本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種AR信號通路抑制劑及其應用。

背景技術：

雄激素在男性的一生中都具有非常重要的生理作用，雄激素的作用由雄激素受體(AR)介導，研究表明，AR信號通路的異常與前列腺癌(PCa)、良性前列腺增生(BPH)、肯尼迪病(Kennedy disease)、男性不育、雄激素不敏感征(AIS)以及男性乳癌等疾病的發生、發展有密切的關系，因此，AR信號通路的分子組成、數量、結構、功能以及與其它信號通路的聯系一直是泌尿外科領域的研究熱點。

前列腺癌發病機制的學說眾多，其中“基質上皮間串擾”(crosstalk between stroma-epithelium)在前列腺生長發育及病變過程中的作用已經得到學界公認。前列腺基質和上皮相互作用在前列腺疾病發生發展中起著十分重要的作用。前列腺為雄激素依賴性器官，AR信號系統對于前列腺癌的發生發展起著非常重要的作用，基質細胞AR通過調節相關細胞因子的變化影響前列腺上皮的惡變及轉移。基質微環境中的可溶性細胞因子在基質上皮間串擾中發揮著重要的作用，可溶性細胞因子與相應受體結合后可以與其他信號分子相互作用(細胞外基質、整合素)，一些細胞因子可以與雄激素及雄激素受體相互作用，這些協同作用可能引發前列腺組織癌變、進展以及局部腫瘤生長和遠處轉移。因此，充分認識可溶性細胞因子與AR通路之間的相互作用，對我們研究前列腺癌的發病機制有著重要的作用，以AR為靶點的內分泌治療將是前列腺癌的一種重要的臨床治療方式。

技術實現要素：

本發明的目的之一是提供一種AR信號通路抑制劑，所述抑制劑在人細胞中具有抗雄活性，能夠抑制雄激素依賴的細胞增殖，降低AR的下游靶向基因的表達；所述抑制劑能夠與HSP90的分子伴侶FKBP51蛋白口袋穩定結合，與FKBP51相互作用的氨基酸殘基主要是疏水殘基并且與AR相互做用的位點是相互重疊的。

所述AR信號通路抑制劑是化合物對硝基酚(PNP)，其結構式如下：

本發明的另一目的是提供上述AR信號通路抑制劑的用途，通過實驗證明了以上所示信號通路抑制劑能夠用于制備治療與AR信號通路異常激活有關的腫瘤藥物。

上述的信號通路抑制劑及其有機鹽或無機鹽在制備治療與AR信號通路異常激活有關的腫瘤藥物、制備治療肯尼迪病的藥物或制備AR信號通路抑制劑中的用途。所述的腫瘤為前列腺癌。

本發明還提供了藥物組合物，是以上述信號通路抑制劑及其有機鹽或無機鹽添加藥學上可以接受的輔助性成分制備而成的。該藥物組合物具有抑制AR信號通路的作用。

本發明還提供了篩選改善或治療前列腺癌的潛在物質的方法，包括以下步驟：

⑴用候選物質處理包含AR信號通路的前列腺癌細胞體系；

⑵通過實時定量PCR實驗檢測AR調控的五種基因PSA、FKBP51、KLK2、TMPRSS2、S100P在存在或者不存在候選物質的條件下的基因轉錄水平的表達，使用DHT激活AR信號通路，其中，不存在候選物質的條件為對照組，存在候選物質的條件為測試組，若測試組中AR調控的全部五種基因的表達量均低于對照組的，則表明該候選物質是改善或治療前列腺癌的潛在物質。

本發明的有益技術效果：本發明首次揭示了化合物對硝基酚在人細胞中具有抗雄活性，能夠抑制雄激素依賴的細胞增殖，降低AR的下游靶向基因的表達，通過實驗證明了對硝基酚對AR信號通路有抑制作用，可用于制備前列腺癌的藥物。本發明為前列腺癌的治療提供了一種新的選擇。

附圖說明

圖1、前列腺癌細胞LNCaP和22Rv1作為體內模型檢測PNP在人源細胞的抗雄活性

其中，■：LNCaP細胞；●：22Rv1細胞；用MTT法檢測細胞活性(cell viability)。

圖2、PNP通過FKBP51蛋白抑制AR活性

LNCaP細胞在血清饑餓處理后加入30μM的PNP和1nM DHT孵育12小時，采用實時定量RT-PCR檢測FKBP51(A)，PSA(B)，KLK2(C)，S100P(D)，TMPRSS2(E)表達水平，相對表達水平數據用三次實驗平均值±標準誤差表示，***p<0.001。

圖3、(A)不同濃度PNP處理FKBP的熒光光譜

a：未配合的FKBP51作為陰性對照；b-g：對用10、20、40、60、80、100μM的硝基苯酚分別處理FKBP51，最后的熒光光譜表示對硝基苯酚的固有熒光強度

(B)不同溫度下對硝基苯酚與FKBP51復合的結合-飽和擬合曲線，293K(●)，303K(■)和310K(▲)。

圖4、FK1域與PNP結合的晶體結構。

圖5、PNP在FK1域上的結合位點構象圖。

圖6、不同物種FKBP51和FKBP52序列比對圖譜。

具體實施方式

下面對本發明以實施例進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例

1、PNP在前列腺癌細胞中的抗癌活性

本發明人經過系統和深入的研究，首次揭示了PNP能夠抑制AR在前列腺細胞中的信號通路。雖然通過基于酵母報告系統檢測和未成熟小鼠的子宮增重實驗以及伯格檢測發現PNP具有抗雄活性，但目前還未有報道PNP在人類細胞有抗雄活性。因為AR介導的信號通路對于前列腺癌細胞的增殖起到重要作用，我們使用了前列腺癌細胞LNCaP和22Rv1作為體內模型檢測PNP在人源細胞的抗雄活性。如圖1所示PNP處理了雄激素(1nM DHT)依賴的LNCaP和22Rv1細胞，隨著PNP的濃度增加，抑制細胞增殖的程度也相應增加。用200μM的PNP處理LNCaP細胞抑制細胞增殖達到33％，同時50uM PNP對22Rv1細胞增殖抑制率為25％。由于LNCaP和22Rv1細胞都能表達內源的AR并且顯示了激素依賴的細胞增殖，因此我們推測PNP也許能夠抑制前列腺癌細胞AR信號通路。對于這個假設，我們通過實時定量PCR實驗檢測AR調控的基因在存在或者不存在PNP的條件下的基因轉錄水平的表達，在這個試驗中，DHT的作用是激活AR信號通路。正如圖2所示，LNCaP細胞在血清饑餓處理后加入30μM的PNP和1nM DHT孵育12小時，AR所調控的五種基因(PSA,FKBP51,KLK2,TMPRSS2,S100P)在PNP處理下相比DHT處理組基因有顯著性下調。因此揭示了，PNP能夠抑制AR在前列腺細胞中的信號通路。

2.FKBP51與PNP結合特性

FKBP51的主要功能區域即FK1區域，將其在大腸桿菌中表達并純化。簡單地說就是將重組蛋白用陽離子交換柱以及分子篩純化，最后一步使用凝膠過濾方法，FK1區域單體存在于溶液中，FK1的純度通過12％SDS-PAGE檢測達到99％，純化的FK1的濃度為50mg/ml，并將其凍于-80℃冰箱存儲。

基于熒光實驗廣泛應用于蛋白與配體相互作用的檢測中，色氨酸殘基在蛋白質的疏水基團中能夠發射熒光，通過它與不同小分子的淬滅來探索蛋白與配體的結合機理。為了研究FK1區域與PNP的相互作用，我們檢測了FK1受到不同濃度的PNP的熒光影響。因為FK1區域只有一個色氨酸，因此我們使用295nm的發射波長激發僅僅只有一個色氨酸。正如圖4A，當FK1濃度固定為10μM時它的熒光強度將隨著PNP的濃度增加而降低。所以這些都說明了PNP能夠結合在FK1的活性口袋中，并且也許改變了FK1區域本來的第90位的色氨酸。

PNP在不同溫度下的結合常數可以根據熒光淬滅的強度計算(圖3B)。當溫度從293K到310K，Kd值顯著增加，說明了PNP與FK1的結合是溫度敏感的(表3)。當達到生理溫度(310K)時PNP的Kd值降低到48μM,說明了PNP的結合也許破壞了FK1區域與它結合的共價分子。

熱力學參數的計算可以被用來描述FK1與PNP相互作用趨勢。蛋白與配體相互作用力共有四種，并且是非共價作用的力，即疏水作用、范德華力、靜電作用以及疏水作用。正如圖3B顯示，在不同溫度298K,303K和308K分別做了定量分析。熱力學參數可以通過不同穩定結合常數值調制Van't Hoff方程來測定。按照Ross et al.(Ross and Subramanian 1981)，ΔH0和ΔS0的正值規則發現，FKBP51蛋白與PNP是通過疏水作用。但是，由于PNP還包含了硝基和羥基，因為氫鍵和靜電作用也不可忽視。

3、PNP與FKBP51結合的結構數據

FK1區域與PNP的復合物的晶體結構測定的分辨率為最終的結構模型可以很好地建立，包括清晰的原子密度、A16 to G139、117、水分子和PNP。這個結構包括五個扭曲的反式平行的β-折疊并由一個短的α-螺旋(圖4A)。PNP的硝基在這個口袋的底部正對著90位的色氨酸吲哚環。這個結果更加讓我們確定熒光淬滅實驗PNP結合在90位的色氨酸附近并且調節FK1區域內僅有的一個色氨酸。PNP硝基氧化與87的異亮氨酸的主鏈N形成氫鍵，O與N的距離是PNP的羥基直接對著溶劑，與68位的天冬氨酸和水分子形成了氫鍵(圖4B)。這種氫鍵結合包括87位的異亮氨酸的酰胺，68位的天冬氨酸側鏈，PNP的硝基和羥基以及水分子，這些氫鍵作用對于FKBP家族配體結合能力是非常重要的，因為這種相似聯系是不斷地通過FKBP-配體復合物而觀察得出的。PNP的結合并不是剛性的，不會顯著地引起FK506結合口袋的構象變化(圖5A)。除了87位的異亮氨酸的主體與水分子的極性相互作用，PNP還與周圍的芳香族氨基酸殘基如Y57,F77,W90,Y113和V86有疏水作用，這些殘基位于口袋的邊緣并且涉及了FK506的結合(圖5B)，對不同物種FKBP51和FKBP52序列比對發現涉及PNP的結合區域是嚴格保守區域(圖6)，這表明在動物體內PNP潛在地靶向FKBP51。