本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域，特別地，涉及一種氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗。此外，本發(fā)明還涉及一種包括上述氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

靶向治療是指作用于專門分子從而阻止腫瘤生長、增殖、擴(kuò)散的藥物或者小分子物質(zhì)，也被稱為分子靶向治療，分子靶向藥物和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。靶向治療與化療不同：(1)靶向治療只專門作用于腫瘤相關(guān)的分子，而化療抑制細(xì)胞代謝，影響細(xì)胞周期，作用于所有快速分裂的細(xì)胞既包括腫瘤，也包括正常細(xì)胞，換而言之，化療的特異性相對較差；(2)靶向治療是瞄準(zhǔn)靶細(xì)胞或者靶點(diǎn)精心設(shè)計(jì)和選擇的，而化療的選擇僅僅是因?yàn)榭梢砸种苹驓[瘤細(xì)胞；(3)靶向治療是抑制細(xì)胞的增殖分化，與細(xì)胞周期無關(guān)，而化療藥物是利用細(xì)胞周期的敏感階段引起細(xì)胞中毒而殺傷細(xì)胞。

西妥昔單抗是一種已經(jīng)使用12年的EGFR抗體的靶向治療藥物，療效肯定但是微弱。隨著化療對免疫系統(tǒng)的損害，耐藥復(fù)發(fā)，先天性反應(yīng)低等情況的出現(xiàn)，亟需更加高效的EGFR抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗，以解決現(xiàn)有的西妥昔單抗療效弱的技術(shù)問題。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了一種氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗，氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗包括西妥昔單抗和氧化石墨烯，西妥昔單抗和氧化石墨烯通過非共價鍵連接，氧化石墨烯為二維納米氧化石墨烯，且粒徑小于0.22μm。

進(jìn)一步地，西妥昔單抗和氧化石墨烯的質(zhì)量比為50～5:1。

本發(fā)明另一方面提供了一種氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗的制備方法，包括以下步驟：將西妥昔單抗、氧化石墨烯加入體積百分?jǐn)?shù)為10～50％的磷酸鹽緩沖液中，在4～40℃下震蕩搖勻，反應(yīng)2～24小時得到氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗。

進(jìn)一步地，磷酸鹽緩沖液的體積百分?jǐn)?shù)為10％，磷酸鹽緩沖液的用量為1mg氧化石墨烯加入0.5～1.5ml所述磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為1ml磷酸鹽緩沖液。

進(jìn)一步地，反應(yīng)溫度為37℃。

進(jìn)一步地，反應(yīng)時間為12～24小時，優(yōu)選為12小時。

進(jìn)一步地，氧化石墨烯的制備包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料在0～4℃的條件下，通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾，得到氧化石墨烯。

進(jìn)一步地，超聲波破碎的操作包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料配置為1～2mg/ml，在超聲波的強(qiáng)度為3.5的條件下，超聲2小時，超聲模式為工作10s，休息5s。

本發(fā)明還提供了一種氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下有益效果：上述氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗，西妥昔單抗和氧化石墨烯通過非共價鍵連接，形成復(fù)合抗體，可大幅度的增強(qiáng)生物學(xué)反應(yīng)。相比西妥昔單抗在體外只有輕微抑制作用，上述氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗可直接抑制或殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞。同時采用粒徑小于0.22μm的二維納米氧化石墨烯，可使得氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗性質(zhì)穩(wěn)定，同時降低對外周血管的刺激。

除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。下面將參照圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是氧化石墨烯原料和二維納米氧化石墨烯的對比圖；

圖2是氧化石墨烯原料和二維納米氧化石墨烯在10×10×＝100×倍數(shù)下的對比圖；

圖3是CTX/GO和PANI/GO的對比圖；

圖4是PBS、GO、CTX、CTX/GO溶液處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在10×10×＝100×倍數(shù)下的觀測圖；

圖5是PANI、PANI/GO溶液處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在10×10×＝100×倍數(shù)下的觀測圖；

