128相比較，化合物A1顯示C_max中的～16倍增加、AUC_0-t中的48倍增加、以及t_1/2中的～1.6倍增加。

生物測(cè)定

本文描述的化合物的藥理性質(zhì)可通過(guò)如下文例證的多種藥理學(xué)測(cè)定加以證實(shí)。

測(cè)定1：PI3激酶活性的熒光測(cè)定

磷酸肌醇3激酶(PI3K)屬于一類(lèi)脂質(zhì)激酶，所述脂質(zhì)激酶在幾種關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。PI3K能夠使磷酸肌醇的3-羥基位置磷酸化，由此生成涉及下游信號(hào)傳導(dǎo)事件的第二信使。均勻時(shí)間分辨熒光(HTRF)測(cè)定允許檢測(cè)由于磷脂酰肌醇4，5-二磷酸鹽(PIP2)通過(guò)PI3K同種型例如α、β、γ或δ的磷酸化而形成的3，4，5-三磷酸鹽(PIP3)。

關(guān)于α、β、γ或δ的PI3K同種型活性使用PI3K人HTRF^TM Assay Kit(Millipore，Billerica，MA)伴隨修飾進(jìn)行測(cè)定。所有溫育均在室溫下進(jìn)行。將0.5μl 40X抑制劑(在100％DMSO中)或100％DMSO加入384孔白色板(Greiner Bio-One，Monroe，NC)的每個(gè)孔中，所述孔含有連同或不連同酶的14.5μl 1X反應(yīng)緩沖液/PIP2(10mM MgCl₂，5mM DTT，1.38μM PIP2)混合物，隨后為5μl/孔的400μM ATP，且溫育另外30分鐘。反應(yīng)通過(guò)加入5μl/孔的停止溶液(Millipore，Billerica，MA)得到終止。隨后將5μl檢測(cè)混合物(Millipore，Billerica，MA)加入每個(gè)孔中，并且在黑暗中溫育6-18小時(shí)。HRTF比率在微板閱讀器(BMG Labtech.，德國(guó))上在337nm的激發(fā)波長(zhǎng)以及665和615nm的發(fā)射波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)量，伴隨50msec的400msec計(jì)數(shù)延遲的積分時(shí)間。關(guān)于化合物A、A1和A2的結(jié)果顯示于下表4中。關(guān)于化合物A1和WO2012/151525的實(shí)例128的比較數(shù)據(jù)在下表5中提供。

表4

表5

測(cè)定2：在白血病細(xì)胞系中的體外細(xì)胞增殖測(cè)定

使用10％FBS補(bǔ)充培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)抑制測(cè)定。細(xì)胞以5000-20,000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度種植在96孔板中。在24小時(shí)后加入以范圍為0.01至10000nM的濃度的測(cè)試化合物。在0小時(shí)(在測(cè)試化合物添加之前)和測(cè)試化合物添加后72小時(shí)，使用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)染料還原測(cè)試評(píng)價(jià)生長(zhǎng)。吸光度在Fluostar Optima(BMG Labtech，德國(guó))上在450nm的波長(zhǎng)處進(jìn)行讀數(shù)。使用GraphPad Prism分析數(shù)據(jù)，并且相應(yīng)地計(jì)算與對(duì)照相比較由于測(cè)試化合物的抑制百分比。

化合物A1引起T淋巴瘤(MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78和HuT-102)細(xì)胞活力中的減少，其中對(duì)于測(cè)試的劑量范圍GI₅₀值范圍為2.5-12.8μM。另外，化合物A1經(jīng)過(guò)72小時(shí)溫育期不展示任何明顯的細(xì)胞毒性。

測(cè)定3：在白血病細(xì)胞系中的AKT磷酸化的抑制

MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM和Hut-78細(xì)胞與所需濃度的化合物一起溫育48小時(shí)。使細(xì)胞裂解，并且通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定pAKT。使用ImageJ定量條帶且針對(duì)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

化合物A1引起T淋巴瘤(MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM和Hut-78)細(xì)胞系中的pAKT表達(dá)的減少，其中對(duì)于測(cè)試的劑量范圍EC₅₀值范圍為0.02-1.6μM。

測(cè)定4：來(lái)自人全血的嗜堿性粒細(xì)胞中的PI3Kδ和γ信號(hào)傳導(dǎo)的抑制

通過(guò)抗FcεR1或fMLP誘導(dǎo)的CD63表達(dá)的改變體現(xiàn)的嗜堿性粒細(xì)胞中的PI3Kδ和γ信號(hào)傳導(dǎo)是使用試劑盒(Buhlmann Laboratories，瑞士)測(cè)定的有用的藥效學(xué)標(biāo)記物。測(cè)試程序涉及下述步驟：

