本發明涉及一種分離自牛樟芝的化合物、萃取物及其用途，特別是關于將該化合物及萃取物應用于制備治療及預防神經退行性疾病的藥物的用途。

背景技術：

牛樟芝(antrodiacamphorata)，又稱樟芝、牛樟菇或紅樟芝等，屬于非褶菌目(aphyllophorales)、多孔菌科(polyporaceae)的多年生蕈菌類，為臺灣特有種真菌，僅生長于臺灣保育類樹種-牛樟樹(cinnamoumkanehiraihay)的中空腐朽心材內壁上。由于牛樟樹分布數量極為稀少，加上人為的盜伐，使得寄生在其中方能生長的野生牛樟芝數量更形稀少，且由于其子實體生長相當緩慢，生長期亦僅在六月至十月之間，因此價格非常昂貴。

牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三萜類化合物是由三十個碳元素結合成六角形或五角形天然化合物的總稱，牛樟芝所具有的苦味即主要來自三萜類此成分。1995年時，cherng等人發現牛樟芝子實體萃取物中含有三種新的以麥角甾烷(ergostane)為骨架的三萜類化合物：antcina、antcinb與antcinc(cherng,i.h.,andchiang,h.c.1995.threenewtriterpenoidsfromantrodiacinnamomea.j.nat.prod.58:365-371)。chen等人以乙醇萃取樟芝子實體后發現zhankuicacida、zhankuicacidb及zhankuicacidc等三種三萜類化合物(chen,c.h.,andyang,s.w.1995.newsteroidacidsfromantrodiacinnamomea,－afungusparasiticoncinnamomummicranthum.j.nat.prod.58:1655-1661)。此外，chiang等人于1995年也由子實體萃取物中發現另外三種分別為倍半萜內酯(sesquiterpenelactone)與兩種雙酚類衍生物的新三萜類化合物，此即antrocin,4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二氧環(4,7-dimethoxy-5-methy-1,3-benzodioxole)與2,2',5,5'-四甲氧基-3,4,3',4'-雙-亞甲二氧基-6,6'-二甲基聯苯(2,2',5,5'-teramethoxy-3,4,3',4'-bi-methylenedioxy-6,6'-dimethylbiphenyl)(chiang,h.c.,wu,d.p.,cherng,i.w.,andueng,c.h.1995.asesquiterpenelactone,phenylandbiphenylcompoundsfromantrodiacinnamomea.phytochemistry.39:613-616)。到了1996年，cherng等人以同樣分析方法再度發現四種新的三萜類化合物：antcine、antcinf、methylantcinateg、methylantcinateh(cherng,i.h.,wu,d.p.,andchiang,h.c.1996.triteroenoidsfromantrodiacinnamomea.phytochemistry.41:263-267)；而yang等人則發現了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物zhankuicacidd、zhankuicacide，和三種以羊毛甾烷(lanostane)為骨架的新化合物：15α–乙酰-去氫硫色多孔菌酸(15α-acetyl-dehydrosulphurenicacid)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoicacid)與去水硫色多孔菌酸(dehydrasulphurenicacid)(yang,s.w.,shen,y.c.,andchen,c.h.1996.steroidsandtriterpenoidsofantrodiacinnamomea－afungusparasiticoncinnamomummicranthum.phytochemistry.41:1389-1392)。

阿爾茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)為一種神經退化性疾病，會導致腦部萎縮，記憶喪失等癥狀。阿爾茨海默病占了癡呆癥(失智癥)中六到七成的成因，是一種發病進程緩慢、隨著時間不斷惡化的持續性神經功能障礙。在2010年，全球有將近2100萬到3500萬名阿爾茨海默病患者，而歸因于阿爾茨海默病相關的死亡案例，大約有48.6萬例。在已開發國家中，阿爾茨海默病是相當耗費社會財政補助的疾病之一。

目前已知腦部類淀粉蛋白β(amyloid-β，aβ)的堆積，是引起該疾病的主因。aβ會于腦部中沉積造成氧化壓力與發炎反應使神經元受損，最終造成記憶學習能力的障礙。因此抗氧化能力與預防ad具有極高的相關性。pc-12細胞常被用于模擬阿爾茨海默病中aβ傷害神經細胞的一種模式，pc-12神經纖維母細胞在神經生長因子(ngf)的刺激下，能夠分化出類似神經突出的結構，表現類似的生理反應，被廣泛應用于神經方面的研究。

技術實現要素：

本發明的目的在于利用合成的aβ，與類神經細胞pc-12共同培養，模擬阿爾茨海默病中aβ傷害神經細胞，來探討牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)對ad細胞模型的影響。

據此，本發明提供一種牛樟芝化合物用于制備治療及預防神經退行性疾病的藥物的用途，該牛樟芝化合物如式(i)所示：

其中r1為氫或乙酰基，r2為

較佳地，其中該化合物的r1為氫、r2為以式(ii)表示：

較佳地，其中該化合物的r1為乙酰基、r2為以式(iii)表示：

較佳地，其中該化合物的r1為氫、r2為以式(iv)表示：

本發明更提供一種牛樟芝萃取物用于制備治療及預防神經退行性疾病的藥物的用途，其中該萃取物以下列步驟進行萃取而得：取牛樟芝菌絲體、子實體或二者的混合物以10倍量的酒精抽取2次后合并濃縮得到一粗抽物，其中該粗抽物為該牛樟芝萃取物。

較佳地，其中該粗抽物更進一步以二氯甲烷/水(1:1)進行分配萃取法3次，以分為一個二氯甲烷層及一個水層，其中該二氯甲烷層為該牛樟芝萃取物。

附圖說明

圖1a～1e示出了牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)對pc-12細胞生長的影響；

圖2a～2e示出了牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)在體外對ad細胞模型的治療效果；

圖3a～3e示出了牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)在體外對ad細胞模型的預防效果。

具體實施方式

1.材料及方法

1.1實驗藥物

牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)，由蘭亭生物科技有限公司提供，-20℃保存。

牛樟芝成分的萃取

取牛樟芝(antrodiacamphorata)菌絲體、子實體或二者的混合物(1.0kg)以10倍量的酒精抽取2次后，合并濃縮可得粗抽物約230g(anca)，粗抽物以二氯甲烷/水(1:1)進行分配萃取法3次，分為二氯甲烷層約102.6g(anca-d)及水層約127.4g(anca-w)，取二氯甲烷層6.0g以硅膠柱層析法經過正己烷/二氯甲烷(1:4)、二氯甲烷、甲醇/二氯甲烷(5:95)的溶媒分離，分為anca-e-d-1、anca-e-d-2、anca-e-d-3、anca-e-d-4等四層。上述四層的取得分別為：合并正己烷/二氯甲烷(1:4)及二氯甲烷為anca-e-d-1，甲醇/二氯甲烷(5:95)沖提液前半部分為anca-e-d-2，甲醇/二氯甲烷(5:95)沖提液后半部分為anca-e-d-3，最后以甲醇沖提為anca-e-d-4。相關材料及方法可參閱相關期刊文獻：fitoterapiavolume102,april2015,pages115–119。

牛樟芝化合物antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3

牛樟芝化合物antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3為本案發明人自牛樟芝萃取物中所純化而得的三個新穎化合物，其純化方法及結構鑒定已于先前申請案中公開，在此不再重復贅述，僅簡要說明其結構式及其簡單信息，如下：

antrocamollt1為無色的液體產物，經分析該化合物的分子式為c24h38o5，分子量為406，完整中文英名稱為4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5-(9-羥基-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環己烯酮、4-hydroxy-5-[9-hydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl]-2,3-dimethoxy-6-methyl-cyclohex-2-enone，其結構式如式ii所示：

antrocamollt2:為無色的液體產物，經分析該化合物的分子式為c26h40o6；分子量為448，完整中文英名稱為4-乙酰氧基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5-(9-羥基-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環己烯酮、4-acetoxy-5-[9-hydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl]-2,3-dimethoxy-6-methyl-cyclohex-2-enone。其結構式如式iii所示：

antrocamollt3:為無色的液體產物，經分析該化合物的分子式為c24h38o5；分子量為406；，完整中、英名稱分別為(4r,5r,6r)-4-羥基5-[(2e,6e,9e)-11-羥基-3,7,11-三甲基-十二-2,6,9-三烯基]-2,3-二甲氧基-6-甲基-環己-2-烯酮、(4r,5r,6r)-4-hydroxy-5-[(2e,6e,9e)-11-hydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,9-trienyl]-2,3-dimethoxy-6-methylcyclohex-2-enone。其結構式如式iv所示：

以上antrocamollt1、antrocamollt2及antrocamollt3具有相似的主結構，其通式可表示如式i所示：

其中，r1為氫或乙酰基，r2為

關于上述三種牛樟芝化合物的萃取及純化等詳細信息，可參閱本案發明人的先前相關申請案(例如：臺灣發明專利申請號103140521)。由于該等化合物在先前申請案中已陸續揭示了具有多種醫療功效性，在此對以上述萃取物及三種化合物進行相關實驗，檢測其對于神經退行性疾病的影響，研究是否對于阿爾茨海默病等相關神經退行性疾病亦具有醫療潛力。

1.2細胞培養(cellculture)

pc-12神經纖維母細胞，來源于大鼠腎上腺髓質的嗜鉻細胞瘤的細胞系。細胞株(cellline)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心(200031，shanghai，china)。

1.3主要試劑

rpmi1640medium，wisent；fetalbovineserum(fbs)，wisent；heat-inactivatedhorseserum，gibco；penicillin-streptomycin(100x)，beyotime；dimethylsulfoxide(dmso)，sunshinebio；trypsin1:250，sunshinebio；edta2na，sunshinebio；phosphatebufferedsaline(pbs)，beyotime；ngf2.5snativemouseprotein，invitrogen；amyloidβproteinfragment1-40，sigma-aldrich；trifluoroaceticacid99％，tci；cck-8cellviabilityassaykit，beyotime。

1.4主要儀器

forma^tmseries3waterjacketedco2incubator，thermo；msc-advantage^tmclassiibiologicalsafetycabinets，thermo；entris64-1sanalyticalbalance，sartorius；hh-4digitalwaterbath，榮華儀器制造有限公司；sb25-12dtultrasoniccleaning，新藝超聲設備有限公司；mls-3780autoclave，sanyo；dhg-9423aelectricoventhermostatblast，三發科學儀器有限公司；bio-medicalhycd-282ultra-lowtemperaturefreezers，haier；allegrax-15rbenchtopcentrifuge，beckman；eclipsets100invertedroutinemicroscope，nikon；infinitem1000promicroplatereaders，tecan。

2.實驗方法

2.1pc-12神經纖維母細胞株的培養

pc-12神經纖維母細胞以rpmi1640medium(含5％fetalbovineserum、10％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin)，培養于37℃、5％co2的環境下，每周繼代培養兩次。

在本研究中進行的所有實驗之前，pc-12細胞需先在含有小鼠頜下腺神經生長因子(ngf2.5s，100ng/ml)的medium上預培養72hr以誘導分化成神經元樣細胞。

2.2牛樟芝萃取物及化合物在pc-12細胞中ic50滴定實驗

cck-8assay允許采用靈敏的比色測定法在細胞增殖和細胞毒性試驗中進行cellviability的測定。cck-8的檢測靈敏度高于其它四唑鹽，如mtt、xtt、mts或wst-1。高水溶性四唑鹽wst-8被細胞中的脫氫酶還原，從而得到在培養基中可溶的黃色產物(甲臜)，通過細胞中的脫氫酶活性產生的甲臜染料的量與活細胞數成正比。

為了針對ngf誘導的pc-12神經模型優化牛樟芝萃取物(anca，anca-d)及化合物(antrocamollt1，lt2，lt3)的濃度，進行了滴定實驗以測定其在pc-12細胞中的ic50。將5×104個已用ngf處理過的pc-12細胞置于96-well中培養24hr，之后medium更換為含1％fetalbovineserum、2％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin之rpmi1640medium，并加入以梯度稀釋的不同濃度藥物：anca、anca-d(0.064，0.32，1.6，8，40，200μg/ml)，antrocamollt1、lt2、lt3(0.032，0.16，0.8，4，20，100μg/ml)，每個well的dmso濃度不超過0.5％，孵育24hr。處理結束后將cck-8solution加至plate的每個well中，置于incubator孵育4hr，在microplatereadersod450nm處檢測各well甲臜產物的濃度，并且將cellviability表示為相對于相應對照的百分比。

2.2牛樟芝萃取物及化合物對β淀粉樣蛋白誘導pc-12細胞存活檢測

將β-淀粉樣蛋白1-40(aβ1-40)以10mg/ml溶解于0.1％(v/v)的三氟乙酸(tfa)水溶液中，儲存于-20℃作為儲備溶液。試驗前將aβ1-40儲備溶液用pbs稀釋為0.5mg/ml，并于25℃下凝聚48hr。

為了研究anca，anca-d，antrocamollt1、lt2、lt3在體外對阿爾茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)細胞模型的治療效果，將5×104個已用ngf處理過的pc-12細胞置于96-well中培養24hr，之后medium更換為含1％fetalbovineserum、2％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin的rpmi1640medium，并加入10μmaβ1-40稀釋液處理24hr，分別加入anca(5，10，20μg/ml)，anca-d(10，20，40μg/ml)，antrocamollt1、lt2、lt3(25，50，100μg/ml)再培養24hr。以未經過處理的細胞其od值作為control，計算cellviability，既等于藥物對aβ1-40神經細胞毒性的抑制率，以％表示。公式如下：

cellviability(％)＝(sample-blank)/(control-blank)×100％

為了研究anca，anca-d，antrocamollt1、lt2、lt3對ad細胞模型的預防效果，將5×104個已用ngf處理過的pc-12細胞置于96-well中培養24hr，之后medium更換為含1％fetalbovineserum、2％heat-inactivatedhorseserum、2mmglutamine、50u/mlpenicillin、50mg/mlstreptomycin之rpmi1640medium，并預先分別加入anca(5，10，20μg/ml)，anca-d(10，20，40μg/ml)，antrocamollt1、lt2、lt3(25，50，100μg/ml)培養24hr，再加入10μmaβ1-40稀釋液處理24hr，之后進行cellviability測定。

3.實驗結果

3.1牛樟芝萃取物及化合物對pc-12細胞生長的影響

通過進行細胞存活檢測，測得anca、anca-d在pc-12細胞中的ic50分別為22.91、49μg/ml(圖1a～1b)；antrocamollt1、lt2、lt3在pc-12細胞中的ic50分別為178.5、168.5、105.5μg/ml(圖1c～1e)。

3.2牛樟芝萃取物及化合物對β淀粉樣蛋白誘導pc-12生長的影響

anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3在體外對阿爾茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)細胞模型的治療效果，通過細胞存活檢測的結果顯示：anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3均能顯著地抑制由aβ誘導的損傷并且改善其細胞存活率(圖2a～2e)。其中以anca、anca-d的抑制損傷較果最好，其次antrocamollt1、antrocamollt2在100μg/ml、50μg/ml時仍有顯著抑制效果、至25μg/ml時效果較不明顯，而antrocamollt3在在100μg/ml、50μg/ml時仍具有抑制效果，而逐步下降至25μg/ml效果已不明顯。

anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3在體外對阿爾茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)細胞模型的預防效果，通過細胞存活檢測的結果顯示：anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3在防止細胞受到aβ誘導的神經元損傷(或降低其風險)方面顯示出顯著的影響(圖3a～3e)。其中anca、anca-d的預防效果仍舊非常顯著，而antrocamollt1在濃度為100、50、25μg/ml時甚至表現出比anca、anca-d更佳的預防效果，而antrocamollt2、antrocamollt3的效果則較差。各成分所顯示出的效果差異，可能與所涉及的機制不同有關，未來可對于進行進一步研究。然而，至少在本次試驗中已證實anca、anca-d、antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3確實對于阿爾茨海默病(alzheimer'sdisease，ad)細胞模型中因β淀粉樣蛋白所致的傷害具有抑制及預防的明顯功效，故anca、anca-d萃取物及antrocamollt1、antrocamollt2、antrocamollt3化合物實具有治療及預防阿爾茨海默病或其它神經退行性疾病的潛力。

由以上實施例可知，本發明所提供的牛樟芝化合物及其萃取物用于制備治療神經退行性疾病的藥物的用途確具產業上的利用價值，以上的敘述僅為本發明的較佳實施例說明，任何熟悉本領域技術的技術人員均可依據上述的說明而作其它種種的改良，但這些改變仍屬于本發明的精神及以下所界定的權利要求范圍中。