本發明涉及一種制備止血海綿的方法，特別涉及一種通過兩步冷凍法制備高效止血海綿的方法，屬于醫用材料領域。

背景技術：

隨著社會的發展，人們對外傷止血材料的要求越來越高。蛋白類可吸收性止血材料被認為是局部外傷最有效的生物醫用止血材料之一，具有可吸收、高效、經濟和無毒害等優點，它主要是通過自身材料特征與優勢，吸附血液，凝膠血小板，堵塞血管，促進凝血酶產生，從而達到止血作用。目前生物醫用材料的止血過程一般包括三個方面，（1）材料自身的吸液性能夠迅速的吸收滲血，溶脹后會貼合在傷口上，堵塞血管并產生一定壓力，對傷口起到壓迫止血作用；（2）材料自身能夠吸附血小板，使其粘附聚集于傷口，堵塞血管；（3）促進凝血酶的產生達到止血的最終目的。

膠原蛋白海綿利用大面積結構破壞血小板促進凝血，膠原蛋白在創面溶解和降解，使創面局部粘著性發生變化，從而促進凝血作用。

技術實現要素：

本發明目的是提供一種外部形貌致密，內部孔徑大小均勻，止血速度快且生物相容性良好的醫用止血海綿的制備方法。

本發明實現過程如下：

一種止血海綿的制備方法，包括以下步驟：

（1）向質量體積比g/mL為1～15%的類人膠原蛋白溶液中加入山梨醇，山梨醇加入量為類人膠原蛋白質量的1～10%；

（2）向類人膠原蛋白和山梨醇的混合溶液中加入甘油，甘油加入量為類人膠原蛋白質量的1～10%；

（3）向步驟（2）得到的混合溶液中加入類人膠原蛋白質量1～10%的谷氨酰胺轉移酶在4℃交聯12-36 h；

（4）將交聯后的溶液轉移到底部預凍冰層的容器中，再置于-80℃冰箱中冷凍2-5小時；

（5）-80℃冷凍后的樣品經冷凍干燥后滅菌即可得到止血海綿。

本發明在容器底部預凍一層冰，將4℃交聯的混合液放入底部預凍一層冰的容器中為第一步冷凍，進一步放入-80℃冰箱中冷凍為第二步冷凍。該兩步冷凍法在保證樣品底部形貌有所改善的同時提高了樣品表面的平整性和內部孔徑大小的均勻性，提高了海綿的止血效果。

本發明具有以下優點：（1）本發明通過兩步冷凍法改變了樣品的形貌，克服了樣品與容器接觸面會產生條紋狀裂痕的缺點；（2）兩步冷凍法制備的止血海綿止血性能更優，不會發生滲血現象，同時縮短了止血時間；（3）本發明制備的止血海綿具有良好的生物學相容性，不與體內組織產生免疫排斥反應；（4）本發明兩步冷凍方法簡單，易快速實現，應用于臨床可實現大批量快速生產。

附圖說明

圖1為兩步冷凍法所制備的止血材料的表觀和微觀形貌圖；

圖2為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿細胞毒性試驗結果；

圖3為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿兔子皮下植入效果對比圖；

圖4為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖；

圖5為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血時間對照圖。

具體實施方式

下面結合附圖具體實施方式對本發明進行詳細的說明。

本發明用類人膠原蛋白作為止血海綿的主要原料，其中類人膠原蛋白是將用于指導合成人膠原蛋白的mRNA片段進行特定的酶切，然后經過逆轉錄形成其互補DNA，然后進行特定合成酶與連接酶的作用后形成完整的DNA片段并轉入大腸桿菌體內，從而得到較高的表達，最終經過高密度發酵、分離、復性以及純化工藝生產得到最終的高分子生物蛋白。其分子也具有三螺旋結構，并且這種類人膠原蛋白還有獨特的水溶性，利用谷氨酰胺轉移酶作為交聯劑，采用兩步冷凍法制備出了一種外部形貌致密，內部孔徑大小均勻，止血速度快且生物相容性良好的醫用止血海綿。

實施例1

步驟一：將100 mg類人膠原蛋白溶于10 mL超純水中，得到濃度為 10 mg/mL的類人膠原蛋白溶液，將配制好的溶液用紗布過濾；

步驟二：向配制好的蛋白溶液中加入10 mg的山梨醇，攪拌約5 min；

步驟三：接著向類人膠原蛋白和山梨醇的混合溶液中加入10 mg的甘油；

步驟四：向上述混合溶液中加入10 mg的谷氨酰胺轉移酶，攪拌均勻后立即放入4℃冰箱交聯24 h；

步驟五：將交聯后的溶液倒入底部預凍冰層的培養皿中，置于-80℃冰箱中冷凍5小時；

步驟六：將一次性培養皿從-80 ℃冰箱中拿出來后，立即放入真空冷凍干燥箱中72 h凍干；

步驟七：凍干后的樣品滅菌即可得到成品止血海綿。

對比實例1（采用一次冷凍制備止血海綿）：

與上述實例類似，不同的是步驟五中的培養皿底部未預凍冰。

圖1為兩步冷凍法所制備的止血材料的表觀和微觀形貌圖，其中a，b分別為一步冷凍法制備的樣品的上下表面，e，f 是上下表面所對應的掃描電鏡圖，c，d 分別為兩步冷凍法制備的樣品的上下表面，g，h是上下表面所對應的掃描電鏡圖，圖中標尺均為200μm。

