本發明涉及醫用生物材料技術領域，具體涉及一種生物仿生型粘合劑及其制備方法，該生物仿生型粘合劑在濕潤環境組織的粘合、微創手術穿刺部位的粘合、以及單純創傷性皮膚撕裂處的粘合、免手術縫合等方面有潛在應用價值。

背景技術：

多年來，由于縫合牢固、傷口不易裂開等優點，采用縫合線、鉚釘等材料或器械縫合傷口是臨床上最常用且最有效的傷口粘合方法。然而，隨著現代醫學的快速發展，臨床上對手術方法和輔助材料的要求越來越高，為了減少手術的復雜程度和對病人的創傷，醫用粘合劑獲得了飛速的發展和廣泛的應用。

醫用粘合劑是指在醫療上應用的可粘附在表面或使表面間發生粘合的制劑、材料或物質，主要用于器官或組織的局部粘合與修補、傳統縫合術的輔助止血、牙齒的修補、骨骼或關節的結合與定位等技術領域。與傳統方法如縫合與釘合相比，醫用粘合劑的使用可有效縮短手術時間、避免縫合與釘合過程中造成的二次損傷、減輕患者疼痛感、提高患者的就醫舒適度。因此，醫用粘合劑越來越受到醫生和患者的青睞。

目前為止，人類對醫用軟組織粘合劑的研究已有數十年。各種類型的醫用軟組織粘合劑，雖然都已應用于臨床，但均具有一定的局限性。纖維蛋白粘合劑雖然應用時間久，應用范圍廣，但是由于其相對較低的粘合強度而逐漸被取代；半合成軟組織粘合劑Bio Glue、GRF粘合劑等雖然粘合強度達到使用要求，但由于產品中使用醛類物質對人體產生潛在毒害作用，因此使用過程中必然會帶來潛在的生物安全隱患，抑制了進一步的推廣和應用，化學合成類組織粘合劑如美國Ethicon Endo-Surgery公司的Dermabond Topical Skin Adhesive和德國Meyer-Haake Medical Innovations公司的Tissue adhesive，還有廣東龍心醫療器械有限公司的α-氰基丙烯酸正丁酯醫用粘合劑等，該類粘合劑均通過小分子單體物質快速聚合來達到產生粘性的目的，這些小分子單體具有一定的毒性，它們的毒副作用將可能導致潛在的熱效應、引起炎癥反應甚至還可能導致組織壞死等 嚴重的不良反應。

于此同時在實際的手術操作中，各種創面都是處于一個出血、組織液滲透等潮濕環境，上述各種組織粘合劑的使用環境大都在干燥環境下效果更佳，而潮濕環境下會發生溶脹脫落影響粘合效果，因此研制出一種無毒、潮濕環境下使用仍具有具有高強度組織粘合性的新型組織粘合劑是該領域內的發展趨勢。

海洋貽貝類生物通過足絲分泌的黏附蛋白，具有高強度、高韌性、防水性以及極強黏附性等特點，可以使其黏附在幾乎所有基底材料上。大量研究表明，3，4－二羥基－L－苯基丙氨酸(多巴，DOPA)是海洋貽貝類生物分泌的相關黏附蛋白中的重要組成部分，而且貽貝黏附蛋白所具有的這種超強黏附能力，主要與多巴中特有的分子結構以及其與基底材料的相互作用方式等相關。多巴胺、兒茶酚等多巴衍生物具有與多巴相似的結構和性質，同樣可以實現對基材表面的黏附，因而引起了研究人員的極大關注，于此同時除多巴之外粘蛋白產生粘性的結構基礎除了多巴之外還有一個保守序列即豐富的賴氨酸序列，這也是確保貽貝黏附蛋白所具有的高強度、高韌性、防水性以及特殊的黏附性能，是目前其它黏合劑所無法比擬的。目前，通過模仿黏附蛋白分子結構和性能，開發和應用新型功能材料，是仿生材料領域研究的熱點之一。

目前基于海洋生物貽貝的研究主要包括兩種途徑，其一是單純利用多巴胺通過控制條件使其形成聚多巴胺用于金屬材料、無機材料的表面涂層，改性后材料表面的惰性得以克服同時提高了材料的生物相容性和細胞的黏附性能，改善了材料的生物活性，其二是通過化學接枝將多巴胺及其衍生物接枝到其他高分子材料上進而賦予相似的生物粘性，國內專利《生物粘合劑及其制備方法》(申請號201410852796.3)中提供了一種通過3步改性的方式制備生物粘合劑的方法，文中采用傳統的羧基活化劑碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，，雖然生物粘合劑的粘合性能可以得以提高，但反應過程中會引入醛基、有機溶劑等，同時EDC結合NHS的活化方式對反應體系的pH值依賴性較高，導致制備工藝繁瑣、生物相容性差等諸多問題出現。

