本發明屬于基因的功能與應用領域，涉及干擾素調節因子6(Interferon Regulatory Factor-6，IRF6)作為藥物靶標在篩選治療心肌肥厚的藥物中的應用，以及IRF6的抑制劑在制備治療心肌肥厚的藥物中的應用。

背景技術：

心肌肥厚是指在生物學牽張負荷或神經內分泌因素刺激誘導下，正常心臟心肌結構和功能的不斷調整，主要表現為心室空間構象和生物學效應的改變，如局部或大部分甚至整個心室壁或/和心房壁增厚、心臟質量增加并伴隨心臟射血功能改變和心室壁張力變化。病理性心肌肥厚是心臟重塑發生發展的重要環節，最初，代償性的肥厚能使心臟應對各種病理性的刺激，但持續的病理性刺激最終將導致心臟失代償性肥厚，收縮功能受損和典型的心臟重塑[1，2]。在細胞水平，心肌細胞肥大、排列紊亂，間質成分如成纖維細胞增殖，膠原合成和分泌增加，并伴隨心肌細胞凋亡。分子水平上表現為神經內分泌因子激活，胚胎基因再表達和興奮收縮耦聯相關蛋白、促纖維化相關基因的表達水平變化[3]。國內外學者對心肌肥厚的發病基礎和臨床防治進行了大量的研究，發現多種細胞外配體和細胞膜受體以及細胞內信號轉導通路和核內轉錄因子參與了這一系列改變，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、鈣調神經磷酸酶(Calcineurin/NFAT、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(JAK/STAT)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)和轉化生長因子β(TGFβ)[4]。目前針對心肌肥厚的主流治療策略是通過干預心肌重構相關的分子靶點，改善心功能，預防和逆轉心臟重構。臨床上，血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體Ⅰ阻斷劑(ARBs)、鈣拮抗劑(CAs)被作為主要的抗心肌肥厚藥物[5]。

IRF家族是一大類對IFN起調控作用的轉錄因子。IRF家族包含10個成員，其中，IRF1-9普遍表達于哺乳動物中，IRF10則特異性地在鳥類和魚類中表達。在結構上，IRF家族成員的N末端含有相對保守的DNA結合結構域(DNA binding domain，DBD)，C末端包含有IRF相關結構域(IRF associated domain，IAD)、自我抑制結構域、磷酸化位點等[6]。IRF6定位于1q32，IRF6雖然在結構上與IRF家族其他成員類似，但我們對其在天然免疫上的功能知之甚少，甚至有大量研究認為IRF6與天然免疫沒有關系[7]。目前關于IRF6的研究主要集中在調控上皮細胞的成熟分化方面。IRF6在皮膚角質細胞中高表達，并且在角質細胞分化成熟的過程中起著關鍵的作用。研究發現IRF6能夠與p63家族成員DeltaNp63形成一個調控環路來抑制角質細胞的增殖。Wnt信號通路則作為p63/IRF6上游參與這個過程，Wnt減少能阻斷p63/IRF6信號通路，導致細胞增殖增多，凋亡減少[8]。此外，在角質細胞中，IRF6作為Notch的主要靶分子參與Notch信號通路調節角質細胞的分化和腫瘤抑制功能[9]。TGF-β/Smad4信號通路能夠激活IRF6，并調節下游p21的表達參與顱面愈合[10]。IRF6的突變與以唇腭裂為特征的人類先天性綜合征—范德伍綜合征(Vander Woude syndrome)和腘翼狀胬肉綜合征(popliteal pterygium syndrome)的發生直接相關。定點敲入人類綜合征中常見的突變位點R84C的小鼠和IRF6基因完全敲除小鼠均出現角質細胞分化和增殖異常，并且能夠重現范德伍綜合征的表型[11，12]。綜上所述，IRF6執行其生物學功能均為通過非免疫依賴的方式實現的。

參考文獻：

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4.Krum H.Decade in review--heart failure:10 Years of progress in HF research--what have we learned？Nature reviews Cardiology.2014 Nov；11(11):631-3.