圖6是PBS和CTX/GO溶液處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在10×40×＝400×倍數(shù)下的觀測圖；

圖7是各組溶液不同梯度下處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活數(shù)目吸光值分布圖；

圖8是各組溶液不同梯度下處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活數(shù)目吸光值柱狀圖；

圖9是CTX-FITC處理的不同細(xì)胞株的熒光強(qiáng)度圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實(shí)施。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例提供了本發(fā)明一方面提供了一種氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗(CTX/GO)，氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗包括西妥昔單抗(CTX)和氧化石墨烯(GO)，西妥昔單抗和氧化石墨烯通過非共價鍵連接。

氧化石墨烯含有sp2雜化帶羥基和羧基的苯環(huán)，不僅性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好，還可以通過π鍵、疏水作用、氫鍵和離子鍵與抗體、藥物分子、金屬離子、熒光基團(tuán)或者細(xì)胞非共價結(jié)合。其次，二維結(jié)構(gòu)的GO的表面比任何其他納米材料都高出至少4個量級，它的每個原子都暴露在表面，適合于運(yùn)載藥物。GO是其他石墨材料的基本構(gòu)建塊，可以裹成零維的球體，滾成一維的碳納米管，層疊成三維結(jié)構(gòu)的石墨。

石墨烯雖然是公認(rèn)的納米材料，但是并不一定適合作為靜脈用的藥物。因?yàn)榧{米材料的概念是指，任何三維結(jié)構(gòu)中，只要有一維達(dá)到納米級就可以稱為納米材料。比如未經(jīng)改良的石墨烯(可購買于Sigma)，雖然厚度符合納米級，但是直徑較大，不符合納米級要求。申請人認(rèn)為作為靜脈用的藥物，必須達(dá)到所有維度的納米級才能減小毒性，最大發(fā)揮納米材料的優(yōu)勢。石墨烯為二維結(jié)構(gòu)，選擇或制備厚度及直徑均符合納米級的二維納米石墨烯作為原料，使得氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗更加適合體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)，尤其是體內(nèi)試驗(yàn)。

氧化石墨烯的粒徑小于0.22μm。顆粒較大的氧化石墨烯在生理鹽溶液下容易發(fā)生聚集，生成沉淀，性質(zhì)不穩(wěn)定。采用粒徑小于0.22μm的氧化石墨烯可在人血清中穩(wěn)定均勻分散。粒徑小于0.22μm的氧化石墨烯可直接購買或?qū)⒋箢w粒的氧化石墨烯破碎制取，如通過超聲波破碎制取。

此外，盡管GO可分散于水中，如生理鹽水，然而由于鹽的電荷屏蔽作用使得GO易發(fā)生聚集。良好的藥物載體具有優(yōu)良的表面化學(xué)性質(zhì)，不僅生物相容性好，而且生物變化可控。因此，GO的表面修飾勢在必行，目前主要分兩種：共價和非共價，前者通常是通過氧化石墨烯的非飽和結(jié)構(gòu)破壞而形成的原子摻雜或反應(yīng)的技術(shù)；后者不改變GO的自然結(jié)構(gòu)，只通過非共價鍵，范德華力，電荷吸引，結(jié)合更加靈活。本申請中的氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗中，西妥昔單抗和氧化石墨烯通過非共價鍵連接，結(jié)合靈活，并且殺傷淋巴瘤細(xì)胞的效果強(qiáng)。

本發(fā)明具有以下有益效果：上述氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗，西妥昔單抗和氧化石墨烯通過非共價鍵連接，形成復(fù)合抗體，可大幅度的增強(qiáng)生物學(xué)反應(yīng)。相比西妥昔單抗在體外只有抑制作用，上述氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗可直接抑制或殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞。同時采用粒徑小于0.22μm的二維納米氧化石墨烯，可使得氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗性質(zhì)穩(wěn)定，同時降低對外周血管的刺激。