·通過(guò)將靜脈穿刺管顛倒幾次混合抗凝血樣；

·制備適合于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的新鮮和無(wú)熱原的3.5ml聚丙烯或聚苯乙烯管；

·將49μl患者的全血加入每個(gè)管中；

·將1μl 10％DMSO(本底)或測(cè)試化合物(10％DMSO)加入指定管中，并且輕輕混合。在室溫下溫育15分鐘；

·將50μl刺激緩沖液(本底)或抗FcgRI Ab或fMLP移液到每個(gè)管；

·將100μl刺激緩沖液加入每個(gè)管中；

·輕輕混合。將20μl染色試劑(FITC-CD63和PE-CCR3的1∶1混合物)加入每個(gè)管中；

·輕輕混合，覆蓋管且在37℃下在水浴中溫育15分鐘(由于較不有效的熱轉(zhuǎn)移，使用培養(yǎng)箱將花費(fèi)長(zhǎng)10分鐘的溫育時(shí)間)；

·將2ml預(yù)溫的(18-28℃)裂解試劑加入每個(gè)管中，輕輕混合；

·在18-28℃下溫育5-10分鐘；

·將管以500xg離心5分鐘；

·通過(guò)使用吸墨紙傾析上清液；

·用300-800μl洗滌緩沖液使細(xì)胞團(tuán)塊重懸浮；和

·輕輕渦旋且在相同天內(nèi)在流式細(xì)胞儀上獲得數(shù)據(jù)。

在門(mén)控的嗜堿性粒細(xì)胞群體內(nèi)的CD63陽(yáng)性細(xì)胞百分比在不同處理組中進(jìn)行測(cè)定，并且針對(duì)媒介物對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

化合物A1顯示出關(guān)于FcεR1(PI3K δ)＜30nM的EC₅₀和關(guān)于fMLP(PI3Kγ)＜70nM的IC₅₀(n＝1)。

測(cè)定4A：細(xì)胞活性證實(shí)化合物A1針對(duì)PI3Kδ和PI3Kγ同種型的選擇性

測(cè)定4A1：抗IgM誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖(對(duì)于PI3Kδ選擇性)

該研究的目的是評(píng)價(jià)化合物A1對(duì)抗IgM誘導(dǎo)的人B細(xì)胞增殖的抑制潛力。

鋪平板和處理

·將經(jīng)分離的B細(xì)胞重懸浮至1.0x 10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。將100μl細(xì)胞懸浮液加入96孔板的每個(gè)孔中。維持一式三份。

·加入50μl藥物稀釋物且充分混合。維持DMSO空白對(duì)照和誘導(dǎo)劑空白對(duì)照。

·經(jīng)處理的板在37℃、5％CO₂下溫育30分鐘，并且隨后加入50μl 4X誘導(dǎo)劑且通過(guò)抽吸混合。

·板在37℃、5％CO₂下溫育72小時(shí)。

·吸出培養(yǎng)基，并且加入150μl DMSO以溶解甲晶體。

·吸光度在A₅₆₀和A₆₄₀nm處進(jìn)行讀數(shù)。

數(shù)據(jù)證實(shí)化合物A1對(duì)PI3Kδ介導(dǎo)的人B細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)的抑制潛力。參見(jiàn)例如，Baeker等人，Journal of Immunology，134：3532-3538，1985。

測(cè)定4A2：LPA在3T3成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)AktS473磷酸化(對(duì)于PI3Kβ選擇性)

該研究的目的是測(cè)定化合物A1對(duì)3T3成纖維細(xì)胞中PI3Kβ激酶介導(dǎo)的LPA誘導(dǎo)的AktS473磷酸化的作用。

·3T3細(xì)胞用所需濃度的測(cè)試化合物處理15分鐘。加入1ml 2X LPA，使得最終濃度為5μM且溫育5分鐘。

·棄去培養(yǎng)基且用1ml冰冷的1X PBS洗滌。

·加入250μl細(xì)胞裂解緩沖液且在冰上溫育30分鐘。

·將樣品離心且使上清液維持在-80℃下直至分析時(shí)。

·樣品使用pAKT(S473)作為一抗和抗兔IgG-HRP作為二抗通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。