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7.Moretti F,Marinari B,Lo Iacono N,Botti E,Giunta A,et al.A regulatory feedback loop involving p63 and IRF6 links the pathogenesis of 2 genetically different human ectodermal dysplasias.The Journal of clinical investigation.2010 May；120(5):1570-7.

8.Kurosaka H,Iulianella A,Williams T,Trainor PA.Disrupting hedgehog and WNT signaling interactions promotes cleft lip pathogenesis.The Journal of clinical investigation.2014 Apr；124(4):1660-71.

9.Restivo G,Nguyen BC,Dziunycz P,Ristorcelli E,Ryan RJ,et al.IRF6is a mediator of Notch pro-differentiation and tumour suppressive function in keratinocytes.The EMBO journal.2011 Nov 16；30(22):4571-85.

10.Iwata J,Suzuki A,Pelikan RC,Ho TV,Sanchez-Lara PA,et al.Smad4-Irf6 genetic interaction and TGFbeta-mediated IRF6 signaling cascade are crucial for palatal fusion in mice.Development.2013 Mar；140(6):1220-30.

11.Kondo S,Schutte BC,Richardson RJ,Bjork BC,Knight AS,et al.Mutations in IRF6 cause Van der Woude and popliteal pterygium syndromes.Nature genetics.2002 Oct；32(2):285-9.

12.Ingraham CR,Kinoshita A,Kondo S,Yang B,Sajan S,et al.Abnormal skin,limb and craniofacial morphogenesis in mice deficient for interferon regulatory factor 6(Irf6).Nature genetics.2006 Nov；38(11):1335-40.

技術實現要素：

為改進臨床防治心肌肥厚疾病現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在于確定IRF6基因的表達與心肌肥厚疾病間的相互關系，提供IRF6作為藥物靶標在篩選、防治心肌肥厚疾病藥物中的應用，進而提供IRF6的抑制劑在制備防治心肌肥厚疾病的藥物中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

1、IRF6基因敲除顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能

本發明選用心臟特異性α-MHC-MCM小鼠、IRF6心臟特異性基因敲除小鼠(IRF6-CKO)、用于構建IRF6-CKO的條件性敲除小鼠(IRF5-flox，IRF6正常表達)進行試驗，并將每種小鼠分成假手術組和手術組，每組10只小鼠。手術組給予主動脈弓縮窄手術，假手術組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術組和手術組的各組小鼠進行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究IRF6基因敲除對主動脈弓縮窄誘導的心肌肥厚的影響。結果表明敲除基因所致的IRF6缺陷顯著地抑制心肌肥厚、纖維化及改善心功能。

2、IRF6基因過表達顯著促進了心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能

本發明選用心臟特異性IRF6轉基因小鼠和非轉基因小鼠進行試驗，并將每種小鼠分成假手術組和手術組，每組10只小鼠。手術組給予主動脈弓縮窄手術，假手術組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術組和手術組的各組小鼠進行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究IRF6基因過表達對主動脈弓縮窄誘導的心肌肥厚的影響。結果表明過表達IRF6基因顯著地促進心肌肥厚、纖維化，并惡化心功能。

3、IRF6干擾(AdshIRF6)及過表達(AdIRF6)腺病毒對經Ang II誘導的心肌細胞肥大模型的影響

本發明通過構建重組腺病毒AdshIRF6及AdIRF6感染SD乳鼠原代心肌細胞，予以Ang II刺激構建心肌細胞肥大模型，對照組則予以PBS，經免疫熒光監測及心肌細胞表面積統計表明，在Ang II刺激下IRF6干擾病毒明顯抑制心肌細胞肥大，心肌細胞表面積減?。籌RF6過表達病毒顯著促進心肌細胞肥大，心肌細胞表面積增大。

由上述結果可知在心肌肥厚的模型中，IRF6的表達與正常組相比顯著上調。IRF6基因缺陷抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能；促進IRF6表達則促進心肌肥厚、纖維化，惡化心功能。本發明的研究證明了：在主動脈縮窄術造成心肌肥厚模型中，IRF6具有促進心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能的作用。

