本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于篩選MdmX抑制劑或測試Mdmx抑制劑的抑制活性的重組蛋白的制備和應用，特別是種用于篩選弱MdmX抑制劑或測試弱Mdmx抑制劑的抑制活性的重組蛋白的制備和應用，更具體涉及一種p53多肽和MdmX氨基端融合蛋白及其類似物的制備及其在篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性中的應用。

背景技術：

p53是一種抑癌蛋白，在細胞周期阻滯、DNA損傷修復及細胞凋亡等生物過程中發揮作用，并已成為重要的腫瘤治療靶點。p53的抑制癌變活性受到細胞內過表達MdmX和Mdm2的抑制，與過半數的癌癥相關。解除MdmX和Mdm2對p53的抑制是開發新型癌癥治療藥物的靶點。

MdmX和Mdm2是p53下游的重要調控基因蛋白，MdmX和Mdm2為同源蛋白，兩者結構高度相似，但抑制p53的機理有所不同。目前Mdm2抑制劑的篩選和設計較為成熟，許多已經進入臨床研究階段，例如nutlin-3a改進型分子RG7112即將進入II期臨床研究(Ray-Coquard I,Blay J Y,Italiano A,et al.Effect of the MDM2antagonist RG7112 on the P53 pathway in patients with MDM2-amplified,well-differentiated or dedifferentiated liposarcoma:an exploratory proof-of-mechanism study[J].The lancet oncology,2012,13(11):1133-1140)。但是，MdmX抑制劑的有效篩選和設計進展緩慢。由于Mdm2抑制劑的抗藥性問題(Lane D P,Cheok C F,Lain S.p53-based cancer therapy[J].Cold Spring Harbor perspectives in biology,2010,2(9):a001222.)，癌細胞中的MdmX會進一步過表達，加劇癌細胞的惡化。因此，尋找MdmX抑制劑，及以MdmX為基礎而設計的MdmX/Mdm2雙抑制劑是治療近半數癌癥的有效藥物。

MdmX的N末端存在p53的結合域，MdmX的p53結合域可以和p53蛋白的轉錄激活結構域結合，形成p53/MdmX復合體，該復合體能夠抑制p53的轉錄活性，但并不介導p53的降解，使p53蛋白失活而誘發腫瘤。

如若一種化合物，能和p53-MdmX復合物競爭性結合，釋放p53的轉錄活性，或以競爭性或不可逆性結合游離的MdmX，則這種化合物可以解除或部分解除MdmX對p53的抑制，使得p53發揮抑癌的作用，因此，這種化合物可視為癌癥的治療或緩解用的藥物。

現有技術中公開了一些通過與p53競爭性結合MdmX而測試MdmX抑制劑的技術方案。

中國專利文獻CN105936646(公開日：2016.09.14)公開了一類迷你蛋白及其應用。所述迷你蛋白以白蛋白結合域的3α螺旋束為骨架蛋白，并且在所述骨架蛋白的三維結構表面、N端、C端中的至少一處引入有陽離子性氨基酸，并經所述陽離子性氨基酸至少連接p53與MDM2/MDMX結合的關鍵氨基酸位點。該迷你蛋白兼具入胞以及與白蛋白、MDM2/MDMX結合的能力，并可良好抑制p53和Mdm2/MdmX之間的相互作用，可用于制備抗癌藥物等，可用于規模化生產和應用。小蛋白與Mdm2/MdmX的結合用的熒光偏振檢測。

中國專利文獻CN103923067(公開日：2014.07.16)公開了一種MdmX/Mdm2的小分子抑制劑，同時還涉及一種MdmX/Mdm2的小分子抑制劑的制備方法，該小分子抑制劑化合物能抑制MdmX蛋白質和p53蛋白的相互作用，也能抑制Mdm2蛋白質和p53蛋白的相互作用，該方法中MdmX抑制劑篩選采用熒光偏振法測定。

在上述檢測MdmX的抑制劑的模型中存在一些不足：

1.p53片段與MdmX片段分別加入測試體系，二者的摩爾比就很難精確地確定，就會帶來較大的系統誤差或隨機誤差。

2.方案中采用熒光素標記p53片段，這就會使每次標記操作中，熒光素分子與p53片段分子的摩爾比不完全一致，就會帶來較大的隨機誤差，就更難于進行精確地定量研究。

3.方案中采用熒光素標記p53片段，而熒光素在可見光下容易分解變性而失去熒光功能，這就要求相應操作避光，光致分解會降低檢測方法的準確性，要求避光會增加操作的難度和實驗成本。

4.由于熒光素的疏水性，降低檢測方法和數據的準確性。

5.p53片段和MdmX需要分別制備，會增加操作的復雜度。

6.盡管MdmX與Mdm2為同源蛋白，兩者三維結構高度相似，但現有Mdm2小分子抑制劑對MdmX的抑制效果甚弱。

7.對于作用力大小明顯不同的MdmX抑制劑均用同一個模型來測試，無法區分強MdmX抑制劑于弱MdmX抑制劑，更重要的是，作用力較弱的MdmX抑制劑可能由于不能有效地競爭性結合p53結構域而沒有檢測到。

技術實現要素：

蛋白質在270～300nm吸收波長范圍內有光吸收現象，這種光吸收性質主要是來自蛋白質中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，所以含有該類氨基酸的蛋白質具有天然熒光性質。當蛋白質中沒有色氨酸時，其最大發射波長約在304nm處，而且其熒光光譜的位置不受大分子構象的影響；當蛋白質中存在色氨酸時，它的熒光發射最大波長與色氨酸所處的疏水環境程度有明顯關系，其熒光最大發射波長在308～355nm范圍內(Vivian,J.T.Callis,P.R.，Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins.HYPERLINK"https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1301402/"Biophys J.2001，80(5):2093–2109)，當色氨酸完全埋藏在疏水腔中時，熒光發射波長在321nm左右，完全暴露于水相時，熒光發射波長在350nm左右。

已經解析的MdmX(23～111序列)與p53(15～29序列)所形成的復合物晶體結構(PDB ID:3DAB,參見文獻：Popowicz G,Czarna A,Holak T.Structure of the human Mdmx protein bound to the p53tumor suppressor transactivation domain[J].Cell Cycle,2008,7(15):2441-3.)表明，p53的轉錄激活區(15～29序列)以α-螺旋形式通過3個關鍵氨基酸(Phe19、Trp23及Leu26)與MdmX的N-端疏水區域相互作用。MdmX上的3個關鍵作用位點連同其鄰近的氨基酸一起組成三個結合口袋，即F19口袋、W23口袋及L26口袋。