圖2為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿細胞毒性試驗結果。

圖3為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿兔子皮下植入效果對比圖。其中，a，c和e分別是一步冷凍法制備止血海綿植入兔子皮下一周、兩周和四周后材料與周圍組織的變化圖，b，d和f分別是兩步冷凍法制備止血海綿植入兔子皮下一周、兩周和四周后材料與周圍組織的變化圖；

圖4為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖。其中a和d分別為兔耳動脈和兔子肝臟的創傷模型組，b和e是一步冷凍法制備的止血海綿分別對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖，c和f是兩步冷凍法制備的止血海綿分別對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖；

圖5為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血時間對照圖。

對以上實施例1制備的海綿的外觀、內部形貌，體外細胞毒性、體內生物相容性和止血性能以及止血時間進行了分析，其分析結果如下：

1.本發明制得的止血海綿的外觀及內部形貌如圖1所示，可以明顯的看到與一步冷凍法制備的止血海綿相比，兩步冷凍法制備的止血海綿的底部形貌有很大的改善，底部形貌比之前致密且均勻。為了進一步驗證這個結果，我們通過掃描電鏡對其內部微觀結構進行了觀察，掃描電鏡結果顯示，海綿底部由之前的條狀裂痕變成致密的孔結構，而且上表面的內部孔結構較一步冷凍法均勻。均勻的孔結構有利于提高材料的機械性能和吸水性能，吸水性能的提高有助于血小板在傷口處的聚集，從而提高止血效果。

2.圖2是一步冷凍法和兩步冷凍法制備的兩種止血海綿的細胞毒性。從圖2我們可知，兩種海綿的浸提液與細胞共培養3天后，兩組細胞的相對增殖率都可以達到100%，這表明兩組材料都具有良好的細胞相容性，這說明本發明制備的凝膠細胞相容性良好，兩組細胞的活性在1天時之所以較低，可能是因為細胞對海綿的浸提液有一個適應的過程，一旦適應了之后，細胞就可實現快速的生長增殖。

3. 一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿滅菌后植入兔子皮下進行體內相容性實驗。實驗結果如圖3所示，一步冷凍組海綿植入兔子皮下2周后，海綿周圍有輕微的炎癥反應，4周后，我們發現材料周圍炎癥反應基本已經消失，而兩步冷凍法制備的止血海綿，植入皮下1周后，我們發現材料周圍已經有新血管生成，這表明皮下植入材料不同的形貌對其生物相容性有一定的影響，這是因為不同的形貌可能會影響海綿的降解性能，從而會影響材料的生物相容性，通過比較我們發現，與一步冷凍海綿相比，兩步冷凍海綿具有更好的生物相容性，植入皮下后不會與組織產生免疫排斥反應。

4. 圖4展示了對本發明制得的止血凝膠對兔耳止血（a-c）和肝臟止血(d-f)的效果，由圖可以明顯的看到兩步冷凍海綿止血后未發生滲血現象，而一步冷凍海綿有輕微的滲血現象，這是因為兩步冷凍海綿結構更致密，孔結構更均勻。

5. 圖5記錄了一步冷凍海綿和兩步冷凍海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血時間，實驗結果發現兩步冷凍海綿縮短了止血時間，這是因為均勻的孔結構可以增加海綿的表面積，從而提高其止血效率，這充分體現了兩步冷凍海綿在止血方面的優勢。

實施例2

步驟一：將1g類人膠原蛋白溶于10 mL超純水中，得到濃度為 100 mg/mL的類人膠原蛋白溶液，將配制好的溶液用紗布過濾；

步驟二：向配制好的蛋白溶液中加入50 mg的山梨醇，攪拌約5 min；

步驟三：接著向類人膠原蛋白和山梨醇的混合溶液中加入100 mg的甘油；

步驟四：向上述混合溶液中加入50 mg的谷氨酰胺轉移酶，攪拌均勻后立即放入4℃冰箱交聯24 h；

步驟五：將交聯后的溶液倒入底部預凍冰層的培養皿中，置于-80℃冰箱中冷凍5小時；

步驟六：將一次性培養皿從-80 ℃冰箱中拿出來后，立即放入真空冷凍干燥箱中72 h凍干；

步驟七：凍干后的樣品滅菌即可得到成品海綿。

其他實施案例

包括：（1）不改變原料，僅改變相關參數的操作，如濃度、體積和溫度等；或引入少量其他物質，但并未改變反應的基本原理；（2）工藝方法上的簡并、變換和調整。如將本實驗中的保濕劑山梨醇和甘油換做其他保濕劑等。

本發明的內容不限于上述實施案例所列舉，本領域普通技術人員通過閱讀本發明說明書而對本發明技術方案采取的任何等效的變換，不改變基本原理的調整均為本發明的權利要求所涵蓋。