因此，針對上述功能，IRF6基因可作為藥物靶點，構建IRF6基因過表達的體外細胞模型或動物模型，從而用于篩選預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物；IRF6基因也可作為基因治療中的靶基因，在其基礎上設計并制備預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物和/或生物學試劑，通過基因工程技術達到預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的目的。例如，以IRF6為靶基因設計干擾IRF6表達的雙鏈siRNA，通過化學方法合成后注射入人體，通過RNA干擾的方法使IRF6基因沉默以治療心肌肥厚疾??；此外還可以設計并構建IRF6的突變體，注射后進入細胞，競爭IRF6原型的作用底物，從而抑制IRF6的功能，達到治療目的；另還可以IRF6為靶點設計小分子化合物抑制劑，利用IRF6基因過表達的體外細胞模型或動物模型，通過篩選發現其中能夠特異性抑制IRF6的分子，從而為心肌肥厚疾病提供新的治療性分子。

本發明針對IRF6的上述功能，提供IRF6作為藥物靶標，在篩選保護心臟功能、預防、緩解和/或治療心肌肥厚及抗心肌纖維化的藥物中的應用。所述的應用是非診斷和非治療的目的；所述的篩選是指篩選IRF6的抑制劑。

本發明針對IRF6的上述功能，提供IRF6的抑制劑在制備保護心臟功能和預防、緩解和/或治療心肌肥厚及抗心肌纖維化的藥物中的應用。

一種保護心臟功能的藥物，包含IRF6的抑制劑。

一種預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，包含IRF6的抑制劑。

一種抗心肌纖維化的藥物，包含IRF6的抑制劑。

所述的IRF6的抑制劑具有本領域公知的含義，其可以是能夠特異抑制IRF6對靶基因的調控作用的任何物質，可以是在細胞中特異抑制IRF6表達的物質，也可以是與IRF6具有特異性相互作用并能減弱IRF6作用的物質。優選為IRF6基因的siRNA、IRF6基因的RNA干擾載體，IRF6的抗體及其他能夠抑制IRF6表達的抑制劑中的一種。

一種篩選用于保護心臟功能和預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物的方法，為篩選IRF6的抑制劑的方法，包括根據IRF6的序列設計其反義RNA，或者將IRF6與候選物質接觸，檢測IRF6的表達或作用，并選擇特異抑制IRF6表達或減弱IRF6作用的候選物質。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

(1)本發明發現IRF6的新功能，即IRF6具有促進心肌肥厚及其纖維化，惡化心功能的作用。

(2)基于IRF6的功能，其為研制保護心臟功能、預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物提供靶標。

(3)IRF6的抑制劑可用于制備保護心臟功能、預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物。

附圖說明

圖1是心臟特異性敲除IRF6小鼠的打靶策略及IRF6蛋白表達量統計圖。其中，A為心臟特異性敲除IRF6小鼠的打靶策略圖；B心肌細胞特異性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)心臟組織中的IRF6蛋白表達水平Western Blot檢測結果，與野生型小鼠相比，心肌細胞特異性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)心臟組織中的IRF6蛋白表達水平顯著降低。

圖2是心臟特異性IRF6轉基因小鼠的構建策略及IRF6蛋白表達量統計圖。其中，A為心臟特異性IRF6轉基因小鼠的構建策略圖；B為心臟組織總蛋白中NTG與TG小鼠IRF6蛋白的表達量Western Blot檢測結果，圖中TG2-TG6是構建的不同個體的IRF6-TG小鼠。

圖3是正常人和擴張性心肌病患者心臟中IRF6蛋白的表達圖，GAPDH作為內參，結果顯示擴張性心肌病患者心臟中IRF6的表達上調(*：p＜0.05vs正常人組)。

圖4是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱狀圖，結果顯示IRF6敲除降低HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖5是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術4周后心臟組織HE、WGA染色及心肌細胞橫截面積統計柱狀圖，結果顯示IRF6敲除減輕心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖6是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結果顯示IRF6敲除減輕心臟的纖維化(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖7是NTG和IRF6-TG小鼠AB術4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱狀圖，結果顯示IRF6過表達組HW/BW、LW/BW及HW/TL升高(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖8是NTG和IRF6-TG小鼠AB術4周后心臟組織HE、WGA染色及心肌細胞橫截面積統計柱狀圖，結果顯示IRF6過表達會促進心肌細胞肥大(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖9是NTG和IRF6-TG小鼠AB術4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結果顯示IRF6過表達會加重心臟的纖維化(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖10是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術4周后超聲檢測心功能結果統計柱狀圖，結果顯示敲除IRF6改善心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsα-MHC-MCM Sham組，§：p＜0.05vs IRF6-flox sham，#：p＜0.05vsα-MHC-MCM AB組)。