在本文將人源MdmX的N-端結構域(23～111序列)對應的結構域稱為p53結合結構域(定義為N-MdmX)，將人源p53的15～29序列稱對應的結構域為MdmX結合結構域(定義為p53p)。

為解決至少上述技術問題，本發明提供一種用于篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白。其核心構思如下文所述。

將p53p與N-MdmX通過一段連接臂氨基酸序列(定義為XX)連接，形成融合蛋白，該融合蛋白中p53p片段的色氨酸Trp23(此處的23代表該色氨酸來源于野生型p53蛋白的第23位，而不代表在融合蛋白中的位置，下同)，既是與N-MdmX結合的關鍵氨基酸，又是內源性熒光探針。(，其熒光發射最大波長將反映p53p片段與N-MdmX的結合能力。由于該色氨酸深埋于N-MdmX結合口袋疏水腔中(Popowicz G,Czarna A,Holak T.Structure of the human Mdmx protein bound to the p53tumor suppressor transactivation domain[J].Cell Cycle,2008,7(15):2441-3.)，其熒光發射最大波長在321nm。當MdmX抑制劑競爭性地與該融合蛋白中的MdmX部分的p53結合結構域相結合后，部分或全部p53p將與N-MdmX分離開，此時色氨酸Trp23完全暴露于水相，在321nm處的熒光信號強度將隨抑制劑濃度增大而發生顯著變化，并存在一定的數學關聯性，同時熒光發射波長也向350nm方向紅移。

因此，在添加待測MdmX抑制劑前后測量融合蛋白體系中321nm發射光的強度變化，就可計算出MdmX抑制劑對MdmX的抑制活性/抑制程度的大小，進而，該融合蛋白起到了篩選MdmX抑制劑的作用或測試MdmX抑制劑的抑制活性的作用。

對照現有技術，該融合蛋白至少具有如下一些優點：

MdmX的p53結合結構域與p53中的MdmX結合結構域由于存在于同一個肽鏈上，它們的摩爾數是相等的，相當于與MdmX抑制劑競爭的p53部分與MdmX的相對含量是固定的，這將減少批次操作間的隨機誤差。這種1：1的模式也能夠更準確的反映篩選的配體與p53p部分競爭性結合MdmX蛋白表面疏水腔的能力。

該融合蛋白不需要標記熒光探針，就不會因為熒光標記的程度不同帶來的誤差。融合蛋白中的色氨酸也不會見光分解，而且色氨酸與融合蛋白的摩爾比是固定不變的，且p53p與MdmX結合的色氨酸處于結合或游離狀態時相對應色氨酸的發射光譜不同。因此，不需要避光設備，而且上述融合蛋白中，游離色氨酸Trp23與游離的p53部分和與MdmX部分結合的MdmX抑制劑(首先假設MdmX抑制劑與MdmX結合的摩爾比是1：1)是等摩爾的，結合的色氨酸Trp23與p53部分與MdmX部分的復合物是等摩爾的，對應的發射光是321nm左右，也就是說加入MdmX抑制劑前后321nm發射光的強度的變化情況與MdmX抑制劑競爭性結合的程度是對應的，相對現有技術，有更小的系統誤差或隨機誤差。

為了實現上述目的，該用于篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白的核心技術方案為：

所述融合蛋白包括測試序列、結合序列和連接臂序列；

所述測試序列為MdmX序列或包含MdmX序列中的p53結合結構域的MdmX片段；

所述結合序列為p53p序列、包含p53序列中的MdmX結合結構域的p53片段或保持與MdmX有結合活性的包含p53序列中的MdmX結合結構域的p53片段的突變體；

所述連接臂序列為一個肽段，所述連接臂的上下游分別與所述測試序列和所述結合序列之一連接；所述連接臂的氨基酸序列不參與所述融合蛋白的二級結構的形成或維持；所述連接臂的長度和柔性足以使所述測試序列的空間結構的任一表面部分與所述結合序列的空間結構的任一表面部分在空間上有機會相接觸。

可選地，所述融合蛋白的上游或下游具有用于蛋白分離和/或純化的標簽序列。

進一步地，由于人源p53(GenBank:AB082923.1)中有四個色氨酸，其中僅有一個色氨酸落入其MdmX結合結構域；人源MdmX基因(GeneBank:AF007111.1)中有七個色氨酸，均未落入p53結合結構域。進一步的技術方案是，將p53的MdmX結構域與MdmX的p53結構域通過連接臂連接，且連接臂中不含有色氨酸。這樣，整個融合蛋白中僅有唯一色氨酸殘基，該色氨酸的熒光光譜隨著色氨酸的環境而變化。具體地就是當p53結合結構域與MdmX結合結構域相結合的時候，融合蛋白中的唯一色氨酸殘基藏在疏水腔中，熒光發射波長在321nm左右。當MdmX抑制劑與MdmX中的p53結合結構域結合后，就將部分或全部融合蛋白中的唯一色氨酸殘基暴露于水相，熒光發射波長在350nm左右。此種情況下，在添加待測MdmX抑制劑前后測量融合蛋白體系中321nm發射光的強度，就避免了不隨MdmX抑制劑結合而變化發光特性的色氨酸對色氨酸發光光譜的影響，也就可以使實驗測試結果更加靈敏。

具體地，為了上述目的，該技術方案為：

該融合蛋白用式p53p-XX-N-MdmX表示，其特征在于，

p53p代表所述結合序列SEQ ID NO.1，具體為：SQETFSDLWKLLPEN；

XX代表所述連接臂序列SEQ ID NO.2，具體為：GSGSSENLYFQ；

N-MdmX代表所述測試序列SEQ ID NO.3，具體為：GSQINQVRPKLPLLKILHAAGAQGEMFTVKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGELLGRQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTLAT；

p53p-XX-N-MdmX融合蛋白中，氨基酸的一級結構表明，其序列中只存在一個色氨酸，且它還是對應于p53多肽和N-MdmX相互作用的關鍵氨基酸，可以根據色氨酸的內源熒光特征，來篩選和p53p-XX-N-MdmX融合蛋白中與p53多肽競爭性結合MdmX的小分子化合物。