·條帶的強(qiáng)度使用ImageJ 1.42q(NIH，USA)進(jìn)行測(cè)定，并且針對(duì)肌動(dòng)蛋白(上樣對(duì)照)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism(版本5.02)進(jìn)行標(biāo)繪。

結(jié)果證實(shí)化合物A1超過(guò)PI3K的β同種型的選擇性。參見(jiàn)Albuquerque等人，J.Biol.Chem.，278，39830-39838，2003。

測(cè)定4A3：c5a在RAW 2647巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)AktS473磷酸化(對(duì)于PI3Kγ選擇性)

該研究的目的是測(cè)定化合物A1對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞中PI3Kγ激酶介導(dǎo)的c5a誘導(dǎo)的AktS473磷酸化的作用。

·RAW 264.7細(xì)胞用所需濃度的測(cè)試化合物處理15分鐘。加入1ml 2Xc5a，使得最終濃度為50ng/ml且溫育15分鐘。

·棄去培養(yǎng)基且用1ml冰冷的1X PBS洗滌。

·加入250μl細(xì)胞裂解緩沖液且在冰上溫育30分鐘。

·將樣品離心且使上清液貯存于-80℃下直至分析時(shí)。

·樣品使用pAKT(S473)作為一抗和抗兔IgG-HRP作為二抗通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。

·條帶的強(qiáng)度使用ImageJ 1.42q(NIH，USA)進(jìn)行測(cè)定，并且針對(duì)肌動(dòng)蛋白(上樣對(duì)照)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism(版本5.02)進(jìn)行標(biāo)繪。

pAktS473(PI3Kγ信號(hào)傳導(dǎo)的下游標(biāo)記物)的抑制提示化合物A1在c5a誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中由Akt調(diào)節(jié)的致癌途徑中的作用。參見(jiàn)To等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，182，897-904，2010。

測(cè)定4A4：PDGF存3T3細(xì)胞中誘導(dǎo)Akt磷酸化(對(duì)干PI3K α選擇性)

該研究的目的是測(cè)定化合物A1對(duì)PDGF誘導(dǎo)的3T3成纖維細(xì)胞中PI3Kα激酶介導(dǎo)的AktS473磷酸化的作用。

·3T3細(xì)胞用所需濃度的測(cè)試化合物處理15分鐘。加入1ml 2X PDGF，使得最終濃度為20ng/ml且溫育10分鐘。

·棄去培養(yǎng)基且用1ml冰冷的1X PBS洗滌。

·加入250μl細(xì)胞裂解緩沖液且在冰上溫育30分鐘。

·將樣品離心并且將上清液收集且貯存于-80℃下直至分析時(shí)。

·樣品使用pAKT(S473)作為一抗和抗兔IgG-HRP作為二抗通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。

·條帶的強(qiáng)度使用ImageJ 1.42q(NIH，USA)進(jìn)行測(cè)定，并且針對(duì)肌動(dòng)蛋白(上樣對(duì)照)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism(版本5.02)進(jìn)行標(biāo)繪。

在10μM化合物A1時(shí)未觀察到抑制，證實(shí)化合物A1超過(guò)PI3K的α同種型的選擇性。參見(jiàn)Albuquerque等人，J.Biol.Chem.278，39830-39838，2003。

下表6概括了來(lái)自測(cè)定4A1-4A4的結(jié)果。

表6

測(cè)定5：白血病細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡的抑制

白血病細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡使用原位Caspase 3試劑盒(Millipore，US)如下文概述的進(jìn)行測(cè)定：

·將白血病細(xì)胞以1X10⁶個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植在6孔板中

·加入以所需濃度的測(cè)試化合物/DMSO

·使板在37℃下在5％CO₂培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)

·將細(xì)胞收集在2ml離心管中

·加入1.6μL新鮮制備的5X FLICA試劑且通過(guò)稍微輕彈管混合細(xì)胞

·使管在37℃下在5％CO₂下溫育1小時(shí)

·將2ml 1X洗滌緩沖液加入每個(gè)管中且混合

·使細(xì)胞以＜400x g在室溫下離心5分鐘。

·小心取出且棄去上清液，并且使細(xì)胞團(tuán)塊輕輕渦旋，以破壞任何細(xì)胞間聚集。

·將細(xì)胞團(tuán)塊重懸浮于300ul 1X洗滌緩沖液中

·將100μL每種細(xì)胞懸浮液置于空白微量滴定板的兩個(gè)孔各自?xún)?nèi)。避免產(chǎn)生氣泡。

·使用490nm的激發(fā)波長(zhǎng)和520nm的發(fā)射波長(zhǎng)讀取每個(gè)微孔的吸光度。

·計(jì)算通過(guò)與對(duì)照空白相比較熒光中的增加體現(xiàn)的半胱天冬酶-3活性中的增加百分比。

測(cè)定6A：人PBMC中的細(xì)胞因子測(cè)定

該研究的目的是評(píng)價(jià)化合物A1對(duì)人PBMC中抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放的抑制潛力。