圖11是NTG和IRF6-TG小鼠AB術4周后超聲檢測心功能結果統計柱狀圖，結果顯示過表達IRF6心功能惡化；其中，LVEDD為左室舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vs NTG Sham組，#：p＜0.05vs NTG AB組)。

圖12是SD乳鼠原代心肌細胞用腺病毒AdshRNA、AdshIRF6、AdGFP、AdIRF6感染，經Ang II刺激后的免疫熒光及細胞表面積統計柱狀圖，IRF6的過表達病毒促進心肌細胞肥大，IRF6的干擾病毒抑制心肌細胞肥大。(*：p＜0.05vs AdshRNA/AdGFP PBS組，#：p＜0.05vs AdshRNA/AdGFP Ang II組)。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進行一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實驗用動物及飼養

實驗動物：選用8-10周齡、體重23.5-27.5g、雄性的心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(α-MHC-MCM)，背景為C57BL/6，購自Jackson Laboratory，貨號005650)、IRF6-flox條件性敲除小鼠(IRF6-flox)、心臟特異性IRF6基因敲除小鼠(IRF6-CKO)、心臟特異性IRF6轉基因小鼠(IRF6-TG)及非轉基因小鼠(NTG，同齡同窩對照非轉基因小鼠)為實驗對象。

飼養環境：所有實驗小鼠均飼養在武漢大學SPF級實驗動物中心。SRF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。

實施例1心臟特異性IRF6基因敲除小鼠以及IRF6轉基因小鼠的構建

1.心臟特異性IRF6基因敲除小鼠的構建(構建策略見圖1A)

利用CRISPR-Cas9技術構建心臟特異性IRF6基因敲除小鼠。首先，通過在線CRISPR設計工具(http://crispr.mit.edu)分別在小鼠IRF6基因內含子2和3中各設計一個CRISPR的打靶位點，靶序列分別為：

IRF6-sgRNA 1：GGTCTGGGGCGACATTGTACAGC AGG，

IRF6-sgRNA 2：GGCGTGTTAGTAAGCCGAAGTCAC AGG。

此外還設計了一個用于同源修復的供體載體(Donor Vector)，它包括兩側同源臂、中間的外顯子3以及兩個同向的loxp序列。

(1)打靶載體的構建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經過限制性內切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續的體外轉錄實驗。

(2)條件性敲除骨架載體pBluescript SK(+)-2loxp的構建：

分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：

loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，

loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，

loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescript II SK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescript SK(+)-2loxp。

(3)供體載體的構建：根據引物設計原則，設計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴增得到的產物經表1中所示限制性內切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescript SK(+)-2loxp中，得到供體載體。

表1構建供體載體所需引物序列及對應酶切位點

(4)打靶載體的轉錄：對CRIPR/Cas9系統包含的兩個部分(負責切割作用的Cas9蛋白和引導Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體pST1374-Cas9(Addgene 44758)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質粒為轉錄模板，用T7mMESSAGE mMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉錄，獲得加帽的mRNA產物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產物加尾，獲得成熟的mRNA產物；對于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉錄。將轉錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)進行純化。

(5)IRF6-flox條件性敲除小鼠的制作

將上述成熟的mRNA產物與供體質粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續的繁殖，最終獲得IRF6-flox純合小鼠。

(6)心臟特異性IRF6基因敲除小鼠的制作

將上述IRF6-floxed小鼠與心臟特異性α-MHC-Cre(購自Jackson Laboratory，貨號005650)轉基因小鼠交配，篩選得到IRF6^flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen(他莫昔芬)，誘導Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到心臟細胞特異性IRF6基因敲除小鼠。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取對應組織總蛋白，使用Western Blot方法檢測IRF6敲除小鼠與WT小鼠心臟組織中IRF6蛋白表達量(圖1B)，可見IRF6-CKO小鼠體內，IRF6蛋白表達含量顯著降低。