此本發明的目的是提供一種仿生型生物組織粘合劑的制備方法，發明中采用生物仿生和結構仿生兩種方式對透明質酸鈉、幾丁糖等天然高分子進行了化學改性，首先采用新型的羧基活化劑4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽 (DMTMM)在高分子鏈上接枝多巴胺或其它含有兒茶酚基團的衍生物，以提高高分子材料的生物粘性，然后在反應體系中添加賴氨酸或聚賴氨酸以提高含兒茶酚基團改性材料的賴氨酸含量，最終達到結構仿生貽貝粘蛋白的目的，進而提高材料的組織粘合性。

技術實現要素：

本發明提供了一種仿生型的生物組織粘合劑的制備方法，旨在改善目前傳統工藝制備貽貝粘蛋白仿生型生物組織粘合劑工藝中存在的不足，提高材料的粘性、改善材料的生物相容性以及材料的結構仿生。采用新型的羧基活化劑4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM)，通過酰胺化反應將多巴胺或其它含有兒茶酚基團的衍生物接枝到如羧甲基幾丁糖、海藻酸鈉、透明質酸鈉、肝素鈉等天然高分子多糖上，得到含有鄰苯羥基的天然高分子衍生物，隨后采用相同的方法選用賴氨酸或聚賴氨酸等物質進行進一步的改性，最終得到同時含有多巴類似物和多賴氨酸類似物以達到生物和結構仿生的新型組織粘合劑。具體的制備包括如下步驟：

(1)結構仿生型天然高分子的制備：

0.01％～10％(w/v)天然高分子水溶液中加入含有兒茶酚基團的小分子化合物和羧基活化劑4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM)(天然高分子單元與含有兒茶酚基團的小分子化合物的摩爾比為1/10～10/1，天然高分子單元與DMTMM的摩爾比1/10～100/1)。攪拌均勻后，置于4～50℃環境下反應一段時間。再加入一定比例的賴氨酸或聚賴氨酸(天然高分子單元與賴氨酸或聚賴氨酸分子單元的摩爾比為1/10～100/1)，于相同環境下反應一段時間即得。經透析、冷凍干燥處理后，即得到不同接枝率的結構仿生型天然高分子材料，高溫高壓滅菌后再配制成不同濃度的結構仿生型天然高分子溶液。

(2)結構仿生型天然高分子溶液的氧化：

取0.1～10％(w/v)高碘酸鈉溶液與0.1～10％(w/v)結構仿生型天然高分子溶液混合成凝膠。

本發明的優點：

1.制備工藝簡單，所用的羧基活化劑反應條件溫和，羧基活化效率高，且無需對pH進行過程控制，適于企業放大生產；

2.產品純化工藝簡單，無任何有機溶劑的使用；

3.產品為結構仿生型天然高分子材料，其粘附性能良好，可在濕態環境中充分發揮粘附作用，適于臨床應用；

附圖說明

圖1貽貝粘附蛋白結構組成

圖2結構仿生型天然高分子材料結構示意圖

圖3彈性模量曲線

圖4搭接-剪切拉伸承載強度

圖5搭接-剪切拉伸承載強度實驗的裝置圖

圖6拉伸強度曲線

圖7拉伸強度實驗的裝置圖

具體實施方式

現結合實施例，以透明質酸鈉和多巴胺鹽酸鹽為例，對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。

實施例一

將0.5g透明質酸鈉干粉(分子量2,000,000DA)溶解于25mL水中，并調節pH值至5，再加入0.25g多巴胺鹽酸鹽和0.5g DMTMM，充氮氣去氧且避光條件下攪拌反應24h。稱取聚賴氨酸0.034g，DMTMM0.0986g加入到上述混合體系中，充氮氣去氧且避光條件下反應6h。用pH＝5的PBS緩沖液透析2天(截留分子量10000)，再用pH＝7.2的PBS緩沖液透析2天(截留分子量10000)，冷凍干燥，得樣品A，待用。

將0.1g樣品A溶于5mL PBS溶液中，溶解完全后，加入50uL 3％的高碘酸鈉溶液，快速混合，于室溫下得生物粘合劑。

實施例二

將0.5g透明質酸鈉干粉(分子量310,000DA)溶解于25mL水中，并調節pH值至5，再加入0.5g多巴胺鹽酸鹽和0.5g DMTMM，充氮氣去氧且避光條件下攪拌反應48h。稱取聚賴氨酸0.034g，DMTMM0.0986g加入到上述混合體系中，充氮氣去氧且避光條件下反應6h。用pH＝5的PBS緩沖液透析2天(截留分子量10000)，再用pH＝7.2的PBS緩沖液透析2天(截留分子量10000)， 冷凍干燥得樣品A，待用。

將0.1g樣品A溶于1mL PBS溶液中，溶解完全后，加入60uL5％的高碘酸鈉溶液，快速混合，于室溫下得生物粘合劑。

實施例三

將0.6g透明質酸鈉干粉(分子量710,000DA)溶解于25mL水中，并調節pH值至5，再加入0.5g多巴胺鹽酸鹽和1g DMTMM，充氮氣去氧且避光條件下攪拌反應24h。稱取聚賴氨酸0.034g，DMTMM0.0986g加入到上述混合體系中，充氮氣去氧且避光條件下反應6h。用pH＝5的PBS緩沖液透析2天(截留分子量10000)，再用pH＝7.2的PBS緩沖液透析2天(截留分子量10000)，冷凍干燥得樣品A，待用。

將0.1g樣品A溶于2.5mL PBS溶液中，溶解完全后，加入80uL 3％的高碘酸鈉溶液，快速混合，于室溫下得生物粘合劑。

實施例四

將0.4g透明質酸鈉干粉(分子量950,000DA)溶解于25mL水中，并調節pH值至5，再加入0.5g多巴胺鹽酸鹽和1g DMTMM，充氮氣去氧且避光條件下攪拌反應16h。稱取聚賴氨酸0.034g，DMTMM0.0986g加入到上述混合體系中，充氮氣去氧且避光條件下反應6h。用pH＝5的PBS緩沖液透析3天(截留分子量10000)，再用pH＝7.2的PBS緩沖液透析3天(截留分子量10000)，冷凍干燥得樣品A，待用。

將0.1g樣品A溶于2.5mL PBS溶液中，溶解完全后，加入50uL 3％的高碘酸鈉溶液，快速混合，于室溫下得生物粘合劑。

實施例五

用巴胺鹽酸鹽配制濃度從0.1mg/mL到0.001mg/mL的溶液，共5個點，分別是0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL和0.001mg/mL，并用紫外分光光度計在波長λ＝280nm處分別測其吸光度，繪制標準曲線。

秤取實施例一中所制備的白色絮狀固體樣品A(兒茶酚化透明質酸鈉)10mg，溶于5mL水中，溶解完全后，用紫外分光光度計測其在波長λ＝280nm處的吸光度，根據標準曲線計算而得，制備樣品中的兒茶酚基含量為8.55％。(同樣條件下，若用羧基活化劑碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，所得制備樣品中的兒 茶酚基含量僅為3.26％。)

實施例六

將實施例二得到0.1g樣品A溶于1mL PBS溶液中，溶解完全后，加入60uL 5％的高碘酸鈉溶液，并快速混合兩者溶液，于旋轉流變儀下檢測其儲存模量G’，損耗模量G”隨時間變化曲線，如圖3所示。

實施例七

秤取實施例三中所制備的白色絮狀固體樣品A(兒茶酚化透明質酸鈉)0.1g，溶于2.5mLPBS中，溶解完全后，根據組織粘合劑粘結性能試驗方法第1部分：搭接-剪切拉伸承載強度(YY/T 0729.1)進行測試，該生物粘合劑在濕態下的搭接-剪切拉伸承載強度曲線如圖4所示，圖5為搭接-剪切拉伸承載強度實驗的裝置圖。

實施例八

秤取實施例四中所制備的白色絮狀固體樣品A(兒茶酚化透明質酸鈉)0.1g，溶于2.5mLPBS中，溶解完全后，根據組織粘合劑粘結性能試驗方法第3部分：拉伸強度(YY/T 0729.3)進行測試，該生物粘合劑在濕態下的拉伸強度曲線如圖6所示，圖7為拉伸強度實驗的裝置圖。