鋪平板和處理

·肝素化的人全血用PBS進(jìn)行1∶1稀釋?zhuān)采w在白細(xì)胞分離培養(yǎng)基上，且以400g離心40分鐘。

·取出血沉棕黃層且用PBS洗滌。

·將0.15*10⁶個(gè)PBMC以100μl/孔在RPMI培養(yǎng)基中鋪平板且溫育2小時(shí)。

·加入50μl在培養(yǎng)基中的3X化合物稀釋物且溫育15分鐘。

·TNFα-用50μl在RPMI中的LPS誘導(dǎo)，使得最終濃度為1μg/ml。在6小時(shí)時(shí)收集上清液。

·IL-2-用50μl在RPMI中的PHA誘導(dǎo)，使得最終濃度為20μg/ml。在24小時(shí)時(shí)收集上清液。

·IL-4-用50μl在RPMI中的PHA誘導(dǎo)，使得最終濃度為20μg/ml。在48小時(shí)時(shí)收集上清液。

·使用來(lái)自eBioscience的試劑盒執(zhí)行ELISA。

·使用GraphPad Prism 5計(jì)算EC₅₀。

EC₅₀值由2-3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。化合物A1分別以7.1、9.5和3.5nM的EC₅₀抑制抗原誘導(dǎo)的TNFα、IL-2和IL-4。

測(cè)定6B：在人或小鼠全血中LPS誘導(dǎo)的CD19或CD45R的抑制

測(cè)定化合物A1對(duì)調(diào)節(jié)人或小鼠B淋巴細(xì)胞的B細(xì)胞受體(BCR)活化的增殖的作用。CD19是存在于在發(fā)育至B細(xì)胞胚細(xì)胞的期間來(lái)自可最早識(shí)別的B譜系細(xì)胞的B細(xì)胞上的蛋白質(zhì)，然而，在成熟為漿細(xì)胞時(shí)喪失。LPS是內(nèi)毒素和環(huán)境微生物的主要組分，經(jīng)由BCR信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)B細(xì)胞具有有力的促有絲分裂活性。

稀釋的人全血用DMSO或所需濃度的化合物A1進(jìn)行處理。樣品在化合物添加后用LPS誘導(dǎo)15分鐘，并且在37℃和5％CO₂下溫育72小時(shí)。對(duì)于CD45和CD19陽(yáng)性的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，并且數(shù)據(jù)表示為總?cè)后w中的CD19陽(yáng)性細(xì)胞百分比。用化合物A1處理導(dǎo)致通過(guò)CD19表達(dá)中的減少體現(xiàn)的，LPS誘導(dǎo)的人全血B細(xì)胞增殖的劑量依賴(lài)性抑制(EC₅₀＝117.7nM)。

類(lèi)似于CD19，CD45R(B220)在其從早期前B階段開(kāi)始的發(fā)育自始至終在小鼠B淋巴細(xì)胞上表達(dá)，并且在終末分化為漿細(xì)胞后下調(diào)。簡(jiǎn)言之，稀釋的小鼠全血用DMSO或所需濃度的化合物A1進(jìn)行處理。樣品在化合物添加后用LPS誘導(dǎo)15分鐘，并且在37℃和5％CO₂下溫育72小時(shí)。對(duì)于CD45和CD45R陽(yáng)性的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定。數(shù)據(jù)表示為總?cè)后w中的CD45R陽(yáng)性細(xì)胞百分比。與CD19+細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)一致，用化合物A1處理導(dǎo)致通過(guò)CD45R表達(dá)中的減少體現(xiàn)的，LPS誘導(dǎo)的小鼠全血B細(xì)胞增殖的劑量依賴(lài)性抑制(EC₅₀＝128.2nM)。