可選地，妥昔單抗和所述氧化石墨烯的質(zhì)量比為50～5:1。

本發(fā)明另一方面提供了一種氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗的制備方法，包括以下步驟：將西妥昔單抗、氧化石墨烯加入體積百分?jǐn)?shù)為10～50％的磷酸鹽緩沖液中，在4～40℃下震蕩搖勻，反應(yīng)2～24小時得到所述氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗。

磷酸鹽緩沖液(PBS)為本領(lǐng)域常用試劑，其pH值范圍為7.35～7.45。體積百分?jǐn)?shù)為10～50％的磷酸鹽緩沖液即PBS溶液在原配方的基礎(chǔ)上調(diào)整水的加入量，將其稀釋。

西妥昔單抗、氧化石墨烯在振蕩搖勻的條件下反應(yīng)，二者通過非共價鍵結(jié)合得到氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗。并且氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗可從作為溶劑的磷酸鹽緩沖液中分離出來，也可不予分離仍在磷酸鹽緩沖液中保持。

在上述條件得到的氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗在稀釋一倍之后仍具有一定的殺傷效果。

反應(yīng)時間過短，西妥昔單抗和氧化石墨結(jié)合時間不夠，導(dǎo)致二者結(jié)合量較小，結(jié)合不穩(wěn)定。而反應(yīng)時間過長，則增加了抗體變異的風(fēng)險。因此反應(yīng)時間可優(yōu)選為2～24小時。在研究中隨著CTX/GO的濃度稀釋，大部分不同溫度下制備的CTX/GO殺傷細(xì)胞的能力逐步減弱，但是只有在37℃和42℃合成的CTX/GO并沒有隨著濃度稀釋明顯降低療效，提示37℃和42℃制備的CTX/GO的治療效果最好。并且制備溫度越高，抗體分子高溫變性越嚴(yán)重，抗體活性越弱，而且溫度過高時，氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)也會遭到破壞，這兩方面的因素?fù)p害了CTX/GO的殺傷功能。

可選地，磷酸鹽緩沖液的體積百分?jǐn)?shù)為10％，磷酸鹽緩沖液的用量為1mg氧化石墨烯加入0.5～1.5ml所述磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選為1ml磷酸鹽緩沖液。10％PBS的條件下，CTX的結(jié)合量較高，更重要的是10％PBS有比較穩(wěn)定的緩沖系統(tǒng)，更接近生理情況。

可選地，反應(yīng)溫度為37℃。

反應(yīng)溫度選擇37℃。原因有二：第一，這個溫度下殺傷效果最好；第二，這個溫度也是生理溫度，有利于保障體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定，并為得到體外和體內(nèi)一致的結(jié)果奠定了基礎(chǔ)。

可選地，反應(yīng)時間為12～24小時，優(yōu)選為12小時。反應(yīng)時間為12～24小時，西妥昔單抗和氧化石墨量大，結(jié)合穩(wěn)定，繼續(xù)增加反應(yīng)時間，西妥昔單抗和氧化石墨結(jié)合數(shù)量并不會明顯增加?？紤]到時間成本，反應(yīng)時間可選優(yōu)為12小時。

可選地，氧化石墨烯的制備包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料在0～4℃的條件下，通過超聲波破碎，經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾，得到氧化石墨烯。

氧化石墨烯的制備很重要，嚴(yán)格控制大小和厚度?？蓮腟igma購得氧化石墨烯原材料，透析純化去除酒精。將氧化石墨烯原材料在超聲儀下破碎成細(xì)小顆粒。然后將經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾?？刹捎萌淘诒旌衔镏羞M(jìn)行操作以保證反應(yīng)溫度在0～4℃的條件。

可選地，超聲波破碎的操作包括以下步驟：

將氧化石墨烯原材料配置為1～2mg/ml，在超聲波的強(qiáng)度為3.5的條件下，超聲2小時，超聲模式為工作10s，休息5s。

在美國Misonix超聲波破碎儀Sonicator 3000，強(qiáng)度3.5，持續(xù)超聲2小時，模式工作10秒，休息5秒。在該條件下，氧化石墨烯的粒徑小于50nm，厚度為1～3nm。

