本發明涉及農業生產技術領域，特別涉及β-谷甾醇的應用及其制劑。
背景技術：
隨著全球極端氣候頻發，水資源分布不均，可利用灌溉水資源減少，干旱對全世界作物產量影響不斷擴大，成為限制植物生長發育最主要的因子之一。上世紀中葉以來，我國農作物干旱受災面積逐年增加。
白三葉(trifoliumrepensl.)為豆科(leguminosae)車軸草屬的一種多年生優良牧草，因其具有產量高、適口性好、牧草品質優良和生物固氮能力強等特點，成為世界各地栽培利用的主要豆科牧草之一，廣泛應用于建植人工混播草地和改良天然草地。同時，由于白三葉匍匐生長特性強、再生速度快和葉型優美等特點，亦被應用于觀賞性草坪，在城鎮綠化、水土保持和生態建設等方面發揮著巨大作用。近年來，白三葉在各地栽培面積不斷擴大。然而，白三葉喜冷涼濕潤氣候，屬冷季型淺根型草種，抗旱耐熱性差，植株生長需要大量的水分，加之其抗蒸騰能力弱，在亞熱帶和溫帶等廣闊區域內，干旱成為限制其生產利用的主要逆境脅迫因子。因此，在白三葉栽培中，急需探尋提高白三葉抗旱性的栽培措施與方法。
農業生產中，通過施用外源植物生長調節劑提高作物抗逆性具有操作簡單、見效快和實用價值高等特點，在蔬菜、水稻和牧草等作物上已得到實際應用，而國內外通過外源添加物提高白三葉抗旱性的相關研究報道較少。研究報道顯示，外源應用植物生長調節物質脫落酸(aba)、水楊酸(sa)、油菜素內酯(br)、抗倒酯(te)、多效唑(pp333)、矮壯素(ccc)等能夠提高植物抗旱性。但這些激素或生長調節劑價格相對較高，且使用效果因植物物種不同而存在差異，若生產中大面積應用則會面臨生產成本高等問題。因此，尋找一種新型、高效、低成本的外源添加物具有重要的實用價值。
β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇類成分之一，屬于四環三帖類化合物，其廣泛存在于自然界中的各種植物油、堅果、種子等中。目前β-谷甾醇以其特有的生物學特性和物理化學性質被廣泛應用到醫藥行業中，研究顯示β-谷甾醇的攝人量多少與人類慢性病的發生率有關，研究表明其具有明顯降低血清膽固醇的功效，可以取代膽固醇作為脂質體膜材。但關于β-谷甾醇在植物抗旱中的作用，目前還未有研究。
技術實現要素：
本發明提供了β-谷甾醇在提高植物抗旱性中的應用。
干旱脅迫又稱水分虧缺脅迫或水分脅迫，通常是指由干旱、缺水引起的對植物正常生理功能的干擾。研究表明，干旱脅迫可抑制植物生長，使植物葉片發生萎蔫，同時伴隨植物發生一系列的生理生化的變化，如電解質滲透率、丙二醛含量、sod活性、pod活性、cat活性和apx活性，降低葉綠色含量。本發明研究發現，根施或葉面噴施β-谷甾醇可有效延遲干旱脅迫下白三葉葉片的萎蔫，緩解由干旱引起的白三葉生長抑制和葉綠素的降解；并顯著降低電解質滲透率和丙二醛的積累，提高sod、pod、cat和apx等酶的活性，從而降低過氧化傷害，最終明顯提高白三葉的抗旱性。因此，本發明提供了β-谷甾醇在植物抗旱中的應用。
在本發明提供的一些具體實施例中，所述植物為白三葉。
作為優選，所述β-谷甾醇的施用方式為葉面噴施或根施；優選地，β-谷甾醇的根施濃度為25～100mg/l；優選地，β-谷甾醇的葉面噴施的濃度為25～50mg/l。
在本發明提供的一些實施例中，進行葉面噴施或根施時，優選將β-谷甾醇溶于100％熱乙醇溶解制成母液，再與溶劑混合后施用。在本發明提供的一個具體實施例中，將β-谷甾醇溶于100％熱乙醇溶解制成0.2g/ml的母液，然后將母液與hoagland營養液混合配制成β-谷甾醇處理溶液對白三葉進行根施處理。在本發明提供的另一具體實施例中，將β-谷甾醇溶于100％熱乙醇溶解制成0.2g/ml的母液，以1％tween-80作為溶劑，配制成β-谷甾醇處理溶液對白三葉進行葉面噴施處理。
本發明還提供了一種抗旱藥物制劑，包括β-谷甾醇和農藥學上可接受的輔料。作為優選，所述β-谷甾醇與所述農藥學上可接受的輔料的重量比為0.01～0.1：1～20。
作為優選，所述農藥學上可接受的輔料選自吐溫-80、吐溫-20、十二烷基苯磺酸鈉、十八烷基磺琥珀酸鈉、聚氧乙烯烷基酚和聚氧乙烯脂肪醇、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基磺酸鹽、烷基萘磺酸鹽中的一種或兩者以上的混合物。但本領域技術人員認可的農藥學上可接受的輔料均在本發明的保護范圍之內，本發明在此不作限定。