測(cè)定6C：在經(jīng)分離的小鼠脾細(xì)胞中的AKT磷酸化的抑制

PI3K途徑通過(guò)AKT下游調(diào)節(jié)，所述AKT是調(diào)節(jié)幾種致癌過(guò)程例如細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和存活的絲氨酸-蘇氨酸激酶。因?yàn)槠⑹谴罅緽淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的儲(chǔ)庫(kù)，所以LPS誘導(dǎo)的AKT磷酸化的抑制使用經(jīng)分離的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行離體測(cè)定。將細(xì)胞鋪平板且與所需濃度的化合物A1一起溫育15分鐘，隨后與LPS(20μg/mL)一起溫育30分鐘。在誘導(dǎo)后，使細(xì)胞裂解且通過(guò)ELISA使用pAKT^S473捕獲/檢測(cè)抗體對(duì)和抗小鼠HRP二抗測(cè)定pAKT。獲得扣除空白的吸光度值，以計(jì)算測(cè)試樣品中的pAKT的抑制百分此。化合物A1在低濃度時(shí)引起下游標(biāo)記物AKT的磷酸化中的劑量依賴(lài)性減少(EC₅₀＝347.4nM)，由此闡明信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

測(cè)定7：在雌性Wistar大鼠模型中脂多糖誘導(dǎo)的肺嗜中性粒細(xì)胞增多癥

嗜中性粒細(xì)胞的過(guò)多召募和后續(xù)活化很可能對(duì)于氣道和肺中的幾種炎性疾病的發(fā)展和過(guò)程是重要的，所述炎性疾病例如嚴(yán)重哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化和急性呼吸窘迫綜合征。嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)其促成這些疾病的機(jī)制可涉及蛋白水解酶例如嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和游離氧自由基的釋放。當(dāng)釋放時(shí)，這些化合物可引起支氣管收縮、支氣管高反應(yīng)性、分泌過(guò)多、上皮損傷和氣道中的組織重塑。

在隔離期后，將禁食動(dòng)物隨機(jī)化且取決于其體重分成不同組。測(cè)試化合物(化合物A1)制備為在媒介物中的懸浮液，所述媒介物由其中Tween 80作為懸浮劑的0.5％甲基纖維素組成。化合物或媒介物通過(guò)經(jīng)口管飼以10mL/kg的體積施用。雌性Wistar大鼠用氯胺酮進(jìn)行麻醉，并且在化合物施用后一小時(shí)，以1mg/kg的劑量氣管內(nèi)施用LPS溶液。在LPS滴注后6小時(shí)，動(dòng)物在麻醉下放血，并且隨后將氣管插入插管并且肺通過(guò)氣管插管用5ml肝素化PBS(1單位/ml)的等分試樣灌洗四次(總體積20mL)。支氣管肺泡灌洗(BAL)液貯存于2-8℃下，直至測(cè)定總細(xì)胞和差異白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)。將支氣管肺泡液離心(500×g共10分鐘)，并且將所得到的細(xì)胞團(tuán)塊重懸浮于0.5ml肝素化鹽水中。白血細(xì)胞的總數(shù)目通過(guò)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在BAL液或血液中進(jìn)行測(cè)定，并且調(diào)整至1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。手動(dòng)計(jì)算差異細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用Cytospin 3離心一百微升細(xì)胞懸浮液，以制備細(xì)胞涂片。細(xì)胞涂片用血液染色液進(jìn)行染色用于區(qū)分，并且載玻片用顯微鏡進(jìn)行觀察，以根據(jù)其形態(tài)特征鑒定嗜酸性粒細(xì)胞。測(cè)定在細(xì)胞涂片中的300個(gè)白血細(xì)胞中的每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型數(shù)目且表示為百分比。計(jì)算每種BALf或血液中的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目。

化合物A1顯示與對(duì)照組相比較浸潤(rùn)到肺內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞的減少，伴隨在10mg/kg時(shí)的65.29％抑制，提示在炎癥病癥中的治療作用。結(jié)果顯示于圖1中。

測(cè)定8：脂多糖誘導(dǎo)的大鼠空氣袋炎癥模型

雌性Wistar大鼠(175-200g)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)環(huán)境七天。動(dòng)物基于其體重隨機(jī)分布至不同組。動(dòng)物用醚進(jìn)行麻醉，并且皮下空氣袋通過(guò)在肩胛間區(qū)中的皮膚下注射20ml無(wú)菌空氣進(jìn)行制備(第0天)，且在第4天時(shí)用無(wú)菌過(guò)濾空氣的第二次10ml注射維持。在第6天時(shí)，經(jīng)口處理通過(guò)在第6天時(shí)LPS溶液的s.c注射在炎癥誘導(dǎo)之前1小時(shí)開(kāi)始。在無(wú)菌鹽水(100μg/kg)中溶解的5ml LPS溶液體積注射到每個(gè)袋內(nèi)。通過(guò)用5ml無(wú)菌鹽水沖洗袋且抽取4ml流體，在LPS施用后6小時(shí)獲取袋流體的樣品。使用血球計(jì)用顯微鏡測(cè)定袋流體中存在的白細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)用Diff-Quik染色流體涂片的顯微鏡檢查測(cè)定差異細(xì)胞含量。