為了融合蛋白表達后純化的方便，可在融合蛋白上游融合組氨酸標簽序列，融合了組氨酸標簽的融合蛋白序列可為：

GSSHHHHHHGSSQETFSDLWKLLPENGSGSSENLYFQGSQINQVRPKLPLLKILHAAGAQGEMFTVKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGELLGRQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTLAT

不同的MdmX抑制劑與MdmX的結合能力會有不同，對于結合能力較強的MdmX抑制劑，其可以充分地與p53部分競爭結合MdmX部分。而對于結合能力較弱的MdmX抑制劑，其可能不足以發生可檢測的競爭性結合的程度。因此上述融合蛋白就不能有效地檢測該類MdmX抑制劑。

為了進一步使上述融合蛋白能夠檢測弱結合力的MdmX抑制劑，一種方案是通過突變MdmX結合結構域，使MdmX結合結構域與p53結合結構域之間的結合力變弱，例如將與MdmX結合的p53p關鍵氨基酸之一Phe19或Leu26(該19或26代表相應p53p中氨基酸在野生型中的位置，下同)突變，使MdmX結合結構域與p53結合結構域的結合變弱，以便使結合力更弱的MdmX抑制劑得以與MdmX結合結構域競爭性結合p53結合結構域，使融合蛋白能夠用于篩選結合力較弱的MdmX抑制劑或測試結合力較弱的MdmX抑制劑的抑制活性。利用這兩個弱化的模型可進一步篩選親和力在微摩爾濃度范圍內的小分子化合物。

具體地，該技術方案為：

p53p代表的所述結合序列突變為：SQETASDLWKLLPEN。

p53p代表的所述結合序列突變為：SQETFSDLWKLAPEN。

本發明還提供了一種核苷酸序列，所述核苷酸序列能夠表達如上各個方案所述的用于篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白。

可選地，上述核苷酸序列為SEQ ID NO.04(用于表達p53p-XX-N-MdmX的堿基序列)、SEQ ID NO.05(用于表達p53p^F19A-XX-N-MdmX的堿基序列)或SEQ ID NO.06(用于表達p53p^L26A-XX-N-MdmX的堿基序列)所示的序列。

本發明還提供了一種用于篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白的表達載體，所述表達載體能夠借助宿主表達如上各個方案所述的用于篩選MdmX抑制劑或測試MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白。

可選地，所述載體是pET28a載體，所述宿主是大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明還提供了一種如上各個方案所述的的用于篩選MdmX抑制劑或測試Mdmx抑制劑的抑制活性的融合蛋白在篩選MdmX抑制劑或測試Mdmx抑制劑的抑制活性的用途，其中，所述MdmX抑制劑是能夠與P53競爭性結合MdmX的抑制劑。

更為具體地，nutlin-3a作為一種公認的較強的Mdm2抑制劑，對MdmX也具有一定的抑制作用，nutlin-3a與MdmX和Mdm2的K_d值分別為28μM、0.7μM(Laurie N A,Donovan S L,Shih C S,et al.Inactivation of the p53pathway in retinoblastoma.[J].Nature,2006,444(7115):61-6)。將nutlin-3a作為鑒定p53p-XX-N-MdmX融合蛋白模型有效性的代表性小分子是合理的。

除此之外，用商業可以獲取的32個Mdm2小分子抑制劑對這一模型進行進一步鑒定。

為了實現上述的目的，本發明采用了以下技術措施：

本發明利用分子克隆構建了p53p-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX融合蛋白表達質粒，并利用大腸桿菌工程菌BL21(DE3)表達、純化制備。利用F-7000熒光分光光度計分析nutlin-3a及32個Mdm2抑制劑與p53p-XX-N-MdmX融合蛋白的競爭性結合能力以此來驗證以此模型來篩選抑制劑的可行性與有效性。之后將關鍵氨基酸Phe19和Leu26分別突變為Ala構建了p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX兩個融合蛋白篩選模型，并利用蛋白質變性劑鹽酸胍驗證了突變后融合蛋白的穩定性，結果也證明將關鍵氨基酸突變后p53p與MdmX氨基端的結合能力減弱，之后，通過PerkinElmer的LS45/55型熒光/磷光/發光分光光度計運用三種模型同時篩選nutlin-3a和32個Mdm2抑制劑，篩選結果顯示，改進過的模型對篩選親和力低的抑制劑是更加有效的。

附圖說明

圖1為p53p-XX-N-MdmX融合蛋白三級結構圖。

圖2為p53p-XX-N-MdmX融合蛋白表達質粒構建三步PCR反應條件。

圖3為p53p-XX-N-MdmX融合蛋白純化過程中樣品通過Ni-NTA色譜柱純化后SDS-PAGE膠圖(a)，通過凝膠色譜柱(Supredex 16/60075pg)進一步純化后AKTA圖譜(b)和SDS-PAGE膠圖(c)。

圖4為p53p-XX-N-MdmX融合蛋白在λ_EX為278nm時，λ_EM在290nm～500nm范圍內的熒光光譜曲線(a)和在λ_EM為321nm時，λ_EX在245nm～300nm的激發光光譜曲線(b)。

圖5為nutlin-3a滴定濃度為OD_280nm＝0.1的p53p-XX-N-MdmX融合蛋白時，λ_EX在278nm，隨著nutlin-3a濃度增加，λ_EM為290nm～500nm范圍內的熒光強度變化曲線(a)和λ_EM在321nm處熒光強度峰值趨勢的擬合曲線(b)。

圖6為nutlin-3a對p53p-XX-N-MdmX融合蛋白的競爭性結合模式圖。

圖7為λ_EX在278nm時，nutlin-3a(a)和p53p(b)在λ_EM在290nm～500nm范圍內的熒光發射光譜曲線。

圖8為DMSO(無nutlin-3a)滴定濃度為OD_280nm＝0.1的p53p-XX-N-MdmX融合蛋白時，λ_EX＝278nm時，隨著DMSO濃度增加，λ_EM為290nm～500nm范圍內的熒光強度變化曲線(a)和λ_EM在321nm處熒光強度峰值的擬合曲線(b)。