分別取未處理的氧化石墨烯原料和處理后的氧化石墨烯10μl(濃度均為1mg/ml)，分別滴在細(xì)胞板上，如圖1所示。在顯微鏡下拍照，得到圖2a和圖2b。圖2a可見購買的氧化石墨烯原料比較大，直徑達(dá)40μm。圖2b的加工后的氧化石墨烯的顆粒小得多。

參照圖1和圖2，超聲過濾處理過的GO能在人血清中穩(wěn)定均勻分散，然而未經(jīng)超聲的一般GO(即一般的顆粒較大的氧化石墨烯，如從Sigma購得的氧化石墨烯原材料，其粒徑>0.5-1μm和厚度>10nm)在4小時之內(nèi)就發(fā)生沉淀。

實(shí)施例1

從Sigma購得氧化石墨烯原材料，透析純化去除酒精，配制為濃度1mg/ml，在美國Misonix超聲波破碎儀Sonicator 3000強(qiáng)度3.5的條件下，持續(xù)超聲2小時，模式工作10秒，休息5秒。注意全程在冰水混合物中進(jìn)行。超聲結(jié)束后，用0.22μm的過濾器過濾，制得氧化石墨烯，Nanodrop測量最終濃度，冷藏備用。

將1mg西妥昔單抗、0.2mg氧化石墨烯加入1ml體積百分?jǐn)?shù)為10％的磷酸鹽緩沖液中，在4℃下震蕩搖勻，反應(yīng)12小時，得到含氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗的混合液。

實(shí)施例2

和實(shí)施例1的區(qū)別在于，制備氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗時的溫度為37℃。

實(shí)施例3

和實(shí)施例1的區(qū)別在于，制備氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗時的溫度為40℃。

實(shí)施例4

和實(shí)施例1的區(qū)別在于，制備氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗時的反應(yīng)時間為2小時。

實(shí)施例5

和實(shí)施例1的區(qū)別在于，制備氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗時的反應(yīng)時間為24小時。

對比例1

和實(shí)施例1的區(qū)別在于，西妥昔單抗與PANI單抗反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

關(guān)于穩(wěn)定性

取實(shí)施例1的CTX/GO與對比例1的PANI/GO進(jìn)行比較。如圖3所示，CTX/GO清亮，均勻；而PANI/GO渾濁，包含沉淀。結(jié)果提示，PANI/GO性質(zhì)不穩(wěn)定，不適合作為治療的化合物進(jìn)行研究。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

圓底96孔板培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞濃度為4x10⁶/ml，200μl，分為五組。五組分別加入相同濃度的PBS溶液、氧化石墨烯溶液、實(shí)施例1的CTX溶液、實(shí)施例1的CTX/GO溶液、對比例1的PANI溶液和對比例1的PANI/GO溶液，在恒溫，恒濕，恒定二氧化碳濃度的情況下培養(yǎng)3天。在顯微鏡中(10×10×＝100×)觀察各組中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活數(shù)量。如圖4和圖5所示。觀察結(jié)果顯示，PBS組、GO組、CTX組和PANI組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活數(shù)量較多，PANI/GO組和CTX/GO組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活數(shù)量較少，并且高放大系數(shù)的鏡頭(10×40×＝400×)顯示，如圖6所示，CTX/GO組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活數(shù)量遠(yuǎn)小于PANI/GO組。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：

1、CTX組和PANI組在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中并不具備抑制或殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力或者抑制能力微弱。這與公知的認(rèn)識也是吻合。因?yàn)镃TX和PANI應(yīng)用于人體時，其作用于人體免疫系統(tǒng)，刺激免疫系統(tǒng)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞消滅，因而在體外實(shí)驗(yàn)中，由于沒有免疫系統(tǒng)或者補(bǔ)體，CTX和PANI對膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用微弱。

