本發明是復合型醫藥材料制備和應用，涉及一種包埋藥物的顆粒型材料，一種靶向性載藥硅質體及制備和應用，是脂質體技術與硅質載體技術的交叉應用。

背景技術：

脂質體具有仿生細胞膜脂質雙層結構，進入體內被網狀內皮系統吞噬而激活機體的自身免疫功能，改變被包封藥物的體內分布、使藥物在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積、從而提高藥物的治療指數、減少藥物治療劑量和降低藥物的毒性。研究表明，脂質體包裹的阿霉素比游離毒性要降低50%~70%。多種脂質體型藥物注射液已經得到FDA批準，如兩性霉素、多柔比星、柔紅霉素和紫衫醇等。然而，脂質體作為藥物載體有著存在穩定性差、制劑成本高等局限性。其脂質表面特性如雙層膜流動性、表面電荷等給制備技術及工業化生產帶來很大難度。脂質體與血漿蛋白之間相互作用容易導致脂質體去穩定化，在包埋一些兩親性藥物時極不穩定。靶向型脂質體，及靶向集團修飾脂質體技術，利用靶向型多肽修飾表面，主動靶向將藥物濃集定位于靶組織、靶器官、靶細胞或細胞內部機構中。靶向性脂質體是指在脂質體表面聯接識別分子（如Lyp-1，cRGD，angiopep-2，RPARPAR，RGERPPR，iNGR等），通過識別分子特異性專一地與靶細胞表面的互補相互作用，將脂質體轉運到靶區釋放藥物。

硅質體材料，即通過溶膠/凝膠法和自組裝過程形成的一種新型運載材料，硅質體中Si的含量低于4%，脂質層中形成一層原子厚度的硅氧網絡結構，增加了穩定性，解決了穩定性差的問題。與脂質體一樣，硅質體具有脂質雙層膜囊泡結構，生物相容性好，并且可以生物降解，不會殘留在生物體內。它不僅可以包埋親水性、親油性藥物，甚至還可兩親性藥物。利用硅質體作為藥物載體可以輸送小分子抗癌藥物、蛋白質藥物、基因以及磁性顆粒等各種不同功能的物質，從而實現多種藥物或多種治療方法的聯合，使之成為診斷癌癥和殺死癌細胞的有力工具。通過調控硅質體表面Si-O-Si的縮合度，可控制內載藥物的釋放速率。研究證明，隨著Si-O-Si縮合度增加，藥物釋放速率降低。

阿霉素（Dox）作為臨床使用頻繁的化療藥物，具有抗癌譜廣、化療指數高，其副作用存在有骨髓移植、惡心、嘔吐、脫發、高熱等癥狀，累計劑量大時會發生心肌壞死甚至充血性心力衰竭。使用二氧化硅材料包埋阿霉素藥物形成的納米藥物具有緩釋功能，延長藥物作用時間，增加在體內的半衰期，保護被包埋的藥物分子不受體內酶的破壞，增強生物相容性等特點。本發明解決的技術問題是靶向脂質體載體穩定性弱，易氧化的問題，提供一種具有靶向指向作用的穩定性好、生物相容性高、緩釋時間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法, 同時工藝簡單、成本低的優點。硅質復合結構克服脂質體不穩定的特點，同時又能發揮靶向性脂質體細胞靶向的功能。

技術實現要素：

本發明針對脂質體包封藥物穩定性的不足，提供一種靶向性載藥硅質體及制備和應用。使用硅酸四乙酯水解后形成的二氧化硅殼層包載水溶性藥物分子，而后靶向性脂質分子物理吸附于藥物顆粒表層形成復合結構，并使其具有特定的組織靶向性。

一種靶向性載藥硅質體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）硅質體原料的合成：

三頸瓶中加入十六烷胺和乙醇溶劑，充分溶解后加入1/2摩爾量的溴代十六烷，加入催化劑無水碳酸鈉，回流120h后停止反應，反復精制得到雙十六烷胺；將雙十六烷胺與琥珀酸酐加入干燥的四氫呋喃中，充分反應24h，濃縮，用氯仿溶解后依次用10%檸檬酸及飽和氯化鈉洗滌分液，溶劑蒸發后得粗產品，然后用乙腈重結晶精制；

（2）靶向性脂質體原料的制備：

將腫瘤細胞穿膜肽溶于PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復合物（DSPE-PEG-MAL），其摩爾當量為腫瘤細胞穿膜肽的0.8倍，溶于二甲基甲酰胺，加入多肽水溶液中，超聲去除氣泡，攪拌反應1小時至DSPE-PEG-Mal反應完全，透析，截留分子量3500Da，透析介質為水，去除過量的腫瘤細胞穿膜肽和DMF，冷凍干燥，得到腫瘤細胞穿膜肽-PEG-DSPE材料；

（3）靶向性脂質插入硅質復合體的制備：

將處方的摩爾組成為硅質材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉蒸發去除溶劑，加水溶液至脂質膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉震蕩，得脂質體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的靶向性硅質體；載藥時，將處方的摩爾組成為硅質材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉蒸發去除溶劑，再加入多柔比星等藥物，加水溶液至脂質膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉震蕩，得脂質體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到載藥型粒徑大小均勻的靶向性硅質體。

所述的腫瘤細胞穿膜肽為Lyp-1，cRGD，angiopep-2，RPARPAR，RGERPPR，iNGR中的一種或其組合。

腫瘤細胞穿膜肽為多種類型以針對不同腫瘤細胞，具體為腦膠質瘤細胞、胰腺癌細胞、乳腺癌細胞和前列腺癌細胞中的一種。

一種靶向性載藥硅質體，其特征在于，根據上述任一所述方法制備得到。

一種靶向性載藥硅質體的應用。

本發明解決的技術問題是克服靶向性脂質體穩定性弱，易氧化的問題。靶向脂質體復合硅質體包載阿霉素，提供一種具有靶向指向作用的穩定性好、生物相容性高、緩釋時間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法, 同時工藝簡單、成本低的優點。

是脂質體技術與無機顆粒載體技術的交叉應用。通過將合成硅質體材料與靶向脂質體材料復合，硅質水解于藥物外部形成殼層，隨后將含有不同靶向基團的脂質體形成外殼層，此復合機構實現針對不同腫瘤組織靶向。本發明提供一種具有靶向指向作用的穩定性好、生物相容性高、緩釋時間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法。

本發明有如下優勢：該方法使用的硅質材料水化后形成穩定SiO2為內殼層，增強藥物的穩定性，同時具有藥物緩釋效果；靶向性脂質體作為外殼層包覆于SiO2@DOX外層，賦予特異性的細胞靶向性。操作簡便，成本低，容易工業化實現；

本復合結構具有高生物相容性，也可包裹CdS量子點等發光材料，輕易實現靶向組織熒光成像。

附圖說明

圖1為實施例1,2所得的硅質體SEM照片。

圖2為實施例3,4所得的靶向脂質/硅質體TEM照片。

圖3為實施例1,2,3,4所得的共聚焦U87MG和NIH3T3細胞吞噬照片。

圖4為實施例2,4所得24小時載阿霉素對U87MG的殺傷率。

圖5為實施例1,3載體材料對NIH3T3的生存率。

具體實施方式

以下通過具體的實施例對本發明的技術方案作進一步描述。以下的實施例是對本發明的進一步說明，而不限制本發明的范圍。

實施例1：

純硅質體：采用薄膜水化法制備硅質體，稱取3mg 硅質材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉蒸發干以后加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到硅質體懸液。將硅質體懸液稀釋滴在鋁箔干燥后，形貌SEM照片如圖。

實施例2：

純硅質體@阿霉素：采用薄膜水化法制備硅質體，稱取3mg 硅質材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉蒸發干以后，加入一定量的阿霉素溶液（硅質：阿霉素摩爾比為30:1）到圓底燒瓶中，緩慢旋轉蒸發（55攝氏度水浴，90r/min）除去溶劑，加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到硅質體@阿霉素懸液，將懸液加入離心管中，在6000rpm下離心10min，透析。除去硅質體中未包裹的游離阿霉素。所得懸液室溫避光過夜使之形成硅酸鹽網絡，4攝氏度冰箱避光保存待用。