化合物A1引起嗜中性粒細(xì)胞遷移到大鼠空氣袋內(nèi)的劑量依賴(lài)性減少，具有2.65mg/kg的ED₅₀，提示在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的治療作用。結(jié)果顯示于圖2中。

測(cè)定9：在雄性豚鼠中的卵白蛋白誘導(dǎo)的肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥

在隔離期后，通過(guò)眼眶叢方法從每只個(gè)別動(dòng)物的眶靜脈收集0.3ml血樣，并且在細(xì)胞分析器(ADVIA 2120，Siemens)上進(jìn)行分析。基于其總細(xì)胞計(jì)數(shù)，將豚鼠隨機(jī)化且分成不同組。耳廓用不能拭除的標(biāo)記筆進(jìn)行標(biāo)記用于鑒定。在第0天時(shí)，記錄重量，并且腹膜內(nèi)使用50μg卵白蛋白(OVA)和10mg明礬溶液(1ml)使動(dòng)物致敏。在第7天和第14天時(shí)，重復(fù)上述致敏方案。動(dòng)物就任何病體征或?qū)χ旅舻姆磻?yīng)觀察直至第19天時(shí)，且如果存在的話進(jìn)行記錄。在第19、20和21天時(shí)，在通過(guò)經(jīng)口管飼用測(cè)試化合物處理后，30分鐘后，使動(dòng)物分別暴露于0.5％w/v、0.5％和1％卵白蛋白攻擊。對(duì)照和假組動(dòng)物用0.5％w/v甲基纖維素(媒介物)進(jìn)行處理。假對(duì)照組在第0、7和14天時(shí)用10mg明礬進(jìn)行致敏，并且在第19、20和21天時(shí)，暴露于具有相同霧化率的鹽水溶液(SAL)。在最后一次OVA攻擊后二十小時(shí)，氣道高反應(yīng)性通過(guò)全身體積描記器針對(duì)乙酰甲膽堿攻擊的累積劑量(75、100、125和150μg/ml)進(jìn)行測(cè)量。在測(cè)量氣道應(yīng)答后，收集血樣和BAL液。通過(guò)使用neubuear室在顯微鏡下就總細(xì)胞計(jì)數(shù)分析樣品，并且手動(dòng)完成差異白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

測(cè)定10：鼠哮喘模型

在隔離期后，基于其體重，將小鼠隨機(jī)化且分成四組(n＝7)。尾部用不能拭除的標(biāo)記筆進(jìn)行標(biāo)記用于鑒定。在第0天時(shí)，記錄重量，并且腹膜內(nèi)使用100μg卵白蛋白和10mg明礬溶液(0.2ml)使動(dòng)物致敏。

在第7天和第14天時(shí)，重復(fù)上述致敏方案。動(dòng)物就任何病體征或?qū)χ旅舻姆磻?yīng)觀察直至第24天時(shí)，且如果存在的話進(jìn)行記錄。在第24、25和26天時(shí)，在通過(guò)經(jīng)口管飼用測(cè)試化合物處理后，30分鐘后，使動(dòng)物暴露于10％w/v卵白蛋白攻擊。

對(duì)照和假組動(dòng)物用0.5％w/v甲基纖維素(媒介物)進(jìn)行處理。假對(duì)照組在第0、7和14天時(shí)用10mg明礬進(jìn)行致敏，并且在第24、25和26天時(shí)，暴露于具有相同霧化率的鹽水溶液。

在最后一次OVA攻擊后四十八小時(shí)，氣道高反應(yīng)性通過(guò)全身體積描記器針對(duì)乙酰甲膽堿攻擊的累積劑量(2.5、10、50和100mg/ml)進(jìn)行測(cè)量。在測(cè)量氣道應(yīng)答后，收集血樣和BAL液。通過(guò)使用neubuear室在顯微鏡下就總細(xì)胞計(jì)數(shù)分析樣品，并且手動(dòng)完成差異白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

測(cè)定11：Wistar大鼠中的膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)