(2)心臟特異性IRF6轉基因小鼠的構建(構建策略見圖2A)

以C57BL/6小鼠IRF6基因的cDNA為模板，用如下引物PCR擴增IRF6基因(NCBI，Gene ID：54139，NM_006147.3)：

上游引物：5’-GCTCTAGAGCCACCATGGCCCTCCACCCCC-3’，

下游引物：5’-GCTCTAGATTACTGGGGAGGCAGGGC-3’。

把擴增得到的產物和pCAG-CAT-LacZ載體(北京協和醫學院基礎學院楊青林老師實驗室提供，制備過程參見參考文獻：Kim T,Zhelyabovska O,Liu J,et al.Generation of an Inducible,Cardiomyocyte-Specific Transgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J].Peroxisome Proliferator-Activated Receptors(PPARs),57.)用限制性內切酶XbaI(NEB，#R0145L)酶切后連接，得到轉基因載體pCAG-CAT-IRF6-polyA，IRF6的表達由CAG啟動子驅動得到。

將構建的pCAG-CAT-IRF6-polyA載體通過顯微注射構造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRF6-floxed轉基因小鼠。心臟特異性IRF6轉基因小鼠由IRF6-floxed轉基因小鼠和α-MHC-Cre(購自Jackson Laboratory，貨號005650)小鼠雜交繁殖得到，方法同上述基因敲除小鼠的構建。

取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取對應組織總蛋白，使用Western Blot方法篩選IRF6表達量最高的小鼠。將其同窩陽性鼠繼續繁殖，從而獲得穩定遺傳心臟特異性IRF6轉基因小鼠品系。為了反映病理生理狀態下IRF6的改變，本發明選擇了IRF6-TG5小鼠，Western Blot及定量分析顯示，其心臟組織中IRF6表達量約為正常組織4.5倍(圖2B)。

實施例2IRF6在正常人和心肌病患者心臟中的表達

選用正常人心臟(非心臟原因的死亡捐獻的個體)、擴張型心肌病患者心臟移植手術病人置換的受體)，對心臟提取蛋白質進行SDS-PAGE-免疫印跡實驗(Western Blot)，結合特異性識別IRF6的抗體進行檢測，測定其IRF6的表達，GAPDH作為內參。檢測結果如圖3所示，擴張型心肌病患者心臟中IRF6的表達明顯上調。

實施例3心肌肥厚模型的獲得

1.實驗動物分組：通過主動脈縮窄(AB)術建立心肌肥厚模型。隨機分為10組，分組如下：對照組假手術組(α-MHC-MCM Sham、IRF6-flox Sham)及對照組AB術組(α-MHC-MCM AB、IRF6-flox AB)、IRF6基因敲除小鼠假手術組(IRF6-CKO Sham)及AB術組(IRF6-CKO AB)、非轉基因小鼠假手術組(NTG Sham)及AB術組(NTG AB)、心臟特異性IRF6轉基因小鼠假手術組(TG Sham)及AB術組(TG AB)。

2.心肌肥厚模型采用主動脈弓縮窄(AB)手術，模型操作流程：

2.1術前準備

(1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計算所需麻藥(3％戊巴比妥鈉)量，通過腹腔注射，并記錄注射時間點。夾尾、夾趾無明顯反應且小鼠狀態良好為麻醉成功標準(一般注射后約10min無明顯反應，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應，麻醉后30min左右為最佳手術時間)。

(2)術區準備：將小鼠左胸部、左側胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗布擦拭術區去除鼠毛，以不影響手術視野為宜。

(3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經聲門準確插入氣管內，隨后右側臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預熱)，然后將氣管插管與呼吸機連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機頻率一致，說明氣管插管成功。

2.2主動脈弓降支結扎術

取右側臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分數為75％的酒精對手術區域皮膚消毒。左手持眼科鑷將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約1cm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動脈弓降支，將7-0手術縫線穿過血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器針頭，將血管及針頭一起結扎好，再抽出針頭即可達到相應程度的血管縮窄。結扎完畢后依次縫合，關閉胸腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出1cc氣體以恢復胸腔內負壓，拔出注射器后迅速縫合皮膚切口。假手術組(Sham)在游離出主動脈降支后只穿線不結扎，其余步驟同心肌肥厚模型組。