在本發明提供的一些實施例中，農藥學上可接受的輔料為吐溫-80。
本發明針對現有技術中大面積外源施用脫落酸(aba)、水楊酸(sa)、油菜素內酯(br)、抗倒酯(te)、多效唑(pp333)、矮壯素(ccc)等外源添加物成本較高、效果因植物物種不同而存在差異等不足，開發了一種新型的提高植物抗旱性的外源添加物—β-谷甾醇。本發明以白三葉為研究對象，發現外源施用β-谷甾醇可有效延遲干旱脅迫下白三葉葉片的萎蔫，緩解由干旱引起的生長抑制，葉綠素的降解和過氧化傷害等，顯著提高白三葉的抗旱性。另外，與其它外源添加物如aba、sa、油菜素內酯等相比，價格便宜，生產成本低，適宜大面積推廣應用。
具體實施方式
本發明公開了β-谷甾醇的應用及其制劑，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例1β-谷甾醇根施濃度的篩選
試驗材料：以廣泛應用的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料
材料培育：先將白三葉種子用0.1％的高錳酸鉀溶液浸種10min消毒，去離子水清洗3次，按1g/m2的播量將種子播種在長20cm，寬15cm，高5cm且裝滿石英砂的塑料盆中，置于光照培養箱中進行發芽(溫度白天/黑夜為23/19℃；時長各為12h；相對濕度為70％；光照強度為700μmolm-2s-1)。待種子萌發7d后用hoagland營養液繼續培養幼苗至30d，選取長勢一致的材料用于后續試驗。
試驗設計：共設置7個β-谷甾醇濃度梯度，分別為：0mg/l(對照，直接干旱脅迫)、5mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l、250mg/l、500mg/l，共計7個處理，每處理設置4次獨立重復。用18％聚乙二醇6000(peg-6000)進行干旱脅迫處理。
外源添加及干旱脅迫處理：將β-谷甾醇用100％熱乙醇溶解(0.2g/ml)，自然冷卻至室溫后作為母液備用。營養液作為溶劑，用β-谷甾醇母液分別配制不同濃度的β-谷甾醇處理溶液，將材料用β-谷甾醇處理溶液預處理6天后，更換為含有18％(w/v)peg-6000的hoagland全營養液進行干旱脅迫處理。處理期間，每3d更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養箱中，條件同材料培育。從更換為含有18％(w/v)peg-6000的處理液時開始計時，調查白三葉葉片萎蔫癥狀和嚴重萎蔫出現的時間，結果見表,。
表1根施不同濃度的β-谷甾醇提高白三葉抗旱性效應
由表1可以看出，根施25～100mg/l的β-谷甾醇時，均能顯著提高白三葉抗旱性，提高白三葉抗寒性的效果較好，與對照相比，在同等干旱脅迫強度下可延遲白三葉葉片萎蔫3-5天。
實施例2葉面噴施β-谷甾醇濃度的篩選
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：將田園土與營養土按1:1的比例混合，并加入殺蟲劑和殺菌劑混合均勻，室外放置3天后備用。采用直徑為20cm、深度為25cm的盆缽種植白三葉，向盆缽中填滿等量的混合土，按1g/m2的播種量播散白三葉種子，覆淺土后澆水。材料放置于溫室中培育3個月，每周每盆澆250mlhoagland全營養液，統一進行施肥、除草、澆水和病蟲害等常規管理。溫室平均溫度為23℃，相對濕度65％，光照時間12h，光照強度為500μmolm-2s-1。待種子萌發7d后用hoagland營養液繼續培養幼苗至30d，選取長勢一致的材料用于后續試驗。
試驗設計：共設置7個β-谷甾醇濃度梯度，分別為：0mg/l(對照，直接干旱脅迫)、5mg/l、10mg/l、15mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l、250mg/l，共計8個處理，每處理設置4次獨立重復。
外源噴施及干旱脅迫處理：將β-谷甾醇用100％熱乙醇充分溶解(0.2g/ml)作為母液備用，用1％tween-80作為溶劑稀釋母液配制不同濃度的β-谷甾醇溶液，對照噴施不含β-谷甾醇的相應溶劑。每次上午9:00進行葉面噴施，噴施量為150ml，連續噴施3次，每次間隔1天。噴施外源添加物期間，正常澆水，處理完畢后，所有材料停止澆水，置于溫室中進行自然干旱脅迫。從自然干旱脅迫(即停止澆水)開始計時，調查白三葉葉片萎蔫癥狀和嚴重萎蔫出現的時間。結果見表2。