2、PANI/GO組和CTX/GO組具備抑制或殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力。相應(yīng)組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活數(shù)量大為減少。PANI和CTX與GO結(jié)合后，改變了PAN和CTX兩種EGFR受體抗腫瘤藥物的作用機(jī)制，使其在體外細(xì)胞試驗(yàn)中仍具有抑制或殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力。而CTX/GO組的抑制或殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能力遠(yuǎn)高于PANI/GO組。

MTS膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性檢測

圓底96孔板培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1x10⁶/ml，200μl，分為四組。每組分別對應(yīng)PBS處理組、GO組、CTX組和CTX/GO組。其中，將10％的PBS溶液、2μg/ml的GO溶液、10μg/ml CTX和CTX/GO溶液處理相應(yīng)的干預(yù)組。在恒溫，恒濕，恒定二氧化碳濃度的情況下培養(yǎng)3天。將各組的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞DBTRG-MG待檢，向96孔板中每孔中加入20μl的MTS試劑，輕軟震動，混勻，避免液體濺出來。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時，然后在全功能酶標(biāo)儀Synergy H1儀器中讀取450nm處的吸光值。吸光值可以反應(yīng)細(xì)胞的增殖活性，用來評價干預(yù)藥物的療效。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參照圖7和8，MTS中吸光值代表細(xì)胞增殖活性，PBS組、GO組、CTX組的吸光值集中于100附近，而CTX/GO組的吸光值雖隨梯度濃度的降低逐漸升高，吸光值由5.99升至40.54，仍遠(yuǎn)低于其他各組，說明CTX/GO能明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株DBTRG的活性。具體的吸光值數(shù)據(jù)如表1所示。

表1不同組別及梯度的吸光值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明二維納米氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗抑制/殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果更強(qiáng)。

EGFR表達(dá)水平及其與西妥昔單抗親和性的檢測

在西妥昔單抗上結(jié)合FITC基團(tuán)，制備成西妥昔單抗-FITC抗體(CTX-FITC)備用。CTX-FITC與二維納米氧化石墨烯結(jié)合，形成CTX-FITC/GO，備用。準(zhǔn)備DBTRG、U251、SGH44和HS683四種細(xì)胞株，各細(xì)胞株的操作如下：

取細(xì)胞1x10⁵重懸于200μl的培養(yǎng)基RPMI1640中，置于96孔板，每孔加入CTX-FITC 50μg，CTX-FITC/GO 50μg，或者等體積的PBS(對照，即圖例中的Cell)?；靹蚝罄^續(xù)培養(yǎng)2小時，消化并取出細(xì)胞做流式細(xì)胞儀分析，數(shù)據(jù)處理后如圖9。

結(jié)果分析：

四張圖分別代表不同的細(xì)胞株，分為兩組：第一二幅圖代表EGFR高表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，第三四幅圖代表膠質(zhì)瘤EGFR低表達(dá)株。細(xì)胞對照組的自身熒光基礎(chǔ)值在10⁴～10⁵之間，CTX-FITC與EGFR結(jié)合顯現(xiàn)出的熒光強(qiáng)度代表EGFR的表達(dá)水平，故此可鑒別出，DBTRG與U251屬于高表達(dá)株，而SGH44和HS683屬于低表達(dá)株。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：

1、從DBTRG組與U251組中CTX-FITC/GO與EGFR的結(jié)合情況可以看出，其中的GO并不影響CTX-FITC與EGFR結(jié)合，反而增強(qiáng)了結(jié)合的信號。

2、在SGH44組和HS683組中，CTX-FITC/GO不能增強(qiáng)結(jié)合信號。

綜合上述兩點(diǎn)可以得出結(jié)論，二維納米氧化石墨烯修飾的西妥昔單抗更高效的特異性結(jié)合EGFR受體，CTX-FITC/GO與EGFR之間為特異性結(jié)合，即只與EGFR結(jié)合。這是只抑制/殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞，保護(hù)正常細(xì)胞，減少毒副作用的重要基礎(chǔ)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。