雌性wistar大鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)環(huán)境七天，并且基于其體重隨機(jī)分布至不同組。在第0天時(shí)，動(dòng)物通過(guò)在尾基部處遞送的用含有MTB(4mg/mL)的完全弗氏佐劑(IFA)乳化的500μg牛膠原II型的皮內(nèi)注射進(jìn)行處理。在初次免疫接種后第7天時(shí)，動(dòng)物通過(guò)在尾基部處的皮內(nèi)注射，通過(guò)在不完全弗氏佐劑中的300μg CII的加強(qiáng)注射進(jìn)行處理。在踝關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)炎發(fā)作通常在第12和14天之間變得視覺(jué)可見(jiàn)。動(dòng)物從關(guān)節(jié)炎發(fā)作后的第二天用測(cè)試化合物或媒介物(經(jīng)口施用)進(jìn)行處理，并且處理繼續(xù)直至接下來(lái)連續(xù)9天。關(guān)節(jié)炎得分通過(guò)在研究期自始至終定期的關(guān)節(jié)炎癥體征的目視檢查獲取。體重、爪體積和爪厚度的測(cè)量在第0、1、3、5、7、9和10天時(shí)獲取。在十天處理后，在研究結(jié)束時(shí)，血液在尸檢時(shí)抽取且加工為血清或血漿，并且獲取所有關(guān)節(jié)，并且在從每個(gè)關(guān)節(jié)獲取小片組織后，前爪和后爪兩者均在10％福爾馬林中固定用于組織病理學(xué)分析，且貯存于-80℃下用于組織勻漿物中的細(xì)胞因子分析。關(guān)于前爪和后爪的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0＝正常；1＝一個(gè)后爪或前爪關(guān)節(jié)受累或最低限度彌漫性紅斑和腫脹；2＝兩個(gè)后爪或前爪關(guān)節(jié)受累或輕度彌漫性紅斑和腫脹；3＝三個(gè)后爪或前爪關(guān)節(jié)受累或中度彌漫性紅斑和腫脹；4＝明顯彌漫性紅斑和腫脹，或＝四個(gè)指關(guān)節(jié)受累；5＝全爪嚴(yán)重彌漫性紅斑和嚴(yán)重腫脹，無(wú)法屈指。

在大鼠CIA模型中治療給藥的化合物A1證實(shí)在預(yù)防爪(圖3C)和治療爪(圖3D)兩者中觀察到的臨床得分(圖3A和3B)減少中的顯著功效。

在大鼠CIA模型中治療給藥的化合物A1證實(shí)減少后爪的平均爪體積(圖4A和4B)和踝直徑(圖4C和4D)兩者中的顯著功效。

組織學(xué)分析：通過(guò)所有后爪和前爪的組織病理學(xué)觀察到的，在大鼠CIA模型中治療給藥的化合物A1證實(shí)在炎癥抑制(58.3％，參見(jiàn)圖4A)、軟骨(46.51％，參見(jiàn)圖4B)和血管翳(49.18％，參見(jiàn)圖4C)中的顯著功效。

與對(duì)照組動(dòng)物相比較，關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和進(jìn)展在處理組中顯著減少(圖5)。

測(cè)定12：雄性Balb/c小鼠中的急性香煙煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞浸潤(rùn)