圖9為以nutlin-3a作為對照，對比nutlin-3a和32個Mdm2小分子抑制劑對p53p-XX-N-MdmX融合蛋白的競爭抑制常數Ki值。

圖10為p53p^F19A-XX-N-MdmX(a)和p53p^L26A-XX-N-MdmX(b)融合蛋白三級結構模擬圖。

圖11為p53p-XX-N-MdmX融合蛋白突變體表達質粒構建三步PCR反應條件。

圖12為p53p^F19A-XX-N-MdmX融合蛋白分子克隆過程中DNA膠圖。

圖13為λ_EX在278nm時，隨著鹽酸胍濃度的增加，p53p-XX-N-MdmX(a)、p53p^F19A-XX-N-MdmX(b)和p53p^L26A-XX-N-MdmX(c)融合蛋白的熒光發射光譜曲線在λ_EM在290nm～500nm的變化趨勢。

圖14為隨著鹽酸胍濃度增加，三種融合蛋白分別在λ_max為321nm、331nm和330nm處熒光強度峰值變化趨勢圖。

圖15為以p53p-XX-N-MdmX融合蛋白為對照，用p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX融合蛋白模型篩選32個Mdm2小分子抑制劑和nutlin-3a來表明突變后融合蛋白對小分子結合能力的變化。

具體實施方式

為了更好的解釋本發明的技術方案，下面結合附圖詳細介紹本發明的各個實施例。以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的固定或限制。若未特別指明，實施例中所用的技術特征可以替換為具有在不背離發明構思前提下等同或相似功能或效果的其他本領域已知的技術特征，本發明的不同模塊的任意組合均落入本發明的保護范圍。

實施例1：p53p-XX-N-MdmX融合蛋白表達質粒構建

以已經公布的p53的MdmX結合結構域p53p與MdmX氨基端的p53結合結構域的晶體結構(PDB ID：3DAB)為基礎(參考Structure of the human Mdmx protein bound to the p53tumor suppressor transactivation domain,Popowicz,G.M.,Czarna,A.,Holak,T.A.(2008)CellCycle 7:2441-2443)，我們建立了以下p53p-XX-N-MdmX融合蛋白模型。

p53p-XX-N-MdmX融合蛋白的氨基酸序列如下所示(除去標簽GSSHHHHHHGS后蛋白質的三級結構運用PymolWin模擬得模擬圖如圖1所示)：

GSSHHHHHHGSSQETFSDLWKLLPENGSGSSENLYFQGSQINQVRPKLPLLKILHAAGAQGEMFTVKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGELLGRQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTLAT

其中，SQETFSDLWKLLPEN來自p53的MdmX結合結構域序列，GSQINQVRPKLPLLKILHAAGAQGEMFTVKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGELLGRQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTLAT來自MdmX的p53結合結構域序列，GSGSSENLYFQ是連接臂氨基酸序列。GSSHHHHHHGS是有助于融合蛋白分離純化的標簽序列,其中兩端的GSS或GS是柔性的氨基酸片段。

為了能夠通過分子克隆構建以上氨基酸序列，根據大腸桿菌BL21(DE3)密碼子偏好性合成了N-MdmX的DNA序列，其核苷酸編碼序列如SEQ ID NO.4所示。

將該核苷酸通過Nco I和EcoR I雙酶切，連接到pET28a質粒(Nco I和EcoR I雙酶切)上，通過分子克隆流程，得到了含有N-MdmX的編碼序列的重組質粒，命名為pET28a-N-MdmX。

為了構建和表達以上融合蛋白，根據已構建的pET28a-N-MdmX質粒，設計了以下引物序列：

Primer1:5'-CAT GCC ATG GGC AGC AGC CAT CAC CAT CAT CAC CAC GGC AGC-3'

Primer2:5'-GTT TCC ACA GAT CGC TAA AGG TTT CCT GGC TGC TGC CGT GGT GAT GAT G-3'

Primer3:5'-TTA GCG ATC TGT GGA AAC TGC TGC CGG AAA ATG GCA GCG GCA GCA GCG A-3'

Primer4:5'-CGG GAT CCC TGA AAA TAC AGG TTT TCG CTG CTG CCG CTG CCA-3'

以設計好的引物按照以下體系進行片段擴增。

PCR體系1:

PCR1反應條件如圖2-a所示；

PCR體系2:

PCR2反應條件如圖2-b所示；

PCR體系3:

PCR3反應條件如圖2-c所示；

PCR3產物試劑盒回收，回收產物用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切，作為插入片段。

PCR回收產物酶切體系：

37℃,3h，酶切產物試劑盒(OMEGA，Plasmid Mini Kit I)回收。

上述三個PCR反應中，PCR1和PCR2反應體系中不需要模版，兩個引物堿基互補配對延伸，形成兩段核苷酸序列，不用回收產物。以PCR1和PCR2產物為模版，進行融合PCR實驗，為PCR3實驗。進而得到了含有組氨酸標簽、p53p和XX融合核苷酸序列，通過酶切后，連接到pET28a-N-MdmX質粒上。

將pET28a-N-MdmX質粒用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切，作為載體。

質粒載體酶切體系：

37℃，3h，酶切產物切膠試劑盒(康為世紀，Gel Extraction Kit)回收。

連接反應按載體DNA與插入片段DNA摩爾比為1:3比例混合，加入與體系相同的高效DNA連接酶(TOYOBO，Ligation high Ver.2)，16℃,連接3h。

將全部連接產物轉入50μl DH5α(top10)大腸桿菌中，冰浴30min，42℃熱激90s后立即放回冰浴，2min，加入200μl LB液體培養基活化，37℃,200rpm振蕩培養1h復蘇后再涂含有卡那霉素的LB固體培養基平板，37℃倒置培養12～16h，觀察菌落生長情況。

有單菌落存在，進行菌液PCR鑒定，條帶正確，提質粒pET28a-p53p-XX-N-MdmX，質粒酶切鑒定，條帶正確，送質粒測序，測序結果正確，保藏菌種待用。

pET28a-p53p-XX-N-MdmX測序結果核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

實施例2：p53p-XX-N-MdmX融合蛋白表達與純化

將pET28a-p53p-XX-N-MdmX質粒化轉入大腸桿菌BL21(DE3)；挑單菌落到2ml LB K⁺(Kanamycin)培養基、37℃、200rpm過夜培養；取500μl菌液轉入50ml LB K⁺培養基、37℃、200rpm培養3h；將50ml菌液全轉入1L LB K⁺培養基、37℃、200rpm培養，直到菌體濃度達到OD_280nm＝0.8左右，加入IPTG(終濃度0.4mM)誘導，約20h收集菌體(收集菌體時離心機參數設置為3500rpm、30min、4℃)。