表2葉面噴施不同濃度β-谷甾醇提高白三葉抗旱性效應
由表2可以看出，葉面噴施10-25mg/l的β-谷甾醇時，均能顯著提高白三葉抗旱性，與對照組相比，在自然干旱脅迫下白三葉嚴重萎蔫可推遲5-7天。
實施例3葉面噴施β-谷甾醇對白三葉抗旱生理指標的影響
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料
材料培育：同實施例2
試驗設計：根據實驗例2篩選出的最佳葉片噴施濃度15mg/l為本實驗噴施濃度，試驗共設4個處理，每處理設置4次獨立重復，分別為：①正常條件對照(ck)：葉面噴施不含β-谷甾醇的溶劑后于溫室中正常培養18天作為對照；②ck+β-谷甾醇：葉面噴施15mg/l的β-谷甾醇后于溫室中正常培養18天；③直接干旱脅迫：葉面噴施不含β-谷甾醇的溶劑后于溫室中自然干旱18天；④干旱+β-谷甾醇：葉面噴施15mg/l的β-谷甾醇后于溫室中自然干旱18天。
干旱脅迫處理：每次噴施時于上午9:00進行葉面噴施，每個處理葉面均勻噴施100ml等量的液體，直至所有葉面掛滿水珠，連續噴施三次，每次間隔1天。處理完畢后，對照組(ck和ck+β-谷甾醇)正常澆水，干旱脅迫組(干旱和干旱+β-谷甾醇)停止澆水并放置于溫室中進行自然干旱脅迫。溫室條件同實施例2。
觀測指標：干旱脅迫18天時，測定反映白三葉生長狀況的單株干重和相對生長量；反映葉片水分狀況的相對含水量；以及反映受脅迫程度的葉綠素含量、電解質滲透率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶(sod)、抗壞血酸過氧化酶(apx)、過氧化氫酶(cat)、過氧化物酶(pod)活性。結果見表3。
表3葉面噴施β-谷甾醇(15mg/l)提高白三葉抗旱性相關生理生化指標變化
從表3可以看出，正常條件下，噴施外源β-谷甾醇預處理后能夠促進白三葉植株生長和葉綠素合成；干旱脅迫下，噴施外源β-谷甾醇預處理后能夠顯著緩解由干旱引起的生長抑制，減少葉綠素的降解，并通過提高多種抗氧化酶活性緩減由干旱引起的過氧化傷害，顯著降低電解質滲透率和膜脂過氧化產物丙二醛的積累。這些生長和生理生化指標進一步證明了葉面噴施β-谷甾醇預處理能夠有效提高白三葉的抗旱性。
實施例4：葉面噴施β-谷甾醇施用時間對施用效果的影響
(1)試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
(2)材料培育：同實施例2
(3)試驗設計及處理：根據實驗例2篩選出的最佳葉片噴施濃度15mg/l為本實驗噴施濃度。分別于上午9:00、上午11:00、下午14:00、傍晚17:00和夜晚20:00進行葉面噴施處理，每處理4次獨立的重復。材料干旱處理及溫室條件同實施例2。從自然干旱脅迫(即停止澆水)開始計時，調查白三葉葉片萎蔫癥狀和嚴重萎蔫出現的時間。結果見表4。
表4葉面噴施β-谷甾醇(15mg/l)不同施用時間提高白三葉抗旱性效應
由表4可知，不同葉面噴施時間對β-谷甾醇提高白三葉抗旱性效應無明顯影響。
實施例5：葉面噴施β-谷甾醇在不同白三葉品種上的應用效果
(1)試驗材料：‘拉丁諾’(干旱敏感型)和‘海法’(耐旱型)2個白三葉品種。
(2)材料培育：同實施例2。
(3)試驗設計與處理：根據實驗例2篩選出的最佳葉片噴施濃度15mg/l為本實驗噴施濃度。于上午9:00進行葉面噴施處理，每個處理設置4次獨立的重復。材料干旱處理及溫室條件同實施例2。從自然干旱脅迫(即停止澆水)開始計時，調查白三葉葉片萎蔫癥狀和嚴重萎蔫出現的時間。
表5葉面噴施β-谷甾醇(15mg/l)提高不同白三葉品種抗旱性效應
由表5可以看出，在相同培育和干旱脅迫條件下，未進行預處理時，‘海發’品種的抗旱性較‘拉丁諾’強；外源噴施β-谷甾醇預處理后，兩個品種的抗旱性較對照組處理都明顯提高。就兩品種比較，外源噴施β-谷甾醇預處理對干旱敏感型的‘拉丁諾’品種的抗旱效果比‘海發’更為顯著。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。