2.3術后護理

主動脈弓降支結扎術后，待小鼠出現自主呼吸、夾趾出現強烈反應，拔出氣管插管，并將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養籠內，于飼養室繼續飼養觀察。IRF6基因敲除小鼠及對照組小鼠術后4周、非轉基因小鼠及心臟特異性IRF6轉基因小鼠術后4周分別進行各項指標的檢測。

實施例4心肌肥厚模型小鼠病理學檢測

1.取材

(1)前期工作：預先準備裝有20mL的體積分數10％甲醛的尿杯，并貼好標簽(小鼠編號、組別、手術類型及取材日期)。將倒滿質量分數10％KCl溶液的培養皿置于取材處。打開分析天平，調零備用。再稱重處死小鼠。

(2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質量分數10％KCl溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內液體，蘸干表面液體后，稱重并記錄，將心臟放入相應的尿杯中，固定48h后用于病理學檢測。

(3)相關測量及計算：取出小鼠心臟、肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后肢脛骨處皮膚，測量并記錄脛骨長度。計算心重與體重的比值(HW/BW)，肺重與體重的比值(LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值(HW/TL)。

2.病理學檢測

2.1制備石蠟標本切片

主要操作程序包括修剪心臟→包埋框處理→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→晾干或烘烤后備用。

2.2蘇木精-伊紅(HE)染色

主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→雙蒸水1min→蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70％酒精充分混合均勻)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氫鈉0.35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸餾水)1min→水洗1min→伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)3-5min→蒸餾水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風櫥內吹干，顯微鏡拍照。

2.3麥胚凝集素染色(WGA染色)

主要步驟為：將石蠟切片置于烘箱烘烤60min→二甲苯脫蠟5min，3次→100％乙醇5min，2次→95％乙醇5min→70％乙醇5min→雙蒸水浸洗5min，2次→PBS洗5min，2次→甩盡玻片上水分，用免疫組化筆在組織周圍畫圈→50μg/ml WGA-FITC，濕盒內孵育30min→PBS洗5min，3次→DAPI復染8min→使用水溶性封片劑封片，置于4℃冰箱內避光保存。

于熒光顯微鏡400倍下拍照，并使用ImagePro Plus 6.0軟件測算圓形或近似圓形的左室單個心肌細胞橫截面積。要求統計每組不少于5只小鼠，每只小鼠不少于100個細胞。

2.4天狼星紅(PSR)染色

主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水沖洗10min→雙蒸水1min→質量分數0.2％磷鉬酸2min→0.1％天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min→去除殘液→0.01N鹽酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。

心肌組織由心肌細胞和間質組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細胞失去增殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細胞反應，只能是單個細胞的體積增大而不能在數量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過程中，主要表現為心肌細胞體積增大，肌節數量增多，細胞排列紊亂，心臟間質改變包括心肌成纖維細胞的增殖與轉化，膠原纖維密度增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調等。

α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術后的表型結果見圖4、圖5、圖6。Sham(假手術)組中對照組α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠與IRF6-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無統計學意義；α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠AB術后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham組；AB術后4周，IRF6-CKO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠降低(圖4)。心臟表型，Sham組心臟無明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，IRF6-CKO小鼠的心臟增大程度明顯小于對照組小鼠。HE及WGA染色切片可觀察到：Sham組心肌肌原纖維細胞排列整齊、致密，形態完整，胞核及核仁結構清晰；AB組肌絲排列紊亂、松散，心肌細胞體積明顯增大，形態不規整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，而IRF6-CKO組較α-MHC-MCM、IRF6-flox組細胞肥大減輕，差異有統計學意義(圖5)。PSR染色后，發現AB組心室心肌間質膠原含量較Sham組增加，動脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排列紊亂成網絡狀；AB術后IRF6-CKO小鼠膠原含量及血管周圍膠原含量低于對照組小鼠(圖6)。以上結果說明經AB術后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，而IRF6-CKO小鼠的心肌肥厚程度輕于α-MHC-MCM、IRF6-flox對照組小鼠。