超聲波細胞破碎機破碎細胞。按照菌體體積：緩沖液體積＝1:5的比例，加入buffeA緩沖液(50mM Na₂HPO₄、200mM NaCl、10mM咪唑、1mM BME(β-巰基乙醇)、pH8.0)，參數設置為：總時間2min；超聲時間2s；間隙時間4s；溫度報警24℃；超聲功率40％(寧波新芝生物科技股份有限公司的JY92-IIN超聲波細胞粉碎機)。重復2～3次，直到菌體破碎完全。將細胞破碎液用50ml離心管分裝平衡，離心，30min、4℃、18000rpm，將上清、沉淀分別收集于試劑瓶(管)中。

將破碎上清通過AKTA pure過Ni-NTA色譜柱(圖3a)和凝膠色譜柱(Supredex 16/60075pg或Superdex 26/60075pg，圖3b,c)，收集純化的蛋白，濃縮，分裝，每支200μl，液氮速凍，凍存于-80℃冰箱中。

實施例3：p53p-XX-N-MdmX融合蛋白模型熒光光譜分析

取一支凍存的200μl的p53p-XX-N-MdmX蛋白，快速解凍，用磷酸鹽緩沖液稀釋蛋白濃度至OD_280nm＝0.1。取400μl至石英比色皿中，在F-7000熒光分光光度計上進行熒光掃描。根據色氨酸的內源熒光特征，取λ_EX為278nm，掃描λ_EM在290nm～500nm范圍內的熒光強度，發現最大熒光強度在321nm(圖4a)。故定λ_EM為321nm，掃描λ_EX為245nm～300nm的熒光激發光譜曲線，結果如圖4b所示，也可知在λ_EX在278nm時，熒光強度最大，故定激發光波長為278nm。

實施例4：利用p53p-XX-N-MdmX融合蛋白熒光法測定nutlin-3a與MdmX親和力

取凍存于-80℃的p53p-XX-N-MdmX蛋白，快速解凍，用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為OD_280nm＝0.1，取400μl至石英比色皿中，在F-7000熒光分光光度計上取λ_EX為278nm，λ_EM在290nm～500nm范圍進行熒光掃描。按照如下表1中nutlin-3a(母液2.5mM，溶于DMSO)濃度梯度進行滴定(每加入一次nutlin-3a都要混合均勻)。

表1 nutlin-3a滴定p53p-XX-N-MdmX融合蛋白濃度梯度

Nutlin-3a對p53p-XX-N-MdmX融合蛋白的競爭性結合模式圖，如圖6所示。

如圖5a所示為不同nutlin-3a濃度對融合蛋白熒光光譜的影響，隨著nutlin-3a滴定濃度的增加，在最大發射波長321nm處的熒光強度發生顯著變化。在圖5b中以nutlin-3a為0μM的熒光強度峰值為標準，隨著nutlin-3a濃度變化，在321nm的熒光強度值變化趨勢圖，對趨勢曲線按照如下公式進行擬合，擬合結果可獲取nutlin-3a對N-MdmX的抑制常數(K_i值，競爭結合解離常數)，擬合結果如圖5b所示。

擬合公式為：f_i＝I/[I+K_i(1+L_T/K_d)](參考Chen Y,Prusoff W H.Relationship between the inhibition constant and the concentration of an inhibitor that cause a 50％inhibition of an enzyme reaction[J].Biochem Pharmacol,1973,22:3099-3108.)；其中，f_i為抑制劑對N-MdmX競爭的部分抑制程度(為熒光變化相對強度，具體單位為百分比，見下具體說明)。I為競爭性抑制中增加的抑制劑濃度(μM)；Ki為競爭性解離常數，即抑制劑與p53p競爭性結合N-MdmX的親和解離常數；L_T為融合蛋白中p53p的濃度(μM)；K_d為解離常數，即p53p與N-MdmX的親和解離常數。

而抑制劑對N-MdmX競爭抑制程度f_i可以通過熒光的衰減值來反映，即f_i＝(A1-y)/(A1-A2)，其中A1為擬合曲線上熒光強度最大值，A2為擬合曲線上熒光強度最小值，y為擬合曲線上的任一點，整合之后的公式為：Y＝A1-X(A1-A2)/[X+Ki(1+L_T/K_d)]。

從圖5a可以明顯的判斷隨著nutlin-3a的濃度增大，圖中存在兩個明顯的峰形波動，λ_EM為321nm和λ_EM為350nm～450nm，其中λ_EM為321nm處的是熒光強度逐漸降低的峰，以上已經清晰地分析，該峰的變化是色氨酸的發射熒光的強度變化。而在350nm～450nm范圍內存在是一個熒光強度逐漸增高的側峰，通過單獨分別對小分子nutlin-3a和p53p(合成的含十五個氨基酸多肽：SQETFSDLWKLLPEN)在磷酸鹽體系(無p53p-XX-N-MdmX,其它條件一致)中熒光強度峰值的驗證，判斷350nm～450nm范圍內處的側峰出現原因是由nutlin-3a本身的熒光引起還是與p53p競爭性結合后p53p游離引起。

與nutlin-3a滴定p53p-XX-N-MdmX相同的測試條件，取λ_EX為278nm，λ_EM為290～500nm，結果如圖7a(nutlin-3a)和7b(p53p)所示。圖7a所示，λ_max為375nm，圖7b所示，λ_max為350nm，可以確定，在熒光發射波長為350nm～450nm處的側峰是隨著nutlin-3a的滴定，nutlin-3a引入的熒光強度，故在本實驗測試和計算結果中是可以忽略不考慮的。

取400μl用磷酸鹽緩沖液稀釋到OD_280nm＝0.1的p53p-XX-N-MdmX蛋白做無nutlin-3a的空白對照實驗，除了無nutlin-3a，其他實驗條件與上述完全一致。實驗結果如圖8a(熒光強度變化)和圖8b(熒光強度峰值隨著濃度變化)所示。

Nutlin-3a滴定結果說明，nutlin-3a和p53p對MdmX的結合位點存在競爭性結合關系，才使得色氨酸在321nm處的發射熒光強度峰值降低明顯。本發明將進一步用32個已知結合能力的小分子化合物作進一步驗證。