實施例3：

靶向性硅質: 采用薄膜水化法制備硅質體，將處方的摩爾組成為硅質材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉蒸發去除溶劑。稱取3mg 上述材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉蒸發干以后加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到靶向硅質體懸液。

實施例4：

靶向性硅質@阿霉素: 采用薄膜水化法制備靶向性硅質體@阿霉素，將處方的摩爾組成為硅質材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉蒸發去除溶劑。純硅質體@阿霉素：采用薄膜水化法制備硅質體，稱取3mg 硅質材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉蒸發干以后，加入一定量的阿霉素溶液（硅質：阿霉素摩爾比為30:1）到圓底燒瓶中，緩慢旋轉蒸發（55攝氏度水浴，90r/min）除去溶劑，加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到硅質體@阿霉素懸液，將懸液加入離心管中，在6000rpm下離心10min，透析。除去硅質體中未包裹的游離阿霉素。所得懸液室溫避光過夜使之形成硅酸鹽網絡，4攝氏度冰箱避光保存待用。

硅質體及靶向型硅質體納米粒子的形貌考察：將實施例1,2,3,4制得的硅質體，硅質體@阿霉素、靶向硅質體和靶向硅質體@阿霉素的照片，可以看到尺寸均分布在100-300nm之間如圖1,2 所示。

納米粒子的體外靶向性考察：在無血清培基中(200μL)，將實施例1,3 制得的具有熒光發光性能普通硅質體₂@阿霉素，和靶向硅質體@阿霉素分別與靶向性細胞U87mg (10⁵/mL)在CO₂孵育箱下25℃孵育24 hour ；然后用800μL 的PBS溶液液離心清洗細胞兩次，將非特異性吸附在細胞表面的納米顆粒清除；第二次離心后，用200μL 的PBS 重新將細胞分散并在在激光共聚焦顯微鏡下觀察普通硅質體₂@阿霉素，和靶向硅質體@阿霉素, 對靶向性細胞U87mg的識別情況，其觀察結果如圖3所示。普通硅質材料，對U87mg細胞的吞噬率為45%，靶向硅質體對細胞的吞噬率為90%；這說明實施例3中修飾到硅質體表面的穿模肽會增強U87mg細胞攝取的EPR效應。

硅質體對腫瘤細胞靶向殺傷效果的評價：參照實施例2, 4 的步驟制備普通硅質體₂@阿霉素和靶向硅質體@阿霉素。為考察其選擇性殺傷效果，選取對U87mg細胞，以2×10⁴個細胞/ 孔的濃度接種于96 孔細胞培養板內( 每孔100μL 培基)，加入10μL 不同濃度的藥物材料，在無血清培基中37℃、5％的CO₂條件下孵育32小時；共孵育后75μL 無血清培養基溶液去除，補充含10％血清的新鮮培基至100μL，繼續培養4h ；10μL Cell Counting Kit 單溶液細胞增殖檢測試劑盒加入每孔，孵育4h ；直接在酶標儀490nm 處讀數據，計算出細胞在不同濃度作用下的存活率。由圖4 可見，游離阿霉素藥物、普通硅質體₂@阿霉素，和靶向硅質體@阿霉素在1～ 50μnmol 的濃度范圍內U87mg細胞的影響。隨著藥物濃度增大，細胞的存活率呈下降趨勢，細胞殺傷率高低順序依次為阿霉素 > 靶向硅質體@阿霉素 > 硅質體@阿霉素。

硅質體安全性評價：參照實施例1,3 的步驟制備普通硅質體₂、脂質體和靶向硅質體。為考察其選擇性殺傷效果，選取對NIH3T3細胞，以2×10⁴個細胞/ 孔的濃度接種于96 孔細胞培養板內( 每孔100μL 培基)，加入10μL 不同濃度的藥物材料，在無血清培基中37℃、5％的CO₂條件下孵育32小時；共孵育后75μL 無血清培養基溶液去除，補充含10％血清的新鮮培基至100μL，繼續培養4h ；10μL Cell Counting Kit 單溶液細胞增殖檢測試劑盒加入每孔，孵育4h ；直接在酶標儀490nm 處讀數據，計算出細胞在不同濃度作用下的存活率。由圖5 可見，細胞的存活率無明顯趨勢，說明硅質體載體材料安全性高。