圖7、圖8、圖9是NTG和IRF6-TG小鼠AB術后的表型結果。同樣NTG小鼠AB術后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明顯大于NTG小鼠(圖7)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術后TG小鼠心臟增大的程度遠大于NTG小鼠。HE及WGA染色切片可觀察到：TG小鼠AB術后心肌細胞橫截面積大于Sham組，AB組TG小鼠顯著大于NTG小鼠(圖8)。PSR染色可見：TG小鼠AB術后心肌間質膠原含量及血管周圍膠原含量均高于NTG小鼠AB組(圖9)。以上結果說明經AB術后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，IRF6-TG小鼠的心肌肥厚程度較NTG小鼠更重。

實施例5心肌肥厚模型小鼠超聲檢測心功能

1.前期準備

(1)麻醉機準備：先連接氧氣瓶和麻醉機上的進氣接口，再擰開麻醉機上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。

(2)待測小鼠準備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導管套頭內，以1.5-2.0％異氟烷維持小鼠穩定的麻醉狀態。

2.心功能檢測

小鼠取左側臥位或仰臥位，并在剃毛區均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司)。采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)及短軸縮短率(FS)。

本實施例運用M型超聲心動圖檢測評價心肌肥厚和心功能。圖10是α-MHC-MCM、IRF6-flox和IRF6-CKO小鼠AB術后心功能檢測結果。與對照的Sham組相比，AB組術后4周表現出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指標FS則下降。AB術后4周，IRF6-CKO小鼠心肌肥厚的指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度輕于α-MHC-MCM、IRF6-flox小鼠。這些結果與IRF6-CKO小鼠心肌肥厚減輕的結果一致。

圖11是NTG和IRF6-TG小鼠AB術后的超聲檢測結果。與NTG Sham組相比，NTG小鼠AB術后4周表現出心功能降低及心肌肥厚。主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD升高，而反映心功能的指標FS則下降。AB術后4周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚指標升高的程度及反映心功能的指標下降的程度均明顯高于NTG組。這些結果與TG小鼠心肌肥厚顯著加重的結果一致。

實施例6IRF6干擾(AdshIRF6)及過表達(AdIRF6)腺病毒對Ang II刺激的原代心肌細胞肥大的影響

1.原代新生SD大鼠心肌細胞培養

(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，頸部以下75％酒精消毒，用眼科剪和顯微鑷取下心臟，放入盛有10mL DMEM/F12培養基的玻璃平皿中。再取另一只，重復以上過程。

(2)用DMEM/F12培養基清洗心臟，并將心臟剪成1-2mm³的碎片。轉入到放有轉子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。轉速為120r/min，消化15min，靜止數秒鐘，棄去上清液。

(3)加入胰酶消化液，轉速為120r/min，消化15min。靜止數秒鐘，吸取上清液，用含20％小牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，并置于4℃冰箱保存。重復該步驟，循環若干次。取上清時應盡量取盡，當組織塊變白并明顯變小時，終止消化。

(4)將收集好的心肌細胞懸液以1500rpm轉速離心8min，棄去上清液。在離心管中加入適量培養基，輕柔吹打重懸細胞，集中至1個50mL離心管中，細胞懸液用細胞40μm過濾網過濾。

(5)將細胞接種在100mm的培養皿中，差時貼壁90min，吸取未貼壁的細胞懸液過濾。根據細胞懸液的總量加入Brdu(終濃度0.1mM)，混勻之后，加入到用0.1％明膠包被的器皿中。

(6)輕搖分散細胞，勿漩渦搖晃。37℃、5％CO₂孵育48小時用PBS清洗1次，更換培養基。

2.IRF6干擾(AdshIRF6)及過表達(AdIRF6)腺病毒對經Ang II誘導的心肌細胞肥大模型的影響

AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作對照)、AdshIRF6(含shRNA-IRF6(沉默RNA-IRF6融合蛋白)的腺病毒，沉默IRF6表達)、AdGFP(含GFP(綠色熒光蛋白)的腺病毒，用作對照)及AdIRF6(含GFP-IRF6(綠色熒光蛋白-IRF6融合蛋白，IRF6過表達)的腺病毒)。

