本申請是申請日為2012年4月11日、發明名稱為“用于治療或預防瘧疾的瘧原蟲表面陰離子通道抑制劑”的中國專利申請no.201280028801.8的分案申請。對相關申請的交叉引用本專利申請要求2011年4月12日提交的美國臨時專利申請號61/474,583的權益，其通過引用整體并入本文。通過引用并入電子提交的材料在本文中通過引用整體并入計算機可讀的核苷酸/氨基酸序列表，其與本文同時提交，并如下識別：一個名稱為“709937st25.txt”的84,990字節ascii(文本)文件，日期為2012年3月6日。
背景技術：
：：瘧疾，是世界上最重要的傳染病之一，是通過蚊子傳播的，并且由4種瘧原蟲(plasmodium)寄生蟲(惡性瘧原蟲(p.falciparum)、間日瘧原蟲(p.vivax)、卵形瘧原蟲(p.ovale)、三日瘧原蟲(p.malariae))引起。癥狀包括發燒、寒戰、頭疼、肌肉疼、疲勞、惡心和嘔吐、腹瀉、貧血和黃疸。還可能發生抽搐、昏迷、嚴重貧血和腎衰竭。其保持為全球主要的死亡原因，特別是在5歲以下的非洲兒童中的主要死亡原因。盡管在流行地區在許多年內的重復感染導致部分的免疫性，但是這些成年人仍遭受顯著的發病率和勞動力的喪失。在非洲每年由于瘧疾導致的損失估計為120億美元。目前對于瘧疾沒有可用的有效疫苗。因此，治療主要依賴于抗瘧藥，如氯喹。因為一些瘧疾寄生蟲對于每種可用的抗瘧藥具有獲得性的耐受性，所以需要發現和研發新的抗瘧藥。技術實現要素：本發明提供了治療或預防瘧疾的方法，其包括：給動物施用有效量的式i的化合物。也提供了抑制動物中的寄生蟲的瘧原蟲表面陰離子通道的方法。本發明也提供了藥物組合物，其包含與一種或多種抗瘧疾化合物相組合的由式i表示的化合物，例如，由式ii、v和vi表示的那些。也提供了所述藥物組合物用于在動物(包括人類)中治療或預防瘧疾或用于抑制瘧原蟲表面陰離子通道的用途。預見到，本發明的化合物和/或藥物組合物會通過任意數目的機制抑制瘧原蟲表面陰離子通道和/或治療或預防瘧疾，例如，通過抑制寄生蟲clag3基因家族的一個或多個成員。本發明的化合物的實施方案具有一個或多個優點，包括、但不限于：對所述離子通道的高親和力，對所述離子通道的高特異性，沒有細胞毒性或低細胞毒性，不同于現有抗瘧藥的化學結構，和藥物樣特征。本發明也提供了clag3氨基酸序列和有關的核酸、載體、宿主細胞、細胞群體、抗體和藥物組合物。本發明也提供了治療或預防動物中的瘧疾的方法和在動物中刺激針對寄生蟲的瘧原蟲表面陰離子通道的免疫應答的方法，所述方法包括：給所述動物施用有效量的本發明的clag3氨基酸序列和有關的核酸、載體、宿主細胞、細胞群體、抗體和藥物組合物。附圖說明圖1的圖顯示了使用指定濃度的ispa-28(μm)時山梨醇誘導的等位基因交換克隆hb33rec隨時間(分鐘)的滲透性裂解動力學(裂解百分比)，所述ispa-28是根據本發明的一個實施方案的化合物(參見下面段落[0033]中的式a)。圖2的圖顯示了平均值±均值標準差(s.e.m)。hb33rec的ispa-28劑量(μm)-應答(標準化的p)(圓圈)。該劑量應答是hb3和dd2的劑量應答(分別是頂部和底部的實線)之間的中間值。圖3a的圖顯示了在plm培養基中的dd2(空心三角形)或hb3(實心圓圈)隨ispa-28濃度(μm)而變化的存活百分比。實線代表與雙因素(two-component)指數式衰減的最佳擬合。圖3b的圖顯示了3μmispa-28對指定的親本系和后代克隆的寄生蟲生長抑制百分比的平均值±均值標準差。圖4a的圖顯示了下述情況下的psac抑制的ispa-28劑量應答的平均值±均值標準差：在7c20系的運輸選擇之前(b)和之后(c)，隨后進行plm生長選擇(a)。圖4b的圖顯示了下述情況下的2個clag3等位基因clag3.1和clag3.2的表達比：在7c20系的(運輸)選擇之前(未選擇)和之后，隨后進行plm生長選擇(生長)。條代表2-4個單獨試驗各自的重復的平均值±均值標準差。圖5a的圖顯示了dd2-plm28系中的psac抑制的ispa-28劑量應答(黑色圓圈，最多5次測量各自的平均值±均值標準差)。實線反映了7c20中的clag3.1和clag3.2表達的劑量應答(分別是頂部和底部線)。圖5b的圖顯示了使用ispa-28(plm28-rev)，在clag3.1的基于運輸的選擇之前和之后，在對數標度上呈現的定量dd2-plm28中的clag3和嵌合基因的相對表達的比率。具體實施方式在惡性虐原蟲在人紅細胞(rbc)中大約48小時的周期過程中，惡性虐原蟲必須增加紅細胞(rbc’s)對寬范圍溶質的滲透性。電生理學研究鑒定瘧原蟲表面陰離子通道(psac)是這些變化的分子機制。psac的功能特征不同于那些已知的人離子通道。這些特征包括非典型的門控(gating)、獨特的藥理學、和無比的選擇性特性。罕見的特征是，盡管所述通道對陰離子和體積大的營養物的寬泛滲透性，但是psac具有相對于cl-大于100,000-倍排出na+的能力。在其它寬泛選擇性通道中尚未報道這種單一小溶質的外排水平；這對于寄生蟲存活是重要的，因為更高的na+滲透性將在高na+血清中產生感染的rbcs的滲透性溶解。psac在寄生蟲營養物獲取中起重要作用。通過psac，糖、氨基酸、嘌呤、維生素、和磷脂生物合成的前體顯著增加地被攝入到感染的rbcs中。這些溶質中的多種在未感染的rbcs中具有可以忽略的滲透性，并且必須由外界提供以在體外維持寄生蟲生長。如通過感染了嚙齒動物、鳥類、和靈長動物瘧疾寄生蟲的紅細胞研究所確定的那樣，psac在不同瘧原蟲物種中是保守的。通道的門控、電壓依賴性、選擇性、和藥理學均是保守的，這表明psac是高度約束的(constrained)完整膜蛋白。其在紅細胞膜上的表面位置賦予相對于埋藏在被感染的rbc內的寄生蟲靶標的概念上的優點。psac在被感染的rbcs上的暴露位置迫使直接接近血清中的拮抗劑，并且通過藥物排出排斥抗性。相反，在寄生蟲區室內起作用的藥物必須穿過至少三層膜障礙才能到達其靶標；針對氯喹和甲氟喹(mefloquine)的臨床耐藥性似乎與由其作用位點的外排相關。幾乎所有可用的psac拮抗劑在體外以適當高于通道抑制所需要的那些濃度的濃度抑制寄生蟲生長。通過clag3瘧原蟲基因家族的成員，可以確定psac-抑制劑相互作用。clag3.1(也被稱作rhoph1(3.1)和pfc0120w)和clag3.2(也被稱作rhoph1(3.2)和pfc0110w)是惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲中的clag多基因家族保守成員。clag3.1和clag3.2位于惡性瘧原蟲染色體3上。clag3.1基因序列由genbank登記號124504714和xm_001351064(seqidno:1)表示。seqidno:1闡述了不含非翻譯區的clag3.1基因的mrna序列。clag3.1基因的蛋白產物(被稱作細胞粘連相關的無性蛋白3.1)的序列由genbank登記號xp_001351100和cab10572.2(seqidno:2)表示。clag3.2基因序列由genbank登記號124504712和xm_001351063(seqidno:3)表示。seqidno:3闡述了不含非翻譯區的clag3.2基因的mrna序列。clag3.2基因的蛋白產物(被稱作細胞粘連相關的無性蛋白3.2)的序列由genbank登記號xp_001351099和124504713(seqidno:4)表示?；诳傻玫降淖C據，clag3.1和clag3.2編碼寄生蟲psac。本發明也提供了一種嵌合的clag3.1/clag3.2基因。seqidno:79闡述了不含非翻譯區的嵌合的clag3.1/clag3.2基因的mrna序列，seqidno:78闡述了嵌合的clag3.1/clag3.2基因的蛋白產物。seqidno:78的氨基酸殘基1-1011對應于clag3.1蛋白seqidno:2的氨基酸殘基1-1011。seqidno:78的氨基酸殘基1012-1417對應于clag3.2蛋白seqidno:4的氨基酸殘基1014-1416?；诳傻玫降淖C據，嵌合的clag3.1/clag3.2基因編碼寄生蟲psac。因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種治療或預防動物中的瘧疾的方法，所述方法包括：給所述動物、優選人施用有效量的式(i)的化合物或其藥學上可接受的鹽：q-y-r1-r2(i)，其中：q選自：與芳基稠合的二氧代雜環、與雜環基團連接的雜環酰氨基、烷基、與雜環酰氨基稠合的雜環基團、芳氨基羰基、氨基、雜環酰氨基和雜環氨基，除了氨基以外，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲?；粂是鍵、s、so2或酰氨基；r1是選自下述的二價基團：具有至少一個氮原子的雜環、哌啶基、哌嗪基、芳基、具有至少一個與烷基氨基連接的氮原子的雜環、苯并稠合雜環基、與亞氨基四氫嘧啶(pyrimidino)基團稠合的雜環基、和與雜環酰氨基稠合的雜環基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲?；籸2選自：芳基烯基、雜環基羰基氨基、雜環基烷基氨基、四氫喹啉基烯基、四氫異喹啉基烷基、吲哚基烯基、二氫吲哚基烯基、芳基、芳氧基烷基、芳基烷基、二唑基和喹啉基烯基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基。本發明的另一個實施方案提供了一種抑制動物中的寄生蟲的瘧原蟲表面陰離子通道的方法，所述方法包括：給所述動物、優選人施用有效量的式(i)的化合物或其藥學上可接受的鹽：q-y-r1-r2(i)，其中q、y、r1和r2如上面所定義。本發明的另一個實施方案提供了用于治療或預防動物、優選人的瘧疾的式(i)的化合物或其藥學上可接受的鹽：q-y-r1-r2(i)，其中q、y、r1和r2如上面所定義。本發明的另一個實施方案提供了用于抑制動物、優選人中的寄生蟲的瘧原蟲表面陰離子通道的式(i)的化合物或其藥學上可接受的鹽：q-y-r1-r2(i)，其中q、y、r1和r2如上面所定義。本發明的另一個實施方案提供了式(i)的化合物或其藥學上可接受的鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預防動物、優選人的瘧疾：q-y-r1-r2(i)，其中q、y、r1和r2如上面所定義。本發明的另一個實施方案提供了式(i)的化合物或其藥學上可接受的鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制動物、優選人中的寄生蟲的瘧原蟲表面陰離子通道：q-y-r1-r2(i)，其中q、y、r1和r2如上面所定義。根據本發明的一個實施方案，式i中的q選自：二氧代四氫喹喔啉基、噠嗪基雜環基、烷基、雜環基噠嗪基和芳氨基羰基烷基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲?；?。根據本發明的一個實施方案，式i中的r1選自：哌啶基、哌嗪基、哌啶基烷基氨基、苯并噻唑基、與亞氨基四氫嘧啶基團稠合的噻唑基和與噠酮稠合的噻唑基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲?；?。根據本發明的一個實施方案，式i中的r2選自：烷基芳基烯基、噻吩基羰基氨基、四氫喹啉基烯基、四氫異喹啉基烷基、烷氧基芳基、芳基、芳氧基烷基和芳基烷基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲?；?。根據本發明的一個實施方案，式i中的y是so2。例如，式i中的q選自(在這里和在本申請的別處用波浪線表示連接點)：甲基和異丁基。根據本發明的一個實施方案，式i中的r1選自：根據本發明的一個實施方案，r2選自：根據上述實施方案中的任一個，式i的化合物是：根據本發明的一個實施方案，式i中的y是s。例如，根據本發明的一個實施方案，式i中的q選自：根據本發明的一個實施方案，式i中的r1選自：根據本發明的一個實施方案，式i中的r2選自：根據本發明的一個實施方案，式i的化合物是：根據本發明的一個實施方案，式i的y是鍵。例如，在本發明的一個實施方案中，式i的化合物是:根據本發明的一個實施方案，式(i)的y是酰氨基。根據本發明的一個實施方案，q是雜環酰氨基，r1是具有至少一個氮原子的雜環，且r2是二唑基。例如，在本發明的一個實施方案中，式i的化合物是：ispa-28。在本發明的一個實施方案中，所述化合物抑制惡性瘧原蟲dd2的生長。本發明的另一個實施方案提供了一種藥物組合物，其包含：i)式(i)的化合物或其藥學上可接受的鹽：q-y-r1-r2(i)，其中：q選自：與芳基稠合的二氧代雜環、與雜環基團連接的雜環酰氨基、烷基、與雜環酰氨基稠合的雜環基團、芳氨基羰基、氨基、雜環酰氨基和雜環氨基，除了氨基以外，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；y是鍵、s、so2或酰氨基；r1是選自下述的二價基團：具有至少一個氮原子的雜環、哌啶基、哌嗪基、芳基、具有至少一個與烷基氨基連接的氮原子的雜環、苯并稠合雜環基、與亞氨基四氫嘧啶基團稠合的雜環基、和與雜環酰氨基稠合的雜環基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；r2選自：芳基烯基、雜環基羰基氨基、雜環基烷基氨基、四氫喹啉基烯基、四氫異喹啉基烷基、吲哚基烯基、二氫吲哚基烯基、芳基、芳氧基烷基、芳基烷基、二唑基和喹啉基烯基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、巰基、烷氧基、烷硫基、硝基、氰基、氨基、烷基、羥基烷基、鹵代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、羧基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、脲基和甲酰基；和ii)至少一種其它抗瘧疾化合物。所述抗瘧疾化合物可以是任意合適的抗瘧疾化合物，且可以通過任意機制起作用，且可以例如在任意位點抑制psac。在本發明的一個實施方案中，所述抗瘧疾化合物是青蒿素、甲氟喹、氯喹或其衍生物。在本發明的一個實施方案中，所述至少一種其它抗瘧疾化合物是一種或多種選自下述的化合物：a)式ii的化合物或其藥學上可接受的鹽：其中r100是氫或烷基，且r200是芳基烷基，其任選地在所述芳基上被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；或r200是式(iii)的基團：其中n＝0-6；或者r100和r200與它們所連接的n一起形成式iv的雜環：其中x是n或ch；且y1是芳基、烷基芳基、二烷基芳基、芳基烷基、烷氧基芳基或雜環基，其任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基；且r3-r10是氫或烷基；(b)式v的化合物或其藥學上可接受的鹽：其中z是具有一個或多個4-7元環的基團，其中至少一個所述環具有至少一個選自o、s和n的雜原子；且當存在兩個或更多個4-7元環時，所述環可以是稠合的或未稠合的；其中所述環任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲?；籸a是氫、烷基或烷氧基；l是鍵、烷基、烷氧基、(ch2)r或(ch2o)s，其中r和s獨立地是1-6；q1是雜環基團、芳基或雜環基芳基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲?；磺耶攍是烷基或烷氧基時，q1不存在；和(c)式vi的化合物或其藥學上可接受的鹽：其中r11和r12獨立地是氫、烷基、環烷基或芳基，其任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：烷基、烷氧基、鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲?；?；r13-r15獨立地選自：烷基、鹵素、烷氧基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲?；Ｔ谶@點上，在本發明的一個實施方案中，所述藥物組合物包含與一種或多種在美國專利申請公開號2011/0144086(它是2009年7月15日提交的公開為wo2010/011537的pct/us09/50637的美國國家階段申請)(它們各自通過引用并入本文)中公開的化合物相組合的至少一種式i的化合物。根據本發明的一個實施方案，所述藥物組合物包含式i的化合物和以下的任意一種或多種：本發明的另一個實施方案提供了一種治療或預防動物的瘧疾的方法，所述方法包括：給所述動物施用有效量的式i的化合物和至少一種其它抗瘧疾化合物。在一個實施方案中，所述至少一種其它抗瘧疾化合物是一種或多種選自以下的化合物：式ii的化合物、式v的化合物和式vi的化合物。本發明的另一個實施方案提供了一種抑制動物中的寄生蟲的瘧原蟲表面陰離子通道的方法，所述方法包括：給所述動物施用有效量的式i的化合物和一種或多種選自以下的化合物：式ii的化合物、式v的化合物和式vi的化合物。現在參考本文一般所用的術語，術語“烷基”是指直鏈或支鏈的烷基結構部分，例如，其包含1-12個碳原子，優選1-8個碳原子，更優選1-6個碳原子。所述結構部分的實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、辛基、十二烷基等。術語“芳基”是指未取代的或取代的芳香族碳環結構部分，如本領域常規所理解那樣，并且包括單環或多環芳香族化合物，諸如例如，苯基、聯苯基、萘基、蒽基、芘基等。例如，芳基結構部分通常包含6-30個碳原子，優選地6-18個碳原子，更優選地6-14個碳原子，最優選地6-10個碳原子。應該理解，術語芳基包括這樣的碳環結構部分，所述碳環結構部分是平面的，且包括4n+2π電子，依據hückel’s法則，其中n＝1、2或3。術語“雜環”意指具有選自氮、硫、和/或氧的一個或多個雜原子的環形結構部分。優選地，雜環是5元或6元單環，并且包含選自氮、氧、和/或硫的一個、兩個或三個雜原子。所述雜環的實例為吡咯啉基、吡喃基、哌啶基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、和嗎啉基。術語“烷氧基”包括連接在醚氧上的直鏈或支鏈的烷基基團。所述烷基與本文所述相同。所述取代基的實例包括甲氧基、乙氧基、叔-丁氧基等。術語“鹵素”用在本文中意指選自viia族的取代基，諸如例如，氟、溴、氯和碘。為了本發明的目的，術語“稠合的”包括這樣的多環化合物，其中一個環包含與一個或多個其它環共同的一個或多個原子，優選一個、兩個或三個原子。當指示了結構中原子數目的范圍時(例如，c1-12、c1-8、c1-6或c1-4烷基、烷基氨基等)，特別考慮落入所指定范圍內的任何子范圍或單個碳原子數目也是可以使用的。因此，例如，關于本文所述的任何化學基團(例如，烷基、烷基氨基等)提及1-8個碳原子(例如，c1-c8)、1-6個碳原子(例如，c1-c6)、1-4個碳原子(例如，c1-c4)、1-3個碳原子(例如，c1-c3)或2-8個碳原子(例如，c2-c8)的范圍，包括且特別描述適當的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12個碳原子，及其任一子范圍(例如，適當地，1-2個碳原子、1-3個碳原子、1-4個碳原子、1-5個碳原子、1-6個碳原子、1-7個碳原子、1-8個碳原子、1-9個碳原子、1-10個碳原子、1-11個碳原子、1-12個碳原子、2-3個碳原子、2-4個碳原子、2-5個碳原子、2-6個碳原子、2-7個碳原子、2-8個碳原子、2-9個碳原子、2-10個碳原子、2-11個碳原子、2-12個碳原子、3-4個碳原子、3-5個碳原子、3-6個碳原子、3-7個碳原子、3-8個碳原子、3-9個碳原子、3-10個碳原子、3-11個碳原子、3-12個碳原子、4-5個碳原子、4-6個碳原子、4-7個碳原子、4-8個碳原子、4-9個碳原子、4-10個碳原子、4-11個碳原子和/或4-12個碳原子)。根據本發明的一個實施方案，式ii中的r3是氫。根據上述實施方案，式ii中的r4-r7是氫。在一個實施例中，式ii中的r100是氫，且r200是式iii的基團，其中n＝1-6，優選地n＝2-4。根據本發明的一個實施方案，其中r100和r200與它們所連接的n一起形成式iv的雜環。例如，式iv中的x是n。根據本發明，在式iv中，y1是任選地被一個或多個取代基取代的芳基，所述取代基選自：鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基、烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲?；＠?，在式iv中，y1是任選地被一個或多個取代基取代的苯基，所述取代基選自：鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基、烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲?；唧w地，y1是苯基或被一個或多個取代基取代的苯基，所述取代基選自：甲基、氯代、氟代和甲氧基。根據上述實施方案中的任一個，所述式ii的化合物是：根據本發明的另一個實施方案，式iv中的x是ch。在一個特定實施方案中，y1是芳基烷基或雜環，其任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲?；?。示例性地，y1是芐基或哌啶基，其任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。式ii的具體化合物的例子是：在本發明的另一個實施方案中，式ii中的r100是氫，且r200是芳基烷基，其任選地在所述芳基上被取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基和甲?；?。作為一個例子，r200是芳基烷基，例如，苯基烷基諸如苯基丁基。這樣的式ii的化合物的一個具體例子是：根據本發明的一個實施方案，式iii的化合物的一個具體例子是：根據本發明的另一個實施方案，在式v的化合物中，l是鍵或(ch2o)s，且q1是雜環基團、芳基或雜環基芳基，它們中的每一個任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。根據一個實施方案，其中z是具有一個或多個4-7元環的基團，其中至少一個所述環具有至少一個選自o、s和n的雜原子；且當存在兩個或更多個4-7元環時，它們可以是稠合的或未稠合的；其中所述環任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。在上面的實施方案中，z是具有一個或兩個4-7元環的基團，其中至少一個所述環具有至少一個選自o、s和n的雜原子；且當存在兩個4-7元環時，它們可以是稠合的或未稠合的；其中所述環任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：鹵素、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、烷基、氨基烷基、烷基氨基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。在式v的一個具體實施方案中，q1是任選地被烷氧基取代的芳基，或q1是飽和的或不飽和的雜環基團。例如，q1是芳基諸如苯基或萘基。式iv的化合物的例子是：根據本發明的一個實施方案，在式v的化合物中，q1是雜芳族基團，例如，吡啶基。這樣的化合物的一個例子是：根據本發明的另一個實施方案，在式v的化合物中，l是烷基，且q1不存在。這樣的化合物的例子是：根據本發明的另一個實施方案，在式vi的化合物中，r13是烷基或烷氧基，且r14和r15是氫。在一個特定實施方案中，r13是甲基或甲氧基。在式vi的化合物的以上實施方案中，具體地，r11是烷基，且r12是烷基、環烷基或芳基，其中所述芳基任選地被一個或多個取代基取代，所述取代基選自：烷基、烷氧基、鹵素、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基和甲酰基。在一個特定實施方案中，r12是烷基、環烷基或芳基，其中所述芳基任選地被一個或多個烷基和/或烷氧基取代基取代。式vi的化合物的例子是：根據本發明的一個實施方案，在式vi的化合物中，r11是氫，且r12是環烷基或芳基，其任選地被一個或多個烷基和/或烷氧基取代基取代。示例性的式vi的化合物是：根據本發明，將有效量的式i的化合物與任意一種或多種式ii、v和vi的化合物組合施用，例如，施用下述組合：式i和ii的化合物，式i和v的化合物，式i和vi的化合物，式i、ii和v的化合物，式i、ii和vi的化合物，式i、v和vi的化合物，或式i、ii、v和vi的化合物，或其藥學上可接受的鹽。預見到，當采用2種或更多種化合物的組合時，這樣的組合會提供協同作用，即增強的寄生蟲殺死。所述殺死程度大于單一殺死的總和。本發明的化合物可以通過本領域技術人員已知的適當方法制備，或者通過商購來源獲得，諸如從加州圣地亞哥的chemdiv公司(chemdivinc.,sandiego,ca)或英國highpeak的peakdale分子有限公司(peakdalemolecularlimited,highpeak,england)獲得。還參見wo00/27851和美國專利號6,602,865和2,895,956。本發明的另一個實施方案提供了包含seqidno:62、64、66、72、74或76、由其組成或基本上由其組成的clag3氨基酸序列，前提條件是，所述氨基酸序列不是seqidno:2、4或78。seqidno:62、64、66、74和76對應于3d7寄生蟲系的clag3.1蛋白的氨基酸殘基1063-1208、1232-1417、25-332、488-907和925-1044。seqidno:72對應于dd2寄生蟲系的clag3.1蛋白的氨基酸殘基1063-1244。seqidno:62、64、66、72、74和76分別由核苷酸序列seqidno:63、65、67、73、75和77編碼。在這點上，本發明的一個實施方案提供了包含seqidno:62、64、66、72、74或76、由其組成或基本上由其組成的clag3氨基酸序列，前提條件是，所述氨基酸序列不是seqidno:2、4或78。本發明的另一個實施方案提供了一種核酸，其包含編碼本發明的氨基酸序列的核苷酸序列，前提條件是，所述核苷酸序列不是seqidno:1、3或79。例如，所述核苷酸序列包含seqidno:63、65、67、73、75或77、由其組成或基本上由其組成。本發明的其它實施方案提供了一種包含本發明的核酸的重組表達載體，一種分離的包含本發明的重組表達載體的宿主細胞，包含本發明的宿主細胞的細胞群體，和特異性地結合本發明的氨基酸序列的抗體或其抗原結合部分?？梢苑蛛x或純化本發明的氨基酸序列、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群體和/或抗體或其抗原結合部分。本發明的另一個實施方案提供了一種藥物組合物，其包含：本發明的氨基酸序列、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群體和/或抗體或其抗原結合部分；和藥學上可接受的載體。本發明的另一個實施方案提供了一種治療或預防動物的瘧疾的方法，所述方法包括：給所述動物施用有效量的本發明的氨基酸序列、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群體、抗體或其抗原結合部分和/或藥物組合物。本發明的另一個實施方案提供了一種在動物中刺激針對寄生蟲的瘧原蟲表面陰離子通道的免疫應答的方法，所述方法包括：給所述動物施用有效量的本發明的氨基酸序列、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群體、抗體或其抗原結合部分和/或藥物組合物。在一個實施方案中，刺激免疫應答包括：刺激特異性地結合瘧原蟲表面陰離子通道的抗體的產生。本文所述的藥學上可接受的載體，例如，媒介物(vehicles)、佐劑、賦形劑、或稀釋劑，是本領域技術人員公知的，并且是公眾容易獲得的。優選地，所述藥學上可接受的載體應該是對于活性化合物是化學惰性的一種載體和在使用條件下沒有有害的副作用或毒性的一種載體。載體的選擇是由具體的活性試劑以及由用于施用組合物的具體方法所確定。因此，存在很多種適當的本發明藥物組合物的制劑。下述用于口服、氣溶膠、腸胃外、皮下、靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內、鞘內、直腸、和陰道施用的制劑僅是示例性的，并且決不是限制性的。適于口服施用的制劑可以由下列組成：(a)液體溶液,如溶解在稀釋劑如水、鹽水或橙汁中的有效量的化合物；(b)膠囊,小香囊,片劑,錠劑,和藥片，其每種包含作為固體或顆粒的預定量的活性成分；(c)粉劑；(d)在適當液體中的混懸液；和(e)適當的乳劑。液體制劑可以包括稀釋劑，諸如水和醇類，例如，乙醇、苯甲醇、和聚乙烯醇，具有或不具有添加的藥學上可接受的表面活性劑、混懸劑或乳化劑。膠囊形式可以是普通的硬殼或軟殼明膠型，例如，其包含表面活性劑、潤滑劑、和惰性填充劑，所述填充劑如乳糖、蔗糖、磷酸鈣和玉米淀粉。片劑形式可以包括下列中的一種或多種：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸、微晶纖維素、阿拉伯樹膠、明膠、瓜耳膠、膠狀二氧化硅、交聯羧甲纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸、和其它賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、崩解劑、潤濕劑、防腐劑、調味劑、和藥學相容載體。錠劑形式可以包括在調味劑(通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃原膠)中的活性成分，以及軟錠劑，所述軟錠劑包括在惰性基質中的活性成分，所述惰性基質如明膠或甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠，乳劑，凝膠等，其除包含活性成分之外還包含本領域已知的所述載體。本發明的化合物，單獨或與其它適當的成分組合，可以制成通過吸入施用的氣溶膠制劑。這些氣溶膠制劑可以放置在加壓可用的推進劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等中。它們還可以被配制成用于非加壓制劑的藥物，如在噴霧器或霧化器中。適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性、等滲無菌注射液，其可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使所述制劑與目的接受者血液等滲的溶質，和包括水性和非水性無菌混懸液，其可以包括混懸劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、和防腐劑。所述化合物可以在藥用載體中在生理可用的稀釋劑中施用，如無菌液體或液體混合物，其包括水、鹽水、水性葡萄糖和相關糖溶液，醇，如乙醇、異丙醇、或十六醇，二醇，如丙二醇或聚乙二醇，甘油縮酮，諸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-甲醇,醚,如聚(乙二醇)400,油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加藥學上可接受的表面活性劑，如皂或去污劑，混懸劑，諸如果膠，卡波姆，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或羧甲基纖維素，或乳化劑和其它藥用佐劑。可以用在腸胃外制劑中的油包括石油、動物油、植物油或合成的油。油的具體實例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄欖油、凡士林和礦物油。適用于腸胃外制劑中的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和異硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯是適當的脂肪酸酯的實例。適用于腸胃外制劑中的皂類包括脂肪堿金屬、銨、和三乙醇胺鹽，適當的去污劑包括(a)陽離子去污劑，諸如例如，二甲基二烷基銨鹵化物,和烷基吡啶鎓鹵化物,(b)陰離子去污劑,諸如例如，烷基、芳基、和烯屬磺酸鹽,烷基、烯屬、醚和單酸甘油酯硫酸鹽,和磺基丁二酸鹽,(c)非離子去污劑，諸如例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸鏈烷醇酰胺,和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物,(d)兩性去污劑，諸如例如，烷基-β-氨基丙酸酯，和2-烷基-咪唑啉季銨鹽,和(3)它們的混合物。腸胃外制劑典型地在溶液中包含約0.5-約25重量％的活性成分。在所述制劑中可以使用適當的防腐劑和緩沖劑。為了最小化或消除在注射部位的刺激，所述組合物可以包含一種或多種具有約12-約17的親水性-親脂性平衡(hlb)的非離子表面活性劑。在所述制劑中，表面活性劑的量在約5-約15重量％范圍內。適當的表面活性劑包括聚乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，如失水山梨糖醇單油酸酯，和環氧乙烷與疏水堿的高分子量加合物，其通過氧化丙烯與丙二醇的縮聚形成。腸胃外制劑可以存在于單劑量或多劑量密封容器中，如安瓿和小瓶中，并且可以保存在冷凍-干燥(凍干)條件下，僅需要在使用前立即加入無菌液體載體(例如，水)而用于注射。可以由先前所述的各種無菌粉劑、粒劑和片劑制備即時使用的注射液和混懸液。本發明的化合物可以制成可注射的制劑。本領域技術人員公知對于用于可注射組合物的有效藥物載體的需求。參見，pharmaceuticsandpharmacypractice(制藥和配藥實踐),j.b.lippincottco.,philadelphia,pa.,banker和chalmers,編,第238-250頁(1982),和ashphandbookoninjectabledrugs(可注射藥物的ashp手冊),toissel,第4版,第622-630頁(1986)。另外，本發明的化合物可以通過與各種基質混合而制成栓劑，所述基質如乳化基質或水溶性基質。適用于陰道施用的制劑可以以子宮套、衛生棉條、膏劑、凝膠、糊劑、泡沫劑、或噴霧形式存在，其除包含活性成分外還包含本領域已知為適當的所述載體。適當的載體及其制劑進一步描述在a.r.gennaro,ed.,remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明頓：制藥科學和實踐)(第19版),mack出版公司,easton,pa(1995)中。本發明化合物或其組合物可以潛在地作為藥學上可接受的酸加合物，堿中和的或加合的鹽施用，所述加合物通過與無機酸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有機酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、和反丁烯二酸反應形成，或通過與無機堿如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀和有機堿如單胺-、二胺-、三烷基胺和芳基胺和取代的乙醇胺反應形成。向鹽的轉化伴隨著用至少化學計量量的適當的酸處理堿化合物。典型地，將游離堿溶解在惰性有機溶劑中，如二乙醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇等中，并且將酸添加在相似的溶劑中。將混合物保持在適當溫度下(例如，0℃-50℃)。所得到的鹽自然沉淀或者可以使用極性較小的溶劑由溶液中析出。化合物的中性形式可以通過將鹽與堿或酸接觸并且以便利方式分離母體化合物而產生。化合物的母體形式在某些物理特性上不同于多種鹽形式，諸如在極性溶劑中的溶解性方面，但是，所述鹽與化合物的母體形式等同地用于本發明的目的。本發明化合物或其鹽、或其組合物的量或劑量應該足以影響哺乳動物中的治療或預防響應。適當的劑量將取決于數種因素。例如，劑量還將通過可能伴隨具體化合物或鹽的施用的任何不利副作用的存在、性質和程度而確定。最終，考慮各種因素，如年齡、體重、一般健康狀況、飲食、性別、待施用的化合物或鹽、施用途徑、和被治療病癥的嚴重性，主治醫師將決定本發明的化合物用于治療每名個體患者的劑量。作為示例且無意限制本發明，本文中描述的化合物的劑量可以是每天約0.1mg至約1g，例如，每天約5mg至約500mg。劑量的其它例子包括、但不限于：0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.5mg、0.6mg、0.75mg、1mg、1.5mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、15mg、17mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、125mg、140mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg或1000mg/kg體重/天。下述實施例進一步舉例說明本發明，但是，當然不應該解釋為以任何方式限制本發明的范圍。實施例滲透性裂解實驗和高通量抑制劑篩選通過標準方法培養惡性瘧原蟲的實驗室系，使用percoll-山梨醇方法在營養子階段進行富集，洗滌，并在25℃和0.15％血細胞比容再懸浮于含有指定濃度的抑制劑的280mm山梨醇、20mmna-hepes、0.1mg/mlbsa(ph7.4)中；在山梨醇等滲替代以后，類似地測量脯氨酸、丙氨酸和苯基-三甲基氯化銨(phtma-cl)的攝取。通過記錄700-nm光在細胞混懸液中的透射率(具有peltier溫度控制的du640分光光度計，beckmancoulter)，連續跟蹤滲透膨脹和裂解。將記錄標準化至受感染細胞在透射率平臺的100％滲透性裂解。通過達到部分裂解閾值所需的時間的內插，計算抑制劑劑量應答。將劑量應答擬合至2個蘭格繆爾等溫線的總和：p＝a/(1+(x/b))+(1-a)/(1+(x/c))(方程s1)其中p代表在有濃度x的抑制劑存在下標準化的溶質滲透性，且a、b和c是常量。使用通過nmr證實具有>90％純度的50,000種化合物的市售文庫(chemdiv)，用hb3-和dd2-感染的細胞在室溫相同地進行使用該透射率測定的高通量篩選。以384-孔形式進行篩選，各個孔含有10μm終濃度的單一化合物。每個微量培養板具有2類對照。32個陽性對照孔接受pbs來替代山梨醇；這些孔中的紅細胞沒有裂解，因為psac具有低na+滲透性。32個陰性對照孔接受含有dmso、但是不含試驗化合物的山梨醇。在多個時間點得到讀出值，以允許以高通量形式估測抑制劑親和力。通過質譜法證實ispa-28的純度和分子量?；谠?h時間點的讀出值，根據下式計算每種篩選化合物的活性：其中％b是標準化的通道阻斷，且acpd代表來自含有試驗化合物的孔的吸光度。aneg和apos代表板中陰性和陽性對照孔的平均吸光度。％b是抑制劑活性的定量測量。使用加權差異統計(wds)，選擇對hb3-和dd2-感染的細胞的攝取具有顯著不同效力的抑制劑，其根據下式從2h時間點的％b值確定：wds＝|％bhb3-％bdd2|/(3*σpos)(方程s3)其中σpos是板中陽性對照孔的標準差。分離株(isolate)-特異性的抑制劑具有≥1.0的wds；較大的值對應于對2個篩選的寄生蟲系的攝取的效力的較大差異。使用當地開發的代碼(diadem10.2和datafinder,nationalinstruments)，將篩選的分析和數據采掘自動化。電生理學用石英片移液器(1-3mω)和1,000mm氯化膽堿、115mmnacl、10mmmgcl2、5mmcacl2、20mmna-hepes(ph7.4)的對稱浴槽和移液器溶液，得到記錄。當存在時，將ispa-28加入浴槽和移液器隔室中。封條電阻>100gω。在-100mv的強加膜電勢得到記錄，使用axopatch200b放大器(moleculardevices)，作為從0mv的保持電位的階梯來施加，在5khz(8-極bessel,頻率裝置)進行低通濾波，在100khz數字化，并用clampex9.0軟件(moleculardevices)記錄。使用當地開發的代碼(diadem8.1,nationalinstruments)，確定單通道開放概率和選通分析。將計數封閉通道持續時間的代碼應用于作為10s持續時間的電壓階梯得到的記錄，以保持封條完整性。它檢測中間閾值交叉，使用鄰近樣品時間的線性插值，并針對66.4μs的高斯濾波器上升時間進行校正，如以前所詳細描述的(desai等人,nanomedicine,1:58-66(2005))。將持續時間計數為16倉/十倍程，標準化為事件總數的百分比，并顯示在平方根圖上，其中將簡單指數式衰減過程的時間常數顯示為最大值(sigworth等人,biophys.j.52:1047-54(1987))。ispa-28效力的數量性狀基因座(qtl)分析選擇443種多態微衛星標志物的獨特集合，所述微衛星標志物區分dd2和hb3親本系(su等人,science,286:1351-53(1999))。通過dna測序，鑒別出染色體3基因座內的5個額外單核苷酸多態性，并用于對后代克隆基因分型。如(broman等人,bioinformatics,19:889-90(2003))所述，通過用r/qtl軟件(可得自http://www.rqtl.org/)執行qtl分析，使用該基因分型數據來搜索遺傳雜交后代中與ispa-28效力有關的遺傳基因座。因為惡性瘧原蟲無性生殖階段是單倍體，所述分析類似于重組近親交配遺傳雜交的分析。通過排列分析，確定在p＝0.05水平的顯著性閾值。如在r/qtl軟件包中所述，通過控制主要染色體3基因座，進行第二次掃描以搜索額外的qtl。piggybac轉座酶介導的互補使用piggybac轉座酶介導的互補(balu等人.pnas,102:16391-96(2005))，評價各個候選基因和在繪圖的基因座內的保守可讀框。用下面表1中列出的引物，從hb3基因組dna進行每種候選物連同它的假定的內源5’啟動子區域(在起始atg上游的1-2kb)和3’utr(在終止密碼子下游的0.5kb)的pcr擴增，并插入pxl-bacii-dhfr載體的多克隆位點中；連接會將所述插入片段置于人二氫葉酸還原酶基因(hdhfr)附近，所述基因的產物允許通過抗葉酸劑wr99210進行選擇。該整合盒側接2個被piggybac識別的反向末端重復(itr)。將攜帶轉基因的質粒與phth(一種輔助質粒，其編碼轉座酶，但是缺乏選擇標記)一起共轉染進dd2中。轉座酶的表達會促進轉基因和hdhfr的基因組整合。使用cdna的染料-終止子測序來證實轉基因表達，這基于已知的多態位點在序列色譜圖中作為雙峰的檢測。簡而言之，根據生產商的說明書，通過用superscriptiii試劑盒(invitrogen)從總rna反轉錄，制備cdna。然后用基因特異性的引物擴增特定轉錄物。被注解為未表達的hb3等位基因要么通過該方法不可檢測出，要么由于dd2和hb3之間的多態性的缺乏而未檢出。表1clag3的等位基因交換通過dd2clag3.1轉基因向hb3基因組clag3.2中的單位點同源重組，實現等位基因交換。用引物5’-cataagcggccgcgccattcagaccaagcaagg-3’(seqidno:35)和5’-ttaaactgcagcttttcaattaattttatattcttttgttc-3’(seqidno:36)，從dd2擴增含有clag3.1的3’部分(3219bp)和它的3’utr(441bp)的dna片段。將擴增子克隆進phd22y質粒(fidock等人,pnas,94:10931-36(1997))中的noti和psti位點之間。通過標準定位誘變，通過在該基因的終止密碼子前面在框架內添加編碼四-半胱氨酸和flag表位標簽(flnccpccmepgsdykddddk)(seqidno:37)的dna序列，構建最終的轉染質粒(phd22y-120w-flag-pg1)。在轉染后5個月，通過pcr，檢測向hb3中的同源重組。通過用ispa-28進行山梨醇處理，富集重組寄生蟲，并進行有限稀釋以產生有限稀釋克隆hb33rec。用于pcr驗證向hb3基因組中的同源重組的引物包括在表2中的那些：表2dna印跡雜交使用wizardgenomicdna提取試劑盒(promega)，提取基因組dna，用指定的限制性酶消化，在0.7％瓊脂糖凝膠上在55v分離18小時，并印跡在帶正電荷的尼龍膜(roche)上。使用引物(5’-atttccagagaatgaccacaac-3’(seqidno:43)和5’-ttaagatggcctgggtgattc-3’)(seqidno:44)，制備與hdhfr互補的dna探針，并用地高辛配基-dutp標記。在與dig-easyhyb(roche)預雜交以后，加入標記的探針，并在39℃雜交過夜。將印跡用0.1×ssc/0.5％sds在53℃洗滌，并封閉。然后用抗-地高辛配基-apfab片段(以1:10,000的稀釋度)和cdp-star底物(roche)檢測探針結合。通過實時pcr定量基因表達使用兩步實時pcr來定量clag基因的表達?；谕ㄟ^dna測序鑒別出的多態性，設計對5個clag基因中的每一個特異性的引物。使用正向和反向引物的可能排列的基因組dnapcr產生了僅具有匹配引物對的擴增子，從而證實了特異性。使用的引物包括表3中的那些：表3按照生產商的方案，用trizol試劑(invitrogen)從同步的裂殖體階段培養物收獲總rna。用turbo-dna-free試劑盒(ambion)，除去殘余基因組dna污染物。使用superscriptiii試劑盒(invitrogen)，用寡-dt作為引物，進行反轉錄。使用省略逆轉錄酶的陰性對照反應，以排除被基因組dna污染的樣品。用quantitectsybrgreenpcr試劑盒(qiagen)和上面的clag基因-特異性的引物對，進行實時pcr。在icycleriq多色實時pcr系統(bio-rad)中跟蹤擴增動力學。使用寄生蟲基因組dna的系列稀釋物來構建每個引物對的標準曲線。使用rhoph2、rhoph3和pf7_0073作為負載對照。將提供的數據標準化為總clag3轉錄物豐度。具有改變的ispa效力的寄生蟲的體外選擇使用psac介導的受感染細胞在未緩沖的280mm山梨醇溶液(含有ispa化合物)中的滲透性裂解，選擇具有改變的抑制劑效力的寄生蟲。該策略是基于這樣的寄生蟲的挽救：所述寄生蟲的通道通過ispa的添加來阻斷；它類似于山梨醇在寄生蟲培養物的同步化中的應用(lambros等人,j.parasitol.,65:418-20(1979))。從裂解動力學和劑量應答確定最佳選擇條件。使用培養物與5μmispa-28或4μmispa-43一起在室溫的30min溫育，在連續日進行同步化。與2個clag3基因有關的通道之間的ispa-28親和力的顯著差異，產生了快速選擇，通常在4-6個同步化內。在使用ispa-43的反向選擇中需要額外的同步化，這與親和力的相對不大的差異相一致。多克隆抗體生產將編碼dd2clag3.1產物的c-端141個氨基酸的dna序列克隆進pet-15b載體(novagen)中，用于在大腸桿菌中過表達。使用標準的定位誘變來引入c-端flag表位標簽，從而產生最終的質粒(pet15b-120w-4b)，其編碼nh2-mgsshhhhhhssggtkkygylgeviaarlspkdkimnyvhetnedimsnlrrydmenafknkmstyvddfaffddcgkneqflnercdycpvieeveetqlftttgdkntnktteikkqtstyidtekmneadsadsddekdsdtpddelmisrfhdykddddk-co2h(seqidno:61)(clag3.1產物用斜體字顯示；六組氨酸和flag標簽標有下劃線)。在用pet-15b-120w-4b轉化和用0.5mmiptg誘導3小時以后，在bl21codonplus(de3)ril細胞系(agilenttechnologies)中生產重組蛋白。通過在有蛋白酶抑制劑(其結合于ni-ntasuperflow珠子(qiagen)上)存在下的超聲處理，收獲重組蛋白，在優化條件下用咪唑洗脫，并透析。在用于使用precisionantibody(columbia,md)(一種olaw檢驗過的設備)的標準小鼠免疫接種之前，在考馬斯染色的sds-page凝膠上證實純度和大小。通過elisa，抗體滴度>1:100,000。蛋白酶敏感性研究將percoll富集的同步的營養子-感染的細胞洗滌，并在補充了0.6mmcacl2和1mmmgcl2的pbs中以5％血細胞比容用1-2mg/ml的得自灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)的鏈霉蛋白酶e(sigmaaldrich)在37℃處理1h。通過加入20體積的含蛋白酶抑制劑(1mmpmsf、2μg/ml胃酶抑素和2μg/ml亮抑酶肽)的冰冷pbs，終止反應，并徹底洗滌。通過用山梨醇攝取測量檢驗psac活性，評價蛋白酶處理的有效性和蛋白酶抑制劑實現的阻斷。通過測量全細胞裂解物的考馬斯染色的sds-page凝膠中的血紅蛋白帶強度，檢驗蛋白酶向紅細胞胞質溶膠的可達性。用imagej軟件(http://rsbweb.nih.gov/)定量帶強度，并表明沒有可檢測的血紅蛋白降解(與未經處理的對照組相比，99±2％的平均值，n＝7個單獨試驗)。膜分級分離在40體積的含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(7.5mmna2hpo4,1mmedta,ph7.5)中，使受感染細胞(經過或未經過先前的蛋白酶處理)發生溶血，并超速離心(70,000xg,4℃,1h)。將上清液收集為“可溶性的”級分，然后將沉淀物在4℃再懸浮于100mmna2co3、ph11中保持30min，然后離心(70,000xg)。用1/10體積的1mhcl中和“碳酸鹽提取物”上清液。將最終的沉淀物用裂解緩沖液洗滌，然后在2％sds中溶解為“膜”級分。免疫熒光共焦顯微術將同步的寄生蟲培養物洗滌，并用于在載玻片上制備薄涂片。將細胞風干，然后在100％甲醇(對于裂殖子，為冰冷的；對于營養子，為室溫)中固定5min。在含有0.1％tritonx-100的10％山羊血清封閉溶液(invitrogen)中溫育以后，將針對clag3重組蛋白的第一抗體和第二抗體(alexafluor488山羊抗-小鼠igg,invitrogen)分別以1:50和1:500稀釋度應用在相同緩沖液中，在抗體之間徹底洗滌。將細胞核用hoechst33342染色，然后在fluoromount-g(southernbiotech)中固定。利用系列405nm和488nm激發，在100x油浸物鏡下在leicasp2共焦顯微鏡上拍攝雙色熒光圖像。在imaris6.0(bitplaneag)中處理圖像，并使用huygensessential3.1(scientificvolumeimagingbv)均勻地去卷積。免疫印跡使蛋白樣品變性，并在含100mmdtt的樣品緩沖液(invitrogen)中還原，在mes緩沖液(invitrogen)中在4-12％bis-tris凝膠上運行，并轉移至硝酸纖維素膜。在阻斷(3％脫脂奶，在含有0.1％吐溫20的150mmnacl、20mmtrishcl、ph7.4中)以后，將抗-重組clag3產物或抗-flag(cellsignallingtechnology)以1:3000稀釋度應用于封閉緩沖液中。洗滌后，用hrp-綴合的第二抗體(pierce)(以1:3000稀釋度)和化學發光底物(immobilon,millipore或supersignalwestpico,pierce)檢測結合。計算分析使用在fasttree2.1程序中在默認參數下實現的近似最大可能性方法，進行clag產物和更疏遠的相關ron的系統進化分析(price等人,mol.biol.evol.,26:1641-50(2009))。使用tmhmm和phobius程序(krogh等人,j.mol.biol.,305:657-80(2001)；kall等人,bioinformatics,21增刊1:i251-57(2005))，預測跨膜結構域。通過在polyphobius模式輸入得自幾個瘧原蟲物種的組2clag產物的多個比對，實現提高的跨膜結構域預測的置信度。實施例1本實施例證實了根據下面式(1a)和(2a)的化合物對psac的活性。本實施例也證實了化合物(1a)和(2a)在富含營養物的rpmi和psac限制培養基(plm)中的體外生長抑制活性。式(1a)和(2a)的化合物是根據本發明的一個實施方案。如以前所述(biophysicalj.84:116-23,2003)，測量產生psac介導的溶質攝取的50％阻斷所需的化學抑制劑的濃度，即psac阻斷的k0.5(表4)。所述化學抑制劑包括：簡而言之，通過在人紅細胞中的體外培養，得到惡性瘧原蟲營養子，通過密度梯度離心進行富集，并用于在山梨醇裂解溶液(按mm計：280山梨醇,20na-hepes,0.1mg/mlbsa,ph7.4)中的連續光散射滲透性裂解測定中。在該測定中，透射率(％t,在700nm測量)的增加與受感染的rbc的裂解直接關聯，并以任意單位繪圖。未受感染的rbc缺乏psac活性，且具有不可檢測的低山梨醇滲透性。其它營養物溶質的攝取和膜片箝方法證實：該透射率測定會提供化合物(1a)和(2a)實現的psac抑制的定量測量。化合物(1a)和(2a)的psac抑制劑代表干預瘧疾寄生蟲的新穎策略，因為目前被批準的抗瘧疾藥(青蒿素、甲氟喹和氯喹)不會抑制psac活性(表4)。使用96-孔形式的、針對寄生蟲核酸的、基于sybrgreeni的熒光測定，定量psac抑制劑實現的體外寄生蟲殺死。如下同步化寄生蟲培養物：在5％d-山梨醇中溫育，然后以1％寄生蟲血癥(parasitemia)和2％血細胞比容接種在用于寄生蟲培養的標準培養基(補充了25mmhepes、50mg/l次黃嘌呤和10％常規血清的rpmi1640)或psac限制培養基(plm，一種基于rpmi1640制劑的新培養基，但是具有降低的異亮氨酸、谷氨酰胺和次黃嘌呤濃度，受感染細胞對所述3種營養物的攝取主要是通過psac)中。盡管rpmi1640含有超過生理濃度的這些營養物，但是在plm中的值更接近得自健康人供體的血漿中所測得的那些值。不經培養基變化，在5％o2、5％co2中在37℃將培養物維持3天。該溫育以后，將sybrgreeni加入20mmtris、10mmedta、0.016％皂苷、1.6％tritonx100中。隨后的熒光測量(在485/528nm的激發/發射)允許定量寄生蟲生長，因為sybrgreen1的熒光是寄生蟲核酸含量的量度。表4顯示了在rpmi1640(rpmiic50)或plm(plmic50)中產生寄生蟲存活的50％下降所需的每種psac抑制劑(式(1a)或(2a)的化合物)或對照抗瘧疾藥(青蒿素、甲氟喹或氯喹)的濃度。在plm中試驗以后，psac抑制劑(式(1a)或(2a)的化合物)所實現的提高殺死指示，所述psac抑制劑可能具有新穎的寄生蟲殺死機制。這些數據支持psac在寄生蟲營養物獲取中的作用，因為營養物限制會提高psac抑制劑效力，但是不會顯著改變青蒿素、甲氟喹或氯喹的殺死(參見ic50比率(rpmi/plm))。表4實施例2本實施例證實了分離株-特異性的抑制劑的鑒別，所述抑制劑可有效地抑制與特定寄生蟲系有關的psac活性。本實施例也證實，根據本發明的抑制劑會與psac直接相互作用。研究了對不同寄生蟲系誘導的通道具有不同效力的小分子抑制劑。據推測，這樣的抑制劑會結合所述通道上的一個或多個可變位點，所述位點可能源自寄生蟲通道基因中的多態性，或者源自人通道的不同活化。為了發現這些抑制劑，使用了基于透射率的測定，所述測定跟蹤受感染細胞在山梨醇(一種在感染后具有增加的滲透性的糖醇)中的滲透性裂解(wagner等人,biophys.j.,84:116-23(2003))。該測定已經被改造成384-孔形式，并用于發現高親和力psac抑制劑(pillai等人,mol.pharmacol.,77:724-33(2010))。在這里，針對被hb3和dd2惡性瘧原蟲系感染的紅細胞，使用該形式來篩選化合物文庫。為了使命中的檢測最大化，通過使用高濃度(10μm)的文庫化合物，和通過在多個時間點讀出每個微量培養板，在篩選中選擇低嚴謹性(pillai等人,mol.pharmacol.,77:724-33(2010))。8％的化合物滿足或超過在2h的50％標準化阻斷的閾值這與低篩選嚴謹性相一致。定義了加權差異統計(wds)，其將針對hb3和dd2通道的測得效力差異標準化為每個微量培養板中的陽性對照孔的標準差[wds＝│％bhb3-％bdd2│/(3*σpos)]。所有化合物中的86％對2個寄生蟲系產生了不能辨別的作用(wds≤1.0)。因而，大多數抑制劑結合位點是保守的。盡管如此，小量化合物在2個篩選中產生了顯著不同的活性。一種這樣的抑制劑，名稱為ispa-28(分離株-特異性的psac拮抗劑，其基于下述的研究，下式a)，可再現地更有效地抑制dd2-感染的細胞(與hb3-感染的細胞相比)的山梨醇攝取。使用ispa-28的第二項研究揭示了半數最大親和力的約800倍差異(對于dd2和hb3，分別為56±5nm和43±2μm的k0.5值；p<10-10)。還檢驗了ispa-28對氨基酸丙氨酸和脯氨酸以及有機陽離子苯基-三甲銨(phtma)(已知在感染后具有滲透性增加的溶質(ginsburg等人,mol.biochem.parasitol.14:313-22(1985)；bokhari等人,j.membr.biol.226:27-34(2008)))的攝取的影響。以與山梨醇的那些匹配的劑量應答，抑制每種溶質的滲透性。不受特定理論或機制的約束，據信，這些數據提供這些不同溶質使用單個共有運輸機制的證據。接下來試驗了22個不同的實驗室寄生蟲系，僅用dd2和w2發現了顯著的運輸抑制。因為dd2通過從w2開始的長期藥物選擇而產生(wellems等人,nature,345:253-55(1990))，所以它們的通道的特征性的ispa-28親和力提示在寄生蟲基因組中的穩定的可遺傳的元件。為了探究ispa-28阻斷的機制，進行了受感染的紅細胞的膜片箝。使用全細胞構型，在不含已知抑制劑的實驗中觀察到在hb3-和dd2-感染的細胞上的類似電流。這些電流表現出內向整流。以前的研究確定，它們主要由陰離子承載，滲透性排序為：scn->i->br->cl-(desai等人,nature,406:1001-05(2000))。10μmispa-28會減小這些電流，但是對dd2-感染的細胞具有顯著更大的作用。在使用1.1mcl-作為電荷載體的細胞結合的構型中，在兩個系上檢測到psac的離子通道活性特征(具有快速閃爍門控的約20ps斜率電導(alkhalil等人,blood,104:4279-86(2004))；在沒有抑制劑時，得自2個系的通道是不能辨別的。但是，使用10μmispa-28的記錄揭示了顯著差異，因為dd2通道受到幾乎完全抑制，而hb3通道在很大程度上未受影響。因而，該化合物對單個psac記錄的影響與對山梨醇和其它有機溶質的攝取的那些影響類似。分析了得自延長記錄的閉合持續時間，并確定，ispa-28施加影響于長阻斷事件的獨特群體，但是僅在dd2-感染的細胞上的記錄中。與此同時，固有的通道封閉(其發生在沒有抑制劑存在下)在兩種寄生蟲上是保守的，并且不受ispa-28影響。實施例3本實施例證實了ispa-28效力在dd2xhb3遺傳雜交中的遺傳，并且piggyback介導的互補涉及在psac活性中的clag3.1和clag3.2。接下來檢驗了ispa-28對紅血細胞上的psac活性的效力，所述紅血細胞被得自dd2xhb3遺傳雜交的重組后代克隆感染(wellems等人,nature,345:253-255(1990))。對于每個克隆，在沒有和有7μmispa-28(最佳地區分親本通道表型的濃度)存在下，檢驗了山梨醇攝取，并定量抑制盡管34個獨立后代克隆中的幾個表現出中間通道抑制，但是大多數類似于一個或其它親本。使用數量性狀基因座(qtl)分析來檢索ispa-28效力和可利用的微衛星標志物的遺傳之間的關聯。初次掃描鑒別出在染色體3的近端端部處的單個顯著峰，其具有12.6的幾率對數(lod)評分。針對殘余作用的二次掃描沒有發現達到統計顯著性的額外峰。繪圖的基因座含有42個預測的基因。盡管所述基因都與得自其它生物體的經典離子通道沒有同源性，但是許多基因在其它瘧原蟲中是保守的，這從負責基因的psac活性在瘧疾寄生蟲中的保守預見到(lisk等人,eukaryot.cell,4:2153-59(2005))。繪圖的區域富含編碼注定要輸出至宿主胞質溶膠的蛋白的基因(通過模擬，p<10-4)，作為頂復門寄生蟲亞端粒區域的典型。一些編碼蛋白具有一個或多個經常涉入通道孔形成的預測跨膜結構域，但是該標準可能錯失一些運輸蛋白。pexel基序，其將寄生蟲蛋白引導至宿主細胞(marti等人,science,306:1930-33(2004))，存在于某些基因中，但是該模塊不是輸出所普遍需要的(spielman等人,trendsparasitol.26:6-10(2010))。因而，計算分析提示幾種候選物，但是沒有明確地指示任何候選物作為離子通道組分。選擇dna轉染方案，并選擇piggybac轉座酶來補足具有各個候選基因的hb3等位基因的dd2寄生蟲(balu等人,pnas,102:16391-96(2005))。利用該方法，成功地轉染的寄生蟲將攜帶兩個親本等位基因，并因此是候選基因的部分二倍體。盡管如此，預期所述親本系之間的ispa-28效力的顯著差異會在與負責基因互補后產生運輸表型的可檢測的變化。由piggybac賦予的隨機整合的高效率允許快速地檢查許多基因(balu等人,bmcmicrobiol.,9:83(2009))。將14個基因與它們的得自hb3親本的內源5’和3’utr區域一起克隆進pxl-bacii-dhfr質粒中；還制備了第15個構建體，其含有保守的、但是沒有注解的可讀框(orf147kb)。將每個與編碼轉座酶的輔助質粒一起單個地轉染進dd2寄生蟲中。針對hdhfr表達的選擇產生了穩定地攜帶每個候選物的dd2和hb3等位基因的寄生蟲。因為據推測改變的通道表型需要hb3等位基因的表達，所以使用逆轉錄酶pcr來擴增每個基因的多態區域，并將擴增子測序，以確定兩個親本等位基因是否被轉錄；該方案證實了12種候選物的表達。進行了被每個轉染子感染的紅細胞對山梨醇攝取的抑制的ispa-28劑量應答。2個表達pfc0110w(clag3.2)和pfc0120w(clag3.1)的hb3等位基因的轉染子產生了ispa-28效力的顯著變化(其k0.5值在dd2和hb3的那些值之間)，這從攜帶得自2個親本系的通道的細胞預見到(相對于dd2，分別p＝0.01和p<10-7)。pfc0120w轉染子的有限稀釋克隆產生了克隆dd2-pb120w，后者已經經歷至少一個整合事件；它的ispa-28k0.5與轉染庫不能辨別。對于2個基因，定量分析提示hb3等位基因的相對較低水平的表達，因為轉染子k0.5值(95±8和140±12nm)更接近于dd2(與hb3相比)的k0.5值。不受特定理論或機制的約束，據信，2個親本等位基因的表達水平可能受整合位點的基因組環境、相關啟動子效率和下面檢驗的基因沉默機制影響。實施例4本實施例證實了clag3.1.和clag3.2在psac活性中的作用。本實施例也證實，clag3基因沉默和轉換的表達會決定抑制劑親和力。為了檢驗clag3產物促進psac活性的意外可能性，使用等位基因交換策略來將有效的ispa-28段從dd2系轉移至hb3寄生蟲。因為dd2寄生蟲表達clag3.1、但是不表達clag3.2(kaneko等人,mol.biochem.parasitol.,143:20-28(2005))，推測它們的clag3.1基因編碼高ispa-28親和力。因此，構建了轉染質粒，其攜帶得自dd2clag3.1等位基因的3’末端的3.2kb片段，繼之以終止密碼子的符合讀框的c-端flag標簽、和所述片段基因的3’非翻譯區(phd22y-120w-flag-pg1)。因為該質粒僅攜帶基因片段和且缺少驅動表達的前導序列，所以改變的運輸表型需要重組進寄生蟲基因組中。用該質粒轉染hb3，并使用pcr來篩選向5個內源clag基因中的每一個內的整合。該方案檢測向hb3clag3.2基因中的重組；有限稀釋克隆會產生hb33rec，即攜帶單位點整合事件的沒有殘余游離型質粒的克隆。dna測序指示在距離hb3clag3.2起始密碼子3718和4011堿基對處的單核苷酸多態性之間的重組。該重組位點對應于下游多態性的成功轉移，包括經識別的在4266-4415堿基對處的高變區；通過指紋法排除了其它實驗室寄生蟲系的污染。對hb33rec的psac活性表現出ispa-28效力的顯著增加(圖1)，從而進一步支持了clag3基因在山梨醇和營養物攝取中的作用。盡管該等位基因交換策略產生了基因替代(不同于用piggybac實現的互補)，但是所述通道的ispa-28親和力再次是在hb3和dd2的那些值之間的中間值(圖2)。不受特定理論或機制的約束，據信，幾個機制可能促進抑制劑親和力的數量上的不完全轉移。首先，在所述蛋白上的2個或更多個多態位點可能促進ispa-28結合。如果這些位點中的一些是在重組事件的上游，則得到的嵌合蛋白可能具有不同于任一個親本系的那些的功能性質。其次，所述通道可能含有額外未識別的亞基；在這里，可能需要轉染(用dd2等位基因替代每個促成性的hb3基因)來匹配dd2的ispa-28親和力。最后，除了通過轉染產生的嵌合clag3.2hb3-3.1dd2基因以外，hb33rec也攜帶hb3寄生蟲的內源性clag3.1基因。兩種旁系同源物的表達也會產生中間ispa-28親和力。為了探究這些可能性，對hb33rec-感染的細胞進行細胞結合的膜片箝。鑒別了表現出與每個親本系的那些匹配的ispa-28效力的各個通道分子。這些記錄不包括需要同源通道群體的情形。除了hb33rec的復雜行為以外，還觀察到得自遺傳雜交的某些后代具有比dd2更低的ispa-28親和力，盡管遺傳了完全得自dd2親本的繪圖的染色體3基因座。因為惡性瘧原蟲中的亞端粒多基因家族對重組和頻繁的基因轉變事件敏感(freitas-junior等人,nature,407:1018-22(2000))，所以對clag3旁系同源物和得自7c20和dd2的鄰近基因組dna測序，但是沒有發現dna-水平差異。因此考慮了可能影響ispa-28親和力的表觀遺傳的機制。已經報道，clag3.1和clag3.2會經歷相互排斥的表達(cortes等人,plospathog.,3:e107(2007))。也針對惡性瘧原蟲中的其它基因家族記載的單等位基因表達和轉換(chen等人.nature,394:392-95(1998)；lavazec等人,mol.microbiol.,64:1621-34(2007))允許各個寄生蟲表達多基因家族的單個成員。由無性生殖產生的子代寄生蟲繼續通過不完全理解的表觀遺傳的機制排它性地表達相同基因(howitt等人,mol.microbiol.,73:1171-85(2009))。幾代以后，一些子代可能轉換為所述基因家族的其它成員的表達，從而提供促進免疫逃避的多樣性(sherf等人,annu.rev.microbiol.,62:445-70(2008))。進行逆轉錄酶pcr，并發現，dd2幾乎排它地表達clag3.1，而3個不一致的后代以可測量的水平表達clag3.2，從而提示表觀遺傳的調節。因此，使用在含有ispa-28的山梨醇溶液中的滲透性裂解，將選擇壓力應用于后代培養物。ispa-28的包含會優先赦免其通道具有高抑制劑親和力的受感染細胞：這些細胞遭受更少的山梨醇攝取，并且不會裂解。在多個連續日施加的這些選擇會造成寄生蟲血癥的顯著下降。存活的寄生蟲表現出提高的ispa-28親和力，其在數量上匹配dd2親本的親和力。應用于hb3和3個遺傳它的染色體3基因座的后代的相同選擇沒有改變ispa-28親和力，從而排除了所述選擇對無關基因組位點的影響。實時qpcr(其使用對5個clag基因中的每一個具有特異性的引物)揭示，使用山梨醇和ispa-28的選擇會在繼承dd2基因座的后代中可再現地增加clag3.1表達，同時減少clag3.2的表達。應用于親本hb3系的選擇沒有影響，這與它的未變化的抑制劑親和力一致。這些選擇沒有改變其它旁系同源物(clag2、clag8和clag9)的相對表達。還將選擇應用于hb33rec，其攜帶嵌合的clag3.2hb3-3.1dd2轉基因和hb3的天然clag3.1基因。不同于在同基因的hb3系上的效應的缺乏，這些同步化使轉染子的ispa-28親和力增加至51±9nm的k0.5，從而匹配dd2通道的值。通道表型的這種變化與轉基因的近乎排它表達相關聯，從而證實細胞子集對hb3clag3.1的表達導致了中間ispa-28親和力。這些發現也界定了ispa-28的決定簇，所述決定簇結合被轉移至hb33rec的dd2clag3.1基因片段內的多態位點。不受特定理論或機制約束，據信，惡性瘧原蟲多基因家族的表達轉換經歷幾代而發生，并且將導致群體表型中的漂移。選擇hb33rec中的嵌合基因以后，連續的體外繁殖導致了ispa-28親和力的逐漸減退，這與減少的轉基因表達相關聯。與其它多基因家族一樣(lavazec等人,mol.microbiol.,64:1621-34(2007))，在沒有選擇壓力下連續培養以后，幾個因素可能影響2個clag3基因的穩態ispa-28親和力和相對表達水平。實施例5本實施例證實了亮抑酶肽抗性的psac突變體中的ispa-43和clag3突變的反向選擇。接下來尋找對2種dd2clag3產物具有反轉特異性的psac抑制劑。為此目的，在選擇clag3.1表達之前和之后，使用后代克隆7c20，研究了得自實施例2的高通量篩選的命中。該二次篩選將ispa-43鑒別為具有與ispa-28相反的等位基因特異性的psac抑制劑(下面式b(對于與得自dd2的clag3.1和clag3.2基因有關的通道，k0.5分別為32和3.9μm)。最近，通過使用亮抑酶肽對hb3的體外選擇(lisk等人,antimicrob.agentschemother.,52:2346-54(2008))，產生了具有改變的psac選擇性、門控和藥理學的穩定寄生蟲突變體。對得自該突變體hb3-leur1的clag3基因測序，并鑒別出在它的clag3.2基因內的點突變，所述點突變將保守的a1210改變為蘇氨酸，這與clag3基因在溶質攝取中的重要作用相一致。hb3-leur1會沉默它的未修飾的clag3.1，并優先表達突變的clag3.2(表達比率為19.2±1.5)，這是對psac行為的直接作用所必需的。因為該突變是在預測的跨膜結構域內，所以它可能直接地造成觀察到的通道門控和選擇性的變化。然后將含有4μmispa-43的山梨醇同步化應用于表達clag3.1的7c20培養物，并實現穩健的反向選擇：存活寄生蟲表現出低ispa-28親和力和反轉的clag3表達譜。因而，可以在任一個clag3基因的純化選擇中使用抑制劑。因為通過在沒有選擇壓力下的偏移或者通過用具有反轉特異性的抑制劑選擇替代旁系同源物都可以降低ispa-28親和力，所以這些研究減少了關于暴露于山梨醇或單一抑制劑的間接作用的擔心。最近，通過使用亮抑酶肽對hb3的體外選擇(lisk等人,antimicrob.agentschemother.,52:2346-54(2008))，產生了具有改變的psac選擇性、門控和藥理學的穩定寄生蟲突變體。對得自該突變體hb3-leur1的clag3基因測序，并鑒別出在它的clag3.2基因內的點突變，所述點突變將保守的a1210改變為蘇氨酸，這與clag3基因在溶質攝取中的重要作用相一致。hb3-leur1會沉默它的未修飾的clag3.1，并優先表達突變的clag3.2(表達比率為19.2±1.5)，這是對psac行為的直接作用所必需的。不受特定理論或機制的約束，據信，因為該突變是在預測的跨膜結構域內，所以它可能直接地造成觀察到的通道門控和選擇性的變化。實施例6本實施例證實，clag3產物暴露在宿主紅細胞表面上。為了直接地促進psac活性，據信，至少一些clag3產物會與宿主膜結合，據推測是作為嵌膜蛋白。因此，制備了針對2種clag3產物之間保守的羧基端重組片段的多克隆抗體。使用該抗體的共焦顯微術證實了將這些蛋白局部化至宿主胞質溶膠和可能的紅細胞膜以及在侵襲性裂殖子的棒狀體內的報道(vincensini等人,mol.biochem.parasitol.,160:81-89(2008))。為了得到更明確的證據，使用免疫印跡法來檢驗這些蛋白對細胞外蛋白酶的敏感性。在沒有蛋白酶處理下，在全細胞裂解物中檢測到單個約160kda帶，這與clag3產物的預期大小相一致。在為預防細胞內蛋白消化所設計的條件下用鏈霉蛋白酶e處理，會減少全長蛋白的量，并揭示35kda水解片段。相反，針對kahrp(一種寄生蟲蛋白，其與宿主膜細胞骨架相互作用，但是沒有暴露(kilejian等人,mol.biochem.parasitol.,44:175-81(1991)))的單克隆抗體證實，細胞內蛋白在這些條件下具有水解抗性。如關于另一種蛋白酶所報道的(baumeister等人,mol.microbiol.,60:493-04(2006))，鏈霉蛋白酶e處理會顯著減少psac介導的山梨醇攝?。辉撟饔脤Φ鞍酌敢种苿┦敲舾械?，這提示，在一個或多個暴露位點處的蛋白酶解會干擾運輸。受感染細胞裂解物的超速離心揭示，clag3產物是完全膜結合的；但是，一部分可以通過na2co3處理來釋放，所述na2co3處理會剝離周圍蛋白的膜(fujiki等人,j.cellbiol.,93:97-102(1982))。因為該部分是蛋白酶不敏感的，所以它反映了與膜松散地結合的clag3產物的細胞內集合。c-端水解片段僅存在于碳酸鹽抗性的不溶性級分中，從而指示整合膜蛋白。因為多克隆抗體可能與得自其它染色體的clag產物交叉反應，所以接下來檢驗了hb33rec(其嵌合的clag3轉基因編碼c-端flag標簽)中的蛋白酶敏感性?？?flag抗體識別hb33rec中的單一整合嵌膜蛋白，且不識別得自親本hb3系的蛋白，從而指示重組基因產物的特異性。在細胞裂解和分級分離之前的鏈霉蛋白酶e處理揭示了這樣的水解片段：其與用針對天然蛋白的c-端產生的抗體所觀察到的水解片段不能區分開。對于在實施例7-10中描述的實驗，進行下述操作：寄生蟲培養、plm設計和生長抑制研究通過標準方法，在補充了25mmhepes、31mmnahco3、0.37mm次黃嘌呤、10μg/ml慶大霉素和10％混合人血清的rpmi1640中，繁殖無性生殖階段的惡性瘧原蟲實驗室系。plm是基于該標準培養基，并且在缺乏具有已知psac滲透性的單一組分的培養基中測量寄生蟲生長以后進行設計：次黃嘌呤、泛酸鈣和氨基酸cys、glu、gln、ile、met、pro和tyr(saliba等人,j.biol.chem.,273:10190-10195(1998))。plm含有降低濃度的異亮氨酸(11.4μm)、谷氨酰胺(102μm)和次黃嘌呤(3.01μm)；在補充進該培養基中之前，在蒸餾水中充分透析人血清。如以前所述(pillai等人,mol.pharmacol.,77:724-733(2010))，以96-孔形式使用針對寄生蟲核酸的基于sybrgreeni的熒光測定，定量生長抑制實驗。以1％寄生蟲血癥和2％血細胞比容，將環狀體期同步化的培養物接種在標準培養基或plm中，并在5％o2、5％co2下在沒有培養基更換下在37℃維持72h。然后在含有sybrgreeni的20mmtris、10mmedta、0.016％皂苷和1.6％tritonx100、ph7.5中裂解培養物，所述sybrgreeni處于生產商的推薦濃度的2倍(invitrogen,carlsbad,ca)。45min溫育以后，通過測量熒光(激發/發射波長,485/528nm)，定量寄生蟲dna含量。對于每種抑制劑濃度，在減去得自20μm氯喹殺死的匹配培養物的背景熒光以后，計算一式三份測量的平均值。在使用ispa-28的基于運輸的選擇以后，進行使用hb33rec寄生蟲的生長抑制研究，以實現通過等位基因交換轉染產生的嵌合clag3基因的表達。運輸抑制測定使用基于受感染細胞在山梨醇中的滲透性裂解的定量透射率測定(wagner等人,biophys.j.,84:116-123(2003))，確定了psac阻斷的抑制劑親和力。使用percoll-山梨醇方法在營養子階段富集寄生蟲培養物，洗滌，并在37℃和0.15％血細胞比容再懸浮于含有指定濃度的抑制劑的280mm山梨醇、20mmna-hepes、0.1mg/mlbsa(ph7.4)中。psac介導的山梨醇攝取會產生滲透性裂解，其通過測量700nm光在細胞混懸液中的透射率進行連續跟蹤(具有peltier溫度控制的du640分光光度計,beckmancoulter)。從達到部分裂解閾值所需的時間，計算抑制劑劑量應答。將ispa-28劑量應答擬合至2個蘭格繆爾等溫線(eq/s1)的總和。其它抑制劑具有被單個蘭格繆爾等溫線充分擬合的劑量應答。為了檢驗寄生蟲培養物中的可能抑制劑代謝，將dd2寄生蟲在含有40μmispa-28的標準培養基中在37℃培養72h。離心后，使用培養物上清液作為ispa-28的來源，用于與新鮮制備的化合物在運輸抑制研究中進行對比。qtl分析我們使用448種以前選擇的區分dd2和hb3親本系的多態標志物(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011))，在dd2xhb3遺傳雜交中尋找了與ispa-28生長抑制效力有關的遺傳基因座(wellems等人,nature,345:253-255(1990))。使用如(broman等人,bioinformatics,19:889-890(2003))所述的r/qtl軟件(在http://www.rqtl.org/自由獲得)和適合用于單倍體無性寄生蟲的條件，進行qtl分析。用排列分析估測p＝0.5顯著性閾值。在0.3和10μmispa-28的生長抑制數據鑒別出用3μmispa-28報道的相同基因座。通過控制clag3基因座，用二次掃描來尋找額外的qtl。定量rt-pcr使用以前開發的等位基因-特異性的引物(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011))，使用兩步實時pcr來定量clag基因表達。用trizol試劑(invitrogen)從裂殖體階段培養物收獲rna，用dna酶處理以除去殘余的基因組dna污染物，并用于反轉錄(superscriptiii和寡-dt引發，invitrogen)。不含逆轉錄酶的陰性對照反應物證實，不存在基因組dna污染。用quantitectsybrgreenpcr試劑盒(qiagen)、icycleriq多色實時pcr系統(bio-rad)和clag基因-特異性的引物，執行實時pcr。使用寄生蟲基因組dna的系列稀釋物構建每個引物對的標準曲線。使用pf7_0073作為負載對照，因為它組成型地表達。然后從擴增動力學確定每個clag基因的轉錄物豐度。關于clag3重組的pcr研究用基因組dna和等位基因-特異性的引物：3.1f(5’-gtgcaatatatcaaagtgtacatgca‐3’)(seqidno:68)、3.1r(5’-aagaaaataaatgcaaaacaagttaga‐3’)(seqidno:69)、3.2f(5’-gttgagtacgcactaatatgtcaatttg‐3’)(seqidno:41)和3.2r(5’-aaccataacattatcatatatgttaattacac‐3’)(seqidno:42)，表征了dd2-plm28的clag3基因座。還與這些引物一起使用從裂殖體階段培養物制備的cdna，以檢驗天然和嵌合clag3基因的表達。dna印跡在有地高辛配基(dig)-dutp(roche)存在下，使用5’-atttacaaacaaagaagctcaagagga‐3’(seqidno:70)和5’-ttttctatatcttcattttctttaattgttc‐3’(seqidno:71)，通過pcr擴增從dd2基因組dna制備了clag3-特異性的探針。通過針對5個clag基因的全長pcr擴增子(用引物從dd2基因組dna產生)的印跡，證實了探針特異性。用指定的限制性酶(newenglandbiolabs)消化基因組dna，在0.7％瓊脂糖中進行電泳，進行酸脫嘌呤化，轉移和交聯至尼龍膜。然后使印跡與上述dig-標記的探針在digeasyhyb(roche)中在39℃雜交過夜，并用低和高嚴謹性緩沖液洗滌(2xssc、0.1％sds、23℃，隨后1xssc、0.5％sds、50℃)，然后根據生產商的說明書進行dig免疫檢測。哺乳動物細胞毒性以4000個細胞/孔，在96-孔平板中用人hela細胞(atcc#cll-2)測量了psac抑制劑的細胞毒性。將培養物與每種抑制劑一起在補充了10％胎牛血清的最低必需培養基(gibco/invitrogen,carlsbad,ca)中在37℃溫育72h。如(marshall等人,growthregul.,5:69-84(1995))所述，使用活體染料mts[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯酚)-2-(4-磺苯基)-2h-四氮唑,內鹽]定量細胞生存力。報道的cc50值是使mts向甲的轉化減少50％的抑制劑濃度。實施例7本實施例證實，當培養基中的營養物可用性降低時，ispa-28在體外殺死dd2細胞。ispa-28會以高親和力阻斷dd2-感染的細胞上的psac，且對得自hb3寄生蟲的通道僅具有弱活性(k0.5分別為56±5nm和43±2μm)(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011))。如果通道活性在細胞內寄生蟲的生長中起作用，則預期該小分子抑制劑會干擾dd2培養物的繁殖，但是赦免hb3的繁殖。初步的體外寄生蟲生長研究揭示了不顯著差異，兩個寄生蟲系在基于rpmi的培養基中表現出持續生長，盡管存在高ispa-28濃度(各自的ic50值>40μm，關于差異，p＝0.35)。經確定，在體外培養條件下，ispa-28對dd2通道的效力不受抑制劑代謝損害。ispa-28也沒有被血清蛋白或脂質顯著吸附，已知所述吸附是會降低一些psac抑制劑和許多治療劑的活性的現象(matsuhisa等人,chem.engineeringj.,34:b21-b27(1987))。因而，ispa-28在標準體外培養條件下不會抑制dd2寄生蟲的生長。一種可能性是，所述通道活性參與瘧疾寄生蟲的存活，但是在標準體外培養條件下，在有抑制劑存在下殘余的低水平運輸會充分滿足寄生蟲需要。與此相一致，甚至在高ispa-28濃度下觀察到在dd2-感染的紅細胞中持續的通道介導的攝取。用化合物(31)觀察到顯著更少的殘余攝取，所述化合物(31)是對dd2通道具有可比較的抑制性k0.5值的廣譜psac抑制劑(pillai等人,mol.pharmacol.,77:724-733(2010))(對于在10μm的這些抑制劑的對比，p<10-4)。使用這些抑制劑時殘余通道活性的意外差異可能解釋它們對體外寄生蟲生長的不同效力(ic50值分別為約50μm和4.7μm；表5)。表5不受特定理論或機制約束，據信，在高ispa-28濃度下的不完全阻斷(盡管對于dd2通道的低k0.5值)提示復雜的抑制機制。盡管丹曲林和呋塞米劑量應答被假定抑制劑和通道分子的1:1化學計量學的方程式適當地擬合，但是ispa-28劑量應答沒有較好地擬合。用雙要素langmuir方程式得到了改進的擬合。因為該雙要素方程式與幾種可能的機制相容，所以尚未確定ispa-28化學計量學和通道阻斷的精確模式。不受特定理論或機制的約束，據信，如果psac在細胞內寄生蟲的營養物獲取中起作用(desai等人,nature,406:1001-1005(2000))，那么由ispa-28實現的不完全抑制可能允許適當的營養物攝取。許多營養物以超生理濃度存在于一般用途rpmi1640培養基中(sato等人,curr.protoc.cellbiol.,1:單元1.2(2001))。盡管存在幾乎完全的通道阻斷，但是在該培養基中的營養物的向內大濃度梯度會支持寄生蟲營養物攝取。測量了具有psac介導的攝取的營養物，并選擇異亮氨酸、谷氨酰胺和次黃嘌呤，因為它們從培養基的單獨除去會不利地影響寄生蟲培養物。異亮氨酸和谷氨酰胺劑量應答揭示，二者可以減少超過90％，對hb3或dd2的繁殖具有可忽略的作用，這與標準培養基中的過量營養物相一致。選擇了這些氨基酸以及次黃嘌呤(一種具有高psac滲透性的嘌呤)的閾值濃度(gero等人,adv.exp.med.biol.,309a:169-172(1991)；asahi等人,parasitology,113:19-23(1996))。為了減小營養物攝取的向內梯度，制備了psac限制培養基(plm)，其使用這些閾值，同時對于所有其它溶質而言遵循rpmi1640制劑。不受特定理論或機制的約束，據信，與rpmi1640培養基相比，plm培養基的減小的營養物含量會更接近地模仿在體內生理條件下的營養物可用性。dd2和hb3寄生蟲可以在plm中連續繁殖(>2周)，盡管在稍微降低的速率。觀察到，具有低寄生蟲血癥的培養物在plm中較好地生長，但是速率隨著寄生蟲負荷增高而下降，這與營養物限制和培養物中的受感染細胞之間的競爭相一致。不同于在標準rpmi1640培養基中ispa-28對寄生蟲生長的差效力，使用plm的研究揭示了dd2寄生蟲的有效殺死和對hb3的持續弱活性(ic50值分別為0.66±0.20μm和52±19μm；p<10-4；圖3a)。盡管在營養物攝取和寄生蟲生長之間存在非線性關聯，但是這些ic50值與ispa-28實現的psac阻斷的運輸k0.5值相當一致。實施例8本實施例證實了dd2xhb3遺傳雜交的后代中的ispa-28生長抑制表型。最近，使用獨立的運輸表型和該遺傳雜交的連鎖分析已經將2個得自寄生蟲染色體3的clag3基因與宿主膜處的psac介導的溶質攝取相關聯(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011))。在這里，生長抑制研究揭示了后代克隆的寬范圍的ispa-28效力，許多后代模仿一個或另一個親本。因為hb3和有些后代具有不可精確估測的高生長ic50值，所以使用在3μmispa-28(最佳地區分親本表型的濃度)的生長抑制進行連鎖分析(圖3b)。該分析鑒別了ispa-28生長抑制與clag3基因座的主要關聯，從而提供了該基因座在抑制溶質運輸和ispa-28殺死寄生蟲兩者中的作用的證據。通過除去clag3基因座的作用，尋找額外的促成峰；該方案沒有鑒別出其它統計上顯著的基因組基因座。繪圖的基因座是在寄生蟲染色體3的近端端部處，且含有大約40個基因。為了確定clag3基因是否負責ispa-28介導的殺死，用hb33rec(通過hb3的等位基因交換轉染產生的寄生蟲克隆，以用得自dd2的clag3.1的對應片段替代天然clag3.2基因的3’末端)進行了生長抑制研究。當表達該嵌合基因時，hb33rec表現出ispa-28的高親和力抑制(k0.5為51±9nm，相對于dd2沒有差異，p＝0.88)(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011))。在這里，在生長抑制研究中與plm一起使用hb33rec，并發現它在與dd2匹配的水平對ispa-28是敏感的。因為hb33rec在其它方面與抗性的hb3系是同基因的，所以該發現指示，ispa-28主要通過對clag3產物和有關的通道活性的作用而殺死寄生蟲。此外，檢測ispa-28介導的殺死對營養物限制的要求支持了psac在寄生蟲營養物獲取中的作用。實施例9本實施例證實了通過ispa-28介導的殺死對抗性的clag3等位基因的選擇。大多數實驗室寄生蟲系攜帶2個clag3基因拷貝，二者都在染色體3基因座的有義鏈上。表觀遺傳的機制控制這些基因的表達，各個寄生蟲優先表達2個等位基因之一。在無性復制后，大多數子代寄生蟲繼續表達相同的等位基因，但是少數子代寄生蟲發生轉換并表達另一個等位基因。在體內，瘧疾寄生蟲和其它病原體使用基因轉換來逃避宿主針對關鍵性的表面暴露的抗原的免疫應答。以前使用ispa-28來檢驗clag3基因轉換(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011))。該化合物是與dd2clag3.1基因表達有關的通道的有效的且特異性的抑制劑；它對通過dd2clag3.2或任一個clag3在無關寄生蟲系中的表達形成的通道幾乎沒有或沒有活性。ispa-28結合位點局限于clag3.1產物的c-端；在該區域內的短超變結構域暴露于紅細胞表面處，且可以限定ispa-28結合槽。通過在含有ispa-28和山梨醇(一種具有高psac滲透性的糖醇)的溶液中的滲透性裂解，使用ispa-28來選擇表達dd2clag3.1等位基因的細胞。山梨醇會針對該等位基因進行選擇，因為滲透性裂解會消除其通道未被ispa-28阻斷的受感染細胞。應當指出，對3個繼承了dd2clag3基因座的后代克隆進行這些選擇，但是沒有對dd2進行，因為該親本系已經排它地表達clag3.1。這些選擇對hb3或繼承了它的clag3基因座的后代克隆沒有作用，因為2個hb3等位基因中的任一個都不編碼高親和力ispa-28抑制。在這里，假定由ispa-28實現的體外生長抑制也可以針對表達單個clag3基因的細胞進行選擇。不受特定理論或機制的約束，據信，盡管山梨醇誘導的滲透性裂解會選擇表達ispa-28敏感的clag3.1的細胞，但是在plm中的生長抑制將有利于表達抗性的clag3.2等位基因的細胞，因為僅僅其通道沒有被ispa-28阻斷的寄生蟲會滿足它們的營養物需要。檢驗了后代克隆7c20，其攜帶dd2clag3基因座且在未選擇的培養物中表達2個等位基因(圖4a-4b)。在山梨醇和ispa-28中進行滲透性裂解選擇以后，存活的寄生蟲具有與dd2親本匹配的psac抑制劑親和力，且主要表達clag3.1等位基因。然后在含有5μmispa-28的plm中繁殖培養物共計10天；在該處理過程中對涂片的顯微鏡檢查揭示了培養物的幾乎完全滅菌。對在該第二處理中存活的寄生蟲的運輸研究揭示了ispa-28親和力的顯著下降，從而指示使用psac抑制劑的體外繁殖可以用于選擇改變的通道表型。rt-pcr證實了針對clag3.1的強陰性選擇，以產生優先表達clag3.2的寄生蟲群體。在其它染色體上的clag基因的表達也存在不大的變化，這提示，這些旁系同源物也可能促進psac活性。ispa-28對體外生長抑制和對運輸誘導的滲透性裂解的敏感性的相反作用，允許任一個clag3等位基因的純化選擇，并揭示了與通道表型的嚴格關聯。令人驚奇地，dd2親本系保持在未選擇的培養物中排它表達clag3.1，盡管與7c20在clag3基因座處是同基因的(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011))。為了探究可能的機制，尋找它來選擇表達替代性的clag3.2等位基因的dd2寄生蟲。使用ispa-43的滲透性裂解試驗了運輸選擇，所述ispa-43是一種在結構上獨特的psac抑制劑，其對通過dd2clag3.2的表達形成的通道的親和力是clag3.1的10倍。盡管該方案已經成功地用于選擇表達clag3.2的7c20寄生蟲(nguitragool等人,cell,145:665-677(2011)，但是它不足以影響dd2寄生蟲中的通道表型，盡管歷時4個月進行了重復選擇。用在含有ispa-28的plm中的生長抑制，嘗試了陰性選擇。在共計17天的2輪使用5μmispa-28的藥物壓力以后，在有限稀釋后鑒別和表征了抗性細胞，以得到克隆dd2-plm28。與主要通過psac抑制的殺死相一致，使用該抗性克隆的運輸研究揭示了抑制劑親和力的顯著下降(圖5a)。盡管ispa-28劑量應答在數量上與相同的基于plm的選擇以后的7c20寄生蟲匹配(上面的實線,圖5a)，但是全長clag3.2轉錄物仍然是不可檢測的，從而排除了基因轉換的簡單預測?？紤]了2個clag3基因之間的自發重組，并使用正向clag3.1引物和反向clag3.2引物鑒別了嵌合的clag3轉錄物；pcr證實，該嵌合體存在于選擇的寄生蟲的基因組中，但是在原始dd2系中缺失。使用clag3特異性的探針的dna印跡法在選擇的克隆中檢測出3個離散帶，但是在未選擇的dd2寄生蟲中僅檢測出預期的2個帶，其涉入在dd2-plm28中產生3個clag3基因的重組事件。約16kb的新帶的大小與dd2-plm28中的clag3.1和clag3.2之間的同源重組相一致。dna測序指示，該嵌合基因驅動它的5’非翻譯區和來自clag3.1的基因的前約70％。在距離起始密碼子3680和3965堿基對處的單核苷酸多態性之間的交換以后，該基因攜帶clag3.2的3’末端。因而，該嵌合基因由clag3.1啟動子驅動，但是編碼具有clag3.2的c-端可變結構域的蛋白。該改變的c-端導致對營養物攝取的降低的ispa-28效力，并且因此導致該克隆在所述選擇中的存活。不受特定理論或機制的約束，據信，提議的同源重組也會產生具有單個clag3基因和高ispa-28親和力的寄生蟲，但是沒有預見到該重組會幸免于在含有ispa-28的plm中的生長抑制選擇。然后使用定量rt-pcr來檢驗clag基因在dd2-plm28中的轉錄，并發現所述嵌合基因被優先表達(是clag3.1的8.9±1.3倍，p<0.002)。使用在含ispa-28的山梨醇中的基于運輸的選擇，檢驗dd2-plm28是否可以經歷表達轉換。該二次選擇產生了幾乎排它地表達天然clag3.1的寄生蟲(plm-rev,圖5b)。如預期的，運輸研究揭示了與原始dd2系相同的ispa-28劑量應答。因而，新的嵌合的clag3基因可以經歷表觀遺傳的沉默和與clag3.1的轉換。該基因的啟動子區域的dna測序沒有揭示相對于7c20的啟動子區域的任何突變。不受特定理論或機制的約束，據信，2個clag3基因之間的重組相對容易地發生，這與寄生蟲的亞端粒區域中的頻繁重組事件的報道相一致(freitas-junior等人,nature,407:1018-22(2000))。還認為，這樣的重組事件可能用于增加psac表型的多樣性，在這里似乎會提供具有3個clag3基因的寄生蟲在選擇壓力下的存活。實施例10本實施例證實了psac抑制劑在plm和標準培養基中的生長抑制作用的對比。呋塞米和丹曲林是已知的具有相對較低的psac親和力的非特異性抑制劑。這些化合物也會被血清吸附，卻是被批準用于其它人疾病的治療劑。它們在標準培養基中對寄生蟲生長僅是弱有效的，但是在plm中具有顯著提高的活性。還試驗了8種高親和力psac抑制劑，它們得自最近通過高通量篩選鑒別出的5種獨特支架(pillai等人,mol.pharmacol.,77:724-733(2010))。當降低營養物濃度時，每種表現出顯著提高的效能，從而強化了所述通道在營養物獲取中的作用的證據。效力的提高程度是可變的，但是許多化合物在營養物限制后表現出在寄生蟲殺死方面的超過100倍提高(ic50比率,表5)。諸如抑制劑:通道相互作用的化學計量學和引起的通道阻斷的濃度依賴性的變化、培養物中的化合物穩定性、以及血清的吸附等因素可能影響該比率。為了探究治療潛力，在體外檢驗了hela細胞細胞毒性。發現幾種有效的psac抑制劑是無毒的，且對寄生蟲殺死是高度特異性的(表6)。表6最后，用氯喹、甲氟喹和青蒿素(被批準的作用于細胞內寄生蟲中的無關靶標的抗瘧疾藥)進行了體外生長抑制實驗。這些藥物不會抑制psac介導的溶質攝取。與psac抑制劑的提高殺死相比，這些藥物在plm中的有效性稍微低于在rpmi中(表5)，從而排除了改進的體外生長條件的非特異性作用。不受特定理論或機制的約束，據信，在營養物限制下psac抑制劑的寄生蟲殺死的穩健提高不同于對現有抗瘧疾藥的作用，并且因此涉及新穎的作用機理。因為分離株-特異性的和廣譜的psac抑制劑在plm中表現出提高的效力，所以這些研究提供了psac對細胞內寄生蟲的營養物攝取的影響的實驗證據。本文引用的所有的參考文獻，包括出版物、專利申請和專利，通過引用以如同每一參考文獻單獨且特別表示通過引用結合的相同程度結合于此，并且在本文中完全闡述。術語“一個”和”一種”和”所述”以及相似指示詞在描述本發明的上下文中(特別是在后附權利要求中)的使用應該解釋為涵蓋單數和復數，除非另外在本文中指明或者明顯與上下文相抵觸。術語“包括”，“具有”，“包含”，和“含有”應該被解釋為開放的術語(即，意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。本文中數值范圍的引用僅意欲作為單獨引用落入該范圍的每個獨立值的速記方法，除非本文中另外指明，并且每個獨立值結合在本說明書中，如同其在本文中獨立地引用那樣。本文所述的所有方法可以以任何適當的順序進行，除非本文另外指明或者明顯與上下文相抵觸。本文提供的任何和全部實例或示例性語言(例如，“諸如”)的使用僅意欲更好地舉例說明本發明，并且不產生對本發明范圍的限制，除非另外要求。在本說明書中沒有任何語言應該被解釋為指示對實施本發明是重要的任何未要求的元件。本文記述了本發明的優選的實施方案，包括本發明人已知的用于實施本發明的最佳模式。當閱讀前述說明書后，對于本領域的普通技術人員，這些優選實施方案的變化可以變得顯而易見。本發明人預計熟練的技術人員適當使用所有變化，并且本發明人意欲本發明以與本文具體描述不同的方式實施。因此，本發明包括在后附權利要求中引用的主題由現行法律所允許的所有改進和等價物。此外，本發明包括上述要素以其所有可能的變化的任意組合，除非本文另外指明，或者明顯與上下文相抵觸。序列表<110>美國衛生和人力服務部<120>用于治療或預防瘧疾的瘧原蟲表面陰離子通道抑制劑<130>709937<150>us61/474,583<151>2011-04-12<160>79<170>patentin3.5版<210>1<211>4254<212>dna<213>惡性瘧原蟲<400>1atggtttcattttttaaaactccaatctttattttaattatctttttatacttaaatgaa60aaggtaatatgttcaataaatgaaaatcaaaatgaaaatgataccattagtcaaaatgtc120aaccaacatgaaaatattaatcaaaatgtaaatgataatgacaatattgaacaattaaaa180tccatgattggaaatgatgaactacataagaatttaacaatattagaaaaattaatttta240gagtctttagaaaaagataaattaaaatatcctctccttaaacaaggaactgaacaattg300atagatatatcaaaatttaataaaaaaaatattacagatgcggatgatgaaacgtacatc360atacccaccgtccaatcaacgtttcacgatattgtgaaatacgaacatcttataaaagaa420caatcaatagaaatttacaattctgatatatcagataaaattaagaaaaaaatttttata480gtaagaacattgaaaaccataaaattaatgcttataccattaaactcgtacaaacaaaat540aatgacttgaaatctgcactcgaagaattaaataatgtatttacaaacaaagaagctcaa600gaggaaagcagtccaataggcgaccatgggacattctttagaaaattgttaacacatgtt660agaacaattaaagaaaatgaagatatagaaaataaaggagaaacacttatattaggcgat720aataaaatagatgtaatgaattcaaacgatttcttttttacaaccaactcaaatgtaaaa780tttatggaaaatttagatgatataacaaatcaatatggattaggtttgattaatcatcta840ggtcctcatttaatagccttgggtcattttaccgtattaaaattagcactaaaaaattac900aaaaactattttgaagcaaaaagtattaaattttttagttggcaaaaaattttagagttc960tccatgtctgatagatttaaagttcttgatatgatgtgtgaccatgaatctgtatactat1020tccgaaaaaaaacgtagaaaaacatatttaaaagttgacagatcaaatacatctatggaa1080tgