本發明涉及家畜人工授精的改良
技術領域：
，具體涉及一種提高奶牛受胎率的制劑及其制備方法與應用。
背景技術：
：人工授精技術是家畜繁殖中一項效果非常好、非常成熟的專門技術，在推進品種改良、提高和改善畜產品產量和品質方面意義非常重大。奶牛的人工授精技術從20世紀80年代開始在中國廣泛使用,隨后冷凍精液逐漸取代了鮮精授精。近年來隨著規模化、集約化的普及，奶牛的產奶量在逐年增加，但是奶牛的繁殖效率卻在下降。如何提高奶牛輸精后的受胎率進而提高奶牛的繁殖效率,成為繁殖學家研究的熱點。前列腺素(prostaglandin)最早發現存在于人的精液中，主要來自精囊。此后發現從動物體多種組織，如睪丸、子宮、胎盤、及卵巢等均可提取。其主要具有溶解黃體的功能以及促使平滑肌收縮，這對發情、排卵、分娩時子宮的蠕動、產后胎衣排出、精子在生殖道內運行，均有一定的影響。目前，前列腺F2α(PGF2α)及其類似物已有效地用于奶牛的同期發情，持久黃體、黃體囊腫等卵巢疾病的治療。Abdussamad等(2015，ComparisonofvarioussemenextendersandadditionofprostaglandinF2αonpregnancyrateincows)研究表明，冷凍精液中添加1.5mg/mlPGF2α,受胎率可達到56％。發明專利(一種提高母牛受胎率的方法，申請號，201510265568.0)在人工授精前1至2小時，用輸精管吸入0.2mg前列腺素2ml，注射到子宮頸分叉處，可以提高奶牛的受胎率。褪黑素(melatonin)是一種主要由松果體分泌的神經內分泌激素，化學結構為N-乙酰-5-甲氧色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，其在生物鐘、生殖、免疫、抗氧化等方面有重要作用。同時，也有研究表明，褪黑素可以直接參與卵泡的發育與排卵,提高牛卵母細胞成熟率以及胚胎的發育率。發明專利(一種提高奶牛受胎率的制劑及其制備方法與應用，申請號，201510085043.9)10-3～10-1mol/L的褪黑素和濃度為10-6～10-4mol/L的維生素E可以有效提高奶牛受胎率。提高奶牛受胎率的方法和制劑還有很多，但是奶牛受胎率的提升幅度仍然有很大的空間。并且，很多技術操作復雜，需要經過專業訓練，在一定程度上影響了技術的推廣應用。技術實現要素：本發明的目的是提供一種提高奶牛受胎率的制劑及其應用。本發明研究意外發現，在褪黑素與前列腺素的共同作用下胚胎的受胎率得到了進一步的提高，基于此，本發明的技術方案如下：首先，本發明一種提高家畜受胎率的制劑，所述制劑為混合溶液，其有效成分為褪黑素和前列腺素。優選地，所述褪黑素與前列腺素的重量比為：1:6250-625000，更優選，所述褪黑素與前列腺素的重量比為：1:62500。在所述制劑溶液中，所述褪黑素的濃度為優選為4.8-480ng/ml，更優選為48ng/ml。所述前列腺素的濃度優選為2-4mg/ml，更優選為3mg/ml。本領域技術人員應當理解，上述制劑的濃度可以根據商品的需要進行濃縮或稀釋，在使用時制劑可以進行相應稀釋后使用。另外，制劑溶液的溶劑可以是本領域所能接受的任何可用于稀釋精子的溶劑，例如常規精子稀釋液。為方便表述褪黑素和前列腺素的制劑下稱為MP制劑(Melatonin-Prostaglandinagent)。其次，本發明提供一種提高家畜受胎率的方法，其將有效量的褪黑素和前列腺素共同作用待孕家畜。所述的有效量針對不同的家畜劑量會有所差異，例如，對于羊其劑量可以在50-200μL，對于馬劑量可以是100-500μL，對于牛劑量可以是100-500μL。對于作用的方式可以是直接注入，例如將所述的制劑注入到子宮內、子宮壁或其他接近子宮的部位。當然，對于不同物種和不同的方法，劑量可以根據測試的受胎率進行調整。本發明的一種實施方式是將效量的褪黑素和前列腺素同精液混合制成混合液后進行人工授精。優選地，所述混合液中褪黑素的濃度為2.4-240ng/ml，更優選為24ng/ml；優選地，所述前列腺素的濃度為1-2mg/ml，更優選為1.5mg/ml。最后，本發明提供褪黑素和前列腺素在提高家畜受胎率上的應用，以及所述的MP制劑在提高家畜受胎率上的應用。本發明提供的提高奶牛受胎率的MP制劑，是將褪黑素與前列腺素以一定的比例溶解在精液稀釋液中，并與解凍后的冷凍精液混合進行輸精后可以提高奶牛的受胎率。該方法簡單易操作，通過受胎率的提高，進而提高了奶牛的繁殖效率，降低了成本，增加了經濟效益，因此具有良好的應用前景。具體實施方式：以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的前提下，對本發明所作的修飾或者替換，均屬于本發明的范圍。地諾前列腺素購自輝瑞、精液稀釋液都購自Minitueb，褪黑素購自Sigma。實施例1提高奶牛受胎率的MP制劑及其制備方法原料：地諾前列腺素、褪黑素、精液稀釋液制備方法：1)稱取8.16mg褪黑素，溶于1mL的無水乙醇中，用PBS稀釋1000倍，成終濃度8.16ng/μL，備用。2)在0.5mLEP管中，分別加入濃度為5mg/ml的地諾前列腺素102μL,精液稀釋液67μL，褪黑素1μL，共計170μLMP制劑，混勻。MP制劑中褪黑素的濃度為48ng/ml，地諾前列腺素的濃度為3mg/ml。所有操作均在暗室中完成。實施例2提高奶牛受胎率的MP制劑及其制備方法原料：地諾前列腺素、褪黑素、精液稀釋液制備方法：1)稱取81.6mg褪黑素，溶于1mL的無水乙醇中，用PBS稀釋1000倍，成終濃度81.6ng/μL，備用。2)在0.5mLEP管中，分別加入濃度為5mg/ml的地諾前列腺素136μL,精液稀釋液33μL，褪黑素1μL，共計170μLMP制劑，混勻。MP制劑中褪黑素的濃度為480ng/ml，地諾前列腺素的濃度為4mg/ml。所有操作均在暗室中完成。實施例3提高奶牛受胎率的MP制劑及其制備方法原料：地諾前列腺素、褪黑素、精液稀釋液制備方法：1)稱取8.16mg褪黑素，溶于1mL的無水乙醇中，用PBS稀釋10000倍，成終濃度0.816ng/μL，備用。2)在0.5mLEP管中，分別加入濃度為5mg/ml的地諾前列腺素68μL,精液稀釋液101μL，褪黑素1μL，共計170μLMP制劑，混勻。MP制劑中褪黑素的濃度為4.8ng/ml，地諾前列腺素的濃度為2mg/ml。所有操作均在暗室中完成。實施例4精液解凍，與MP制劑混合1)從液氮中取出奶牛0.25mL細管凍精(購自北京奶牛中心的性控凍精)，置于38℃水浴鍋中解凍30秒；2)剪開細管封口，將冷凍精液加入38℃預熱的加有170μLMP制劑的EP管中，混勻，制成混合溶液。混合液中，褪黑素的終濃度為24ng/ml，地諾前列腺素的濃度為1.5mg/ml。另設對照組、褪黑素實驗組和地諾前列腺素實驗組，對照組為精液稀釋液，褪黑素實驗組和地諾前列腺素實驗組分別僅含褪黑素和地諾前列腺素。各組別操作同。具體分組如下：表1各組別精液混合液中褪黑素組和地諾前列腺素的含量組別褪黑素(ng/ml)前列腺素(mg/ml)總體積(μL)對照組00340褪黑素組240340地諾前列腺素組01.5340褪黑素組+地諾前列腺素組241.53403)將混合液全部加入到0.5mL的精液細管中，裝入輸精槍，準備輸精；4)輸精對象的選擇優選15-20月齡、體重達到350公斤以上、發情周期正常的育成母牛，因育成牛生殖機能旺盛、子宮環境好，有利于受胎。5)輸精時間的確定嚴格控制在排卵前的3-5小時輸精，即奶牛接受爬跨后12-14小時進行直腸檢查，卵泡有一觸即破時為最佳輸精時間。并結合外觀觀察，奶牛表現安靜，外陰腫脹開始消失，陰門流出半透明的牽縷性黏液。6)輸精方法嚴格消毒母牛外陰。采用子宮體深部輸精，輸精部位要求在排卵側子宮角深處2-5厘米處，這樣保證有足夠精子到達與卵子授精部位。并且輸精時做到“輕插、慢推、緩出”，以免對母牛的子宮造成損傷。7)早期妊娠診斷配種后28天，采集血液5ml，分離血清，利用愛德士可視早孕檢測試劑盒，檢查奶牛的受胎情況，并統計結果。表2各組別精液混合液輸精后的受胎率處理處理奶牛頭數妊娠頭數受胎率(％)對照組874248.28±2.07a褪黑素組653452.31±1.12b地諾前列腺素組593254.24±1.35b褪黑素組+地諾前列腺素組825668.29±2.60c統計結果顯示：該制劑可顯著提高奶牛配種后的受胎率。結論：由以上結果可知褪黑素和地諾前列腺素聯合使用可以提高奶牛輸精后的受胎率。因此，該組合試劑可應用于奶牛的體外輸精。當前第1頁1 2 3