動(dòng)物(雄性Balb/c小鼠)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)環(huán)境七天。動(dòng)物隨后基于其體重隨機(jī)分布至不同組。在第1天時(shí)，小鼠通過(guò)經(jīng)口/鼻內(nèi)途徑施用測(cè)試化合物或媒介物，并且在1小時(shí)后，施用測(cè)試化合物的動(dòng)物置于全身暴露箱中。在第1天和第2天時(shí)，小鼠暴露于6根香煙的主流煙氣，在第3天時(shí)暴露于8根香煙的主流煙氣，并且在第4天時(shí)暴露于10根香煙的主流煙氣。對(duì)每根香煙的煙氣的暴露將持續(xù)10分鐘。香煙在前兩分鐘內(nèi)完全燃燒，隨后為用動(dòng)物呼吸機(jī)的空氣流動(dòng)，并且接下來(lái)20分鐘將暴露于新鮮的室內(nèi)空氣。在每第二根香煙后，進(jìn)行暴露于新鮮的室內(nèi)空氣20分鐘的另外休息。對(duì)照動(dòng)物暴露于室內(nèi)空氣室。從第1天到第4天，動(dòng)物通過(guò)經(jīng)口或鼻內(nèi)途徑施用測(cè)試化合物。在第5天時(shí)，在最后一次香煙煙氣(CS)暴露后24小時(shí)，動(dòng)物在麻醉下放血，并且將氣管插入插管并且肺通過(guò)氣管插管用0.5-ml肝素化PBS(1單位/ml)的等分試樣灌洗四次(總體積2mL)。收集的支氣管肺泡(BAL)貯存于2-8℃下，直至測(cè)定總細(xì)胞和差異白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)。將BAL液離心(500×g共10分鐘)，并且將所得到的細(xì)胞團(tuán)塊重懸浮于0.5ml肝素化鹽水中。白血細(xì)胞的總數(shù)目使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在BAL液或血液中進(jìn)行測(cè)定，并且調(diào)整至1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。手動(dòng)計(jì)算差異細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用Cytospin 3離心四十微升細(xì)胞懸浮液，以制備細(xì)胞涂片。細(xì)胞涂片用血液染色液進(jìn)行染色用于區(qū)分，并且用顯微鏡進(jìn)行觀察，以根據(jù)其形態(tài)特征鑒定嗜酸性粒細(xì)胞。測(cè)定在細(xì)胞涂片中的300個(gè)白血細(xì)胞中的每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型數(shù)目且表示為百分比，并且計(jì)算每種BAL液中的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目。

測(cè)定13：Balb/c小鼠模型中的咪喹莫特誘導(dǎo)的斑塊狀銀屑病

咪喹莫特(IMQ)是關(guān)于TLR7和TLR8的配體，最初用于治療非黑素瘤皮膚癌。IMQ對(duì)小鼠剃光的背部皮膚的局部應(yīng)用誘導(dǎo)銀屑病樣皮膚狀況，顯示出人銀屑病病理學(xué)特有特征中的大多數(shù)，包括棘皮癥、角化不全和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和IL23/IL17/IL22途徑的牽涉。動(dòng)物(雄性Balb/c小鼠)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)環(huán)境七天。動(dòng)物基于其體重隨機(jī)分布至不同組。在第0天時(shí)，通過(guò)毛發(fā)去除乳膏的局部應(yīng)用剃光小鼠的背部皮膚。在第1天時(shí)，小鼠通過(guò)經(jīng)口途徑施用測(cè)試化合物或媒介物，并且在1小時(shí)后，接受測(cè)試化合物的小鼠接受在剃光的背部皮膚上的62.5mg商購(gòu)可得的IMQ乳膏(5％；Beselna Cream；Mochida Pharmaceuticals，Tokyo，日本)的局部應(yīng)用。小鼠用咪喹莫特的局部應(yīng)用處理接下來(lái)連續(xù)5天，在測(cè)試化合物或媒介物施用后一小時(shí)。在每天時(shí)的局部應(yīng)用后，允許動(dòng)物在回到其籠之前干燥一小時(shí)。在IMQ乳膏的最后一次應(yīng)用后四小時(shí)，將小鼠殺死且獲得皮膚樣品。使用表盤(pán)厚度計(jì)測(cè)量背部皮膚厚度。在測(cè)量皮膚厚度后，皮膚樣品在10％中性緩沖福爾馬林溶液中固定且在石蠟中包埋。脫石蠟的切片用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色。表皮厚度通過(guò)將每個(gè)切片的五個(gè)獨(dú)立視野的值求平均值進(jìn)行定量。為了評(píng)分背部皮膚的炎癥的嚴(yán)重性，使用基于人臨床銀屑病面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)的客觀評(píng)分系統(tǒng)。紅斑、結(jié)痂和增厚在0至4的量表上獨(dú)立地進(jìn)行評(píng)分：0＝無(wú)；1＝輕微；2＝中度；3＝明顯；和4＝非常明顯。

如圖6A和6B中所示，與對(duì)照組動(dòng)物相比較，化合物A1減少背部皮膚厚度、紅斑和結(jié)痂(如通過(guò)組織病理學(xué)得分顯示的)。

盡管本發(fā)明在本文中已就特定實(shí)施例而言進(jìn)行描述，但應(yīng)理解這些實(shí)施例僅是本發(fā)明的原理和應(yīng)用的舉例說(shuō)明。因此應(yīng)理解可對(duì)舉例說(shuō)明性實(shí)施例作出眾多修飾，并且可設(shè)計(jì)其他排列，而不背離如上所述的本發(fā)明的精神和范圍。預(yù)期所附權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍，并且由此涵蓋在這些權(quán)利要求及其等價(jià)物范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。

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