(1)重組腺病毒構建

從美國InvivoGen公司購得IRF6的表達載體，應用腺病毒表達系統AdenoVec構建重組AdGFP、AdIRF6；從美國SuperArray公司購得shRNA、shIRF6載體，然后應用腺病毒表達系統AdenoVec構建重組AdshRNA、AdshIRF6。

(2)重組腺病毒的鑒定

取病毒粗提液加入裂解液，經混勻、離心后取上清液作為模板進行PCR擴增，產物通過凝膠電泳鑒定。

(3)重組腺病毒的擴增

轉染前接種HEK293細胞，待細胞達到50-70％匯合時換液，加入含有重組腺病毒載體的新鮮培養液，培養90分鐘后再添加新鮮培養液，培養至大約有50％的細胞從培養板上脫落時，收集細胞懸液。反復凍融以制備病毒粗提液，通過CsCl密度梯度超速離心法純化病毒液。

(4)重組腺病毒滴度測定

在96孔板中接種HEK293細胞，24小時后加入倍比稀釋的病毒液，1-10列加入稀釋的病毒液，每個濃度8個重復孔，11-12列加入無病毒完全培養液，培養10天后在顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)，計算每個濃度的陽性率。病毒滴度采用Spearman-Karber Method計算：滴度(pfu/mL)＝10^(x+0.8)，x＝各濃度陽性率總和。前提條件：陰性對照無CPE和生長抑制現象；最小稀釋濃度組均有CPE；最大稀釋濃度組均無CPE。

(5)重組腺病毒作用的鑒定

用2×10⁸pfu/virus濃度的AdIRF6和AdGFP及AdshIRF6和AdshRNA感染6孔培養板中培養的心肌細胞(約80％匯合度)，24小時后收集細胞，加入蛋白裂解液裂解50分鐘后收集上清，取50μg樣品經10％SDS-PAGE電泳分離后，用IRF6特異性抗體做Western Blot分析。根據IRF6蛋白的表達，確定腺病毒AdIRF6和AdGFP及AdshIRF6和AdshRNA是否能發揮預期作用。由AdGFP和AdshRNA感染的細胞IRF6蛋白表達含量不變。由AdshIRF6感染的細胞IRF6蛋白表達含量顯著減少；相反的，由AdIRF6感染的細胞IRF6蛋白表達含量顯著增加。

腺病毒10MOIs分別感染培養3天的原代心肌細胞，12小時后用1μM血管緊張素II(Ang II)(購自Sigma，A9525)或對照PBS刺激48小時，然后進行免疫熒光試驗。結果表明，經AdshIRF6腺病毒感染后的心肌細胞表面積較AdshRNA對照組顯著減小，而經AdIRF6腺病毒感染的心肌細胞表面積則與對照組相比AdGFP明顯增大(圖12)。即IRF6的干擾腺病毒抑制心肌細胞肥大，IRF6過表達的腺病毒則促進心肌細胞肥大。

由以上結果可知，在主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，IRF6基因缺陷顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，改善心功能，IRF6基因過表達顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能。因此IRF6基因具有促進心肌肥厚及纖維化并使心功能惡化的作用，IRF6基因可促進主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病的發生發展。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學

<120> 干擾素調節因子6（IRF6）及其抑制劑在治療心肌肥厚中的應用

<130> 1

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ggtctggggc gacattgtac agcagg 26

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

ggcgtgttag taagccgaag tcacagg 27

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp1-R

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> loxp2-F

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> loxp2-R

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ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 LA-F

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ccgctcgagc ggtttagtgt gttcttgttt ga 32

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 LA-R

<400> 8

acgcgtcgac gaattccagg tggtggtgag 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 M-F

<400> 9

tctaccggtc ccagacttca gcttcagca 29

<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 M-R

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ggcgatatcc ctcctcagag caatggtgg 29

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 RA-F

<400> 11

ggactagttc aaagcagtag ggtgtgct 28

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> IRF6 RA-R

<400> 12

ataagaatgc ggccgctgtg ggtccaaaga agcagg 36

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 上游引物

<400> 13

gctctagagc caccatggcc ctccaccccc 30

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 下游引物

<400> 14

gctctagatt actggggagg cagggc 26