實施例5：利用p53p-XX-N-MdmX融合蛋白熒光法和極化熒光法(FP)篩選小分子化合物庫

(1)測試所用抑制劑：

小分子化合物庫包含32個商業可以獲取的Mdm2小分子抑制劑。其結構可參見表2。

表2小分子化合物庫中的化合物結構及其兩種K_i測量結果

(2)p53p-XX-N-MdmX融合蛋白熒光篩選法：

參照nutlin-3a滴定方案(細節參見實施例4)，用磷酸鹽緩沖液將p53p-XX-N-MdmX蛋白稀釋至OD_280nm＝0.1,取400μl置于石英比色皿。將32個小分子每個按照如下表3中濃度梯度滴定(32個小分子母液濃度均是2.5mM，溶于DMSO)。

表3 32個小分子滴定p53p-XX-N-MdmX融合蛋白濃度梯度

滴定后得到的隨著小分子濃度增加，在λ_EM為321nm處熒光強度峰值隨著濃度變化的Ki值(小分子解離常數)按照公式進行線性擬合。具體各個分子的Ki值參見表2第三列。

將32個小分子的擬合Ki值和nutlin-3a的擬合Ki值進行匯總比較，然后比較它們的競爭結合能力和nutlin-3a的對比。對比結果如圖9所示。

(2)p53p和N-MdmX極化熒光(FP)篩選法：

將p53p多肽(15～29位氨基酸)通過熒光素標記(fluorescein-GSGSSQETFSDLWKLLPEN,Flu-p53p)。

將pET28a-N-MdmX質?；D入BL21(DE3)，0.4mM IPTG誘導表達并純化(表達純化方法參照實施例2)，液氮速凍，凍存于-80℃冰箱。

FP實驗的緩沖液為PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；10mM Na₂HPO₄；2mM KH₂PO₄；pH7.4)、0.025％Tween-20；0.5％BSA；pH7.5。

將32個小分子化合物和nutlin-3a以DMSO稀釋為終濃度為2mM。

取3μl以DMSO稀釋的小分子化合物和nutlin-3a，加入47μl的緩沖液稀釋小分子的終濃度為0.12mM。用移液槍取20μl小分子化合物按照標記好的順序置于96孔板，每個小分子做一次重復，共66孔。以未加小分子化合物的同樣條件的DMSO作為對照，準備4孔。

取N-MdmX蛋白快速解凍，14000rpm，10min，4℃，離心。

準備溶液1包含15nM Flu-p53p多肽和OD_280nm＝0.1的N-MdmX蛋白溶液，溶液2包含15nM的Flu-p53p多肽溶液。

將溶液1加入有小分子化合物的66孔和未加小分子化合物的對照孔中其中兩孔(作為陰性對照)，每孔40μl；將溶液2加入對照孔中的2孔中(作為陽性對照)，每孔40μl。

將96孔板200g離心2min，在暗處室溫混合30分鐘。

使用PerkinElmer的EnVision多標記微孔板檢測儀檢測，取激發光為555nm，熒光為632nm檢測。檢測結果分析公式為：抑制率％＝(陰性對照-樣品值)/(陰性對照-陽性對照)(Zhang Q,Lu H.Identification of small molecules affecting p53-MDM2/MDMX interaction by fluorescence polarization[J].p53Protocols,2013:95-111.)，結果如表2第四列所示。

以下是對圖9和表2所反映的結果的分析。以Cpd20、Cpd23、Cpd28、Cpd31為例，這四個化合物是以1，4-苯二氮-2，5-(1H，4H)-二酮為骨架設計的一類化合物(以該骨架設計了一類Mdm2抑制劑，Novel 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as Hdm2antagonists with improved cellular activity)，而通過FP測得的它們與MdmX的Ki值分別為6.32μM、10.33μM、3.58μM、10.63μM，其結果與以p53p-XX-N-MdmX融合蛋白來篩選這四個化合物擬合的K_i值分別為5.90μM、9.79μM、2.07μM、8.29μM基本一致。

以Cpd4和CPd6為例，從圖上可以看出Cpd4和Cpd6的K_i值差別較大，通過FP測得的它們與MdmX的Ki值分別為1.85μM和67.3μM，而通過p53p-XX-N-MdmX融合蛋白的熒光測定法Ki分別為1.49μM和51.73μM，這說明本發明的熒光方法與現有技術中的FP方法所測得的K_i值也是相符的。

表2所示結果的比較說明，以nutlin-3a和32個小分子的滴定實驗結果雖然存在著一定誤差，但用所建立的這種p53p-XX-N-MdmX融合蛋白模型來篩選合適的小分子抑制劑與現有技術中的FP方法所測結果也是基本符合的，說明該融合蛋白篩選系統是有效的。

實施例6：p53p-XX-N-MdmX融合蛋白突變體的質粒構建

p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX是p53p-XX-N-MdmX融合蛋白的突變體模型，它們是在p53p-XX-N-MdmX融合蛋白基礎上分別把p53p肽段上的Phe19突變為Ala19、Leu26突變為Ala26(19和26指相應氨基酸在野生型p53多肽中的位置)。將結合在三個結合口袋的三個關鍵氨基酸殘基中的兩個氨基酸分別進行突變，來分別減弱p53p多肽段和MdmX N端結構域的結合能力，為篩選出結合能力較弱的新型小分子藥物骨架提供基礎。

兩種突變體模型依據p53p-XX-N-MdmX融合蛋白模型建立如下：

p53p^F19A-XX-N-MdmX氨基酸序列如下所示(三級結構運用PymolWin模擬得模擬圖如圖10a所示，未包括GSSHHHHHHGS)：

GSSHHHHHHGSSQETASDLWKLLPENGSGSSENLYFQGSQINQVRPKLPLLKILHAAGAQGEMFTVKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGELLGRQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTLAT

p53p^L26A-XX-N-MdmX氨基酸序列如下所示(三級結構運用PymolWin模擬得模擬圖如圖10b所示，未包括GSSHHHHHHGS)：

GSSHHHHHHGSSQETFSDLWKLAPENGSGSSENLYFQGSQINQVRPKLPLLKILHAAGAQGEMFTVKEVMHYLGQYIMVKQLYDQQEQHMVYCGGDLLGELLGRQSFSVKDPSPLYDMLRKNLVTLAT

為了構建以上融合蛋白模型，根據已有質粒pET28a-p53p-XX-N-MdmX，設計了以下引物序列：

F19A-forward：5’-GGC AGC AGC CAG GAA ACC GCT AGC GAT CTG TGG AAA-3’

F19A-reverse：5’-TTT CCA CAG ATC GCT AGC GGT TTC CTG GCT GCT GCC-3’

L26A-forward:5’-AGC GAT CTG TGG AAA CTG GCG CCG GAA AAT GGC AGC-3’

L26A-reverse:5’-GCT GCC ATT TTC CGG CGC CAG TTT CCA CAG ATC GCT-3’

p53p^F19A-XX-N-MdmX融合蛋白構建：

PCR體系1:

PCR1反應條件如圖11a所示；

DNA膠圖如圖12a所示；

PCR體系2:

PCR2反應條件如圖11b所示；

DNA膠圖如圖12b所示；

PCR體系3:

PCR3反應條件如圖11c所示；

DNA膠圖如圖12c所示；

PCR產物回收，回收產物用Nco I和EcoR I雙酶切，作為插入片段。

這里是融合PCR。PCR1和PCR2獲得兩段核苷酸序列，PCR3是融合PCR，只對單個氨基酸突變。

PCR回收產物酶切體系：

37℃,3h，酶切產物試劑盒回收。

將pET28a-N-MdmX質粒用Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，切膠回收，作為載體。

連接反應按載體DNA與插入片段DNA摩爾比為1：3比例混合，加入與體系相同的高效連接酶(TOYOBO，Ligation high Ver.2)，16℃，連接3h。

將全部連接產物轉入50μl DH5α(top10)大腸桿菌中，冰浴30min，42℃熱激90s后立即放回冰浴，2min，加入200μl LB液體培養基活化，37℃，200rpm振蕩培養1h復蘇后再涂含有卡那霉素的LB固體培養基平板，37℃倒置培養12～16h，觀察菌落生長情況。抽提pET28a-p53p^F19A-XX-N-MdmX質粒，測序，測序結果正確，保藏菌種。

p53p^F19A-XX--N-MdmX與p53p^L26A-XX-N-MdmX的分子克隆過程除PCR過程中引物序列外，其他條件完全一致。

p53p^F19A-XX-N-MdmX的核酸編碼序列如SEQ ID NO.5所示，p53p^L26A-XX-N-MdmX的核酸編碼序列如SEQ ID NO.6所示。

實施例7：p53p^F19A-XX-N-MdmX融合蛋白和p53p^L26A-XX-N-MdmX融合蛋白的表達與純化

將pET28a-p53p^F19A-XX-N-MdmX和pET28a-p53p^L26A-XX-N-MdmX質粒分別化學轉化入大腸桿菌BL21(DE3)；挑單菌落到2ml LB K⁺培養基，37℃、200rpm過夜培養；取500μl菌液轉入50ml LB K⁺培養基，37℃、200rpm培養3h；將50ml菌液全轉入1L LB K⁺培養基，37℃、200rpm培養，直到菌體濃度達到OD₂₈₀＝0.8左右，加入IPTG(終濃度0.4mM)誘導，約20h收菌(菌體收集時離心機參數設置為3500rpm、30min、4℃)。

超聲波細胞破碎機破碎細胞。按照菌體體積：緩沖液體積＝1:5的比例，加入buffeA緩沖液(50mM Na₂HPO₄、200mM NaCl、10mM咪唑、1mM BME、PH 8.0)，參數設置為：總時間2min；超聲時間2s；間隙時間4s；溫度報警24℃；超聲功率40％。重復2～3次(觀察菌體的破碎后的粘稠程度來確定破碎次數)，直到菌體破碎完全。將細胞破碎液用50ml離心管分裝平衡，離心，30min、4℃、18000rpm，將上清、沉淀分別收集于試劑瓶(管)中。

將上清通過AKTA pure過Ni-NTA色譜柱和Gel-filtration(sSupredex 16/60075pg或Superdex 26/60075pg)，收集純化的蛋白，濃縮，分裝，每支200μl，液氮速凍，凍存于-80℃冰箱。

實施例8：驗證p53p-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX三者的穩定性差異性

在室溫下，3～4mol/L鹽酸胍可使可使蛋白質從天然狀態轉變至變性狀態，通常增加變性劑濃度可以提高變性程度，通常6mol/L鹽酸胍可以使蛋白質完全轉變為變性狀態。

相較于p53p-XX-N-MdmX融合蛋白，p53p^F19A-XX-N-MdmX融合蛋白和p53p^L26A-XX-N-MdmX融合蛋白是在p53p-XX-N-MdmX的基礎上分別把p53p多肽段上的Phe19改變為Ala19、Leu26改變為Ala26。將結合在三個結合口袋的三個關鍵氨基酸殘基中的兩個氨基酸分別進行突變，來分別減弱p53p和MdmX N端結構域的結合能力，使融合蛋白的穩定性減弱，以此來篩選競爭結合能力弱的新型骨架結構的小分子抑制劑。

用超純水配制濃度為8M的鹽酸胍溶液100ml。

取4支200μl/支的p53p-XX-N-MdmX(OD₂₈₀＝1.0)，3支200μl/支的p53p^F19A-XX-N-MdmX(OD₂₈₀＝1.38)，2支200μl/支的p53p^L26A-XX-N-MdmX(OD₂₈₀＝2.0)融合蛋白快速解凍，混合，14000rpm，10min，離心。

按照以下表4、表5和表6比例，分別配置不同鹽酸胍濃度下的p53p-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A–XX-N-MdmX融合蛋白溶液。

表4 p53p-XX-N-MdmX融合蛋白在0～4M鹽酸胍濃度下的溶液

表5 p53p^F19A-N-MdmX融合蛋白在0～4M鹽酸胍濃度下的溶液

表6 p53p^L26A–N-MdmX融合蛋白在0～4M鹽酸胍濃度下的溶液

按照鹽酸胍濃度梯度，取400μl樣品到石英比色皿中，將比色皿放入F-7000熒光分光光度計，取λ_EX為278nm，λ_EM取290nm～500nm，根據鹽酸胍濃度變化，p53p-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A–XX-N-MdmX得到熒光強度變化圖如圖13a,b和c所示。

根據熒光強度峰值的變化，將三種融合蛋白的熒光強度峰值隨著鹽酸胍濃度變化的結果整理如圖14所示：

根據圖13a,13b和13c所示，熒光發射波長的峰值分別為p53p-XX-N-MdmX：λ_EM＝321nm、p53p^F19A-XX-N-MdmX：λ_EM＝331nm和p53p^L26A-XX-N-MdmX：λ_EM＝330nm，根據熒光發射波長的峰值可以判斷p53p上的色氨酸結合在N-MdmX的疏水腔中的深淺順序依次為p53p-XX-N-MdmX、p53p^L26A-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XX-N-MdmX，即可以初步判斷融合蛋白的穩定性的強弱依次為：p53p-XX-N-MdmX、p53p^L26A-XX-N-MdmX和p53p^F19A-XX-N-MdmX。

圖14所示，三種融合蛋白的熒光強度峰值隨著蛋白質變性劑鹽酸胍的濃度變化圖可以看出，分析熒光強度峰值IC₅₀發現，熒光強度峰值降低一半時，所需鹽酸胍的濃度大小依次為：p53p-XX-N-MdmX、p53p^L26A-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XX-N-MdmX，即可以更進一步的判斷融合蛋白的穩定性的強弱依次為：p53p-XX-N-MdmX、p53p^L26A-XX-N-MdmX和p53p^F19A-XX-N-MdmX。

結果說明p53p^L26A-XX-N-MdmX和p53p^F19A-XX-N-MdmX比p53p-XX-N-MdmX結構更不穩定，說明前者兩個結構域之間的親和力更弱，進而前者更容易被親和力較弱的MdmX抑制劑所競爭性結合。

這表明用p53p^L26A-XX-N-MdmX和p53p^F19A-XX-N-MdmX作為篩選模型篩選親和力弱的小分子理論上是可行的。

實施例9：用上述32個小分子和nutlin-3a對p53p-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX進行滴定，來驗證結合能力的變化。

融合蛋白快速解凍，14000rpm，10min，離心，棄去因為變性而沉淀的蛋白。

小分子母液濃度10mM，取1μl小分子母液加9μl DMSO稀釋為1mM。

按照小分子的終濃度為10μM，蛋白濃度為OD_280nm＝0.5，將溶液按照這個濃度加入96孔黑色微孔板(以加入相同體積的DMSO作為空白對照)，在4℃冰箱混合2h。用PerkinElmer LS-45/55熒光/磷光/發光分光光度計讀取96孔板熒光數據，先取λ_EX為278nm，p53p-XX-N-MdmXλ_EM為321nm，p53p^F19A-XX-N-MdmXλ_EM為331nm，p53p^L26A-XX-N-MdmXλ_EM為330nm，激發光柵15nm，熒光光柵20nm，閾值(cut off)290nm，可以讀取到激發光為278nm時，三種融合蛋白的熒光強度值。再以λ_EX為278nm，p53p-XX-N-MdmX、p53p^F19A-XXN-MdmX、p53p^L26A-N-MdmXλ_EM為375nm，閾值(cut off)350nm可以分別讀取到激發光為278nm時，三種融合蛋白的熒光強度值。每隔4h測一次，每次重復兩遍。

96孔板最多一次可以同時測試32個抑制劑和nutlin-3a對三種融合蛋白的抑制效果(可做一組平行實驗)。

以p53p-XX-N-MdmX融合蛋白為例，在λ_EM為321nm，截斷波長為290nm時讀取的熒光強度為加入小分子后的熒光強度值，在λ_EM為375nm，截斷波長為350nm時讀取的熒光強度為nutlin-3a(或者其他化合物)所引入的熒光強度值，兩次讀取熒光強度值的差值即為小分子加入后的色氨酸的熒光強度變化值，以加入相同體積的DMSO后的熒光強度值作為空白對照，加入小分子后的色氨酸的熒光強度變化值與空白對照之間的差值即為加入小分子化合物后與p53p競爭性結合引起的色氨酸的游離程度，負值越大，說明色氨酸游離程度越大，即該小分子的結合能力更強，定此差值為縱坐標，如若為正值，則說明色氨酸結合增強，即可能存在著相互作用使N-MdmX結構域更加穩定，p53p和N-MdmX的親和力增強。以小分子編號為橫坐標，本實驗順次為1#-32#以及nutlin-3a，整理結果如圖15所示。

圖15結果表明，對于單個小分子來說p53p-XX-N-MdmX的結果負值小于p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX的負值，這說明同一種小分子在p53p-XX-N-MdmX中競爭p53部分的能力弱于p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX，這說明p53p-XX-N-MdmX中p53結合結構域與MdmX結合結構域的結合強度更大，結果符合本發明的設計目的。

同時，同一種抑制劑分子對p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX中N-MdmX部分的競爭性結合能力更強，意味著p53p^F19A-XX-N-MdmX和p53p^L26A-XX-N-MdmX可以適用于與N-MdmX部分結合力更弱的小分子抑制劑的篩選或測試。這進一步說明結果符合本發明的設計目的。而且圖15中p53p-XX-N-MdmX融合蛋白篩選模型所表現的與32個小分子抑制劑的親和力與圖8所反映的也是基本相吻合的，更進一步的說明了該模型的有效性。

以上各個實施例只是用于進一步說明本發明，并不是用來限制本發明的保護范圍，凡是基于本發明的構思所作出的等同變換及對本發明的各個技術方案顯而易見的改動，均落入本發明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業大學

<120> 一種用于篩選弱MdmX抑制劑或測試弱MdmX抑制劑的抑制活性的融合蛋白

<130> 2016-12-07

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn

1 5 10 15

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Ser Gly Ser Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

1 5 10

<210> 3

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ser Gln Ile Asn Gln Val Arg Pro Lys Leu Pro Leu Leu Lys Ile

1 5 10 15

Leu His Ala Ala Gly Ala Gln Gly Glu Met Phe Thr Val Lys Glu Val

20 25 30

Met His Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Val Lys Gln Leu Tyr Asp Gln

35 40 45

Gln Glu Gln His Met Val Tyr Cys Gly Gly Asp Leu Leu Gly Glu Leu

50 55 60

Leu Gly Arg Gln Ser Phe Ser Val Lys Asp Pro Ser Pro Leu Tyr Asp

65 70 75 80

Met Leu Arg Lys Asn Leu Val Thr Leu Ala Thr

85 90

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcagcagcc atcaccatca tcaccacggc agcagccagg aaacctttag cgatctgtgg 60

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ggcgaaatgt ttaccgtgaa agaagtgatg cattatctgg gccagtatat tatggtgaaa 240

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ctgctgggcc gtcagagctt tagcgtgaaa gatccgagcc cgctgtatga tatgctgcgt 360

aaaaacctgg tgaccctggc gacc 384

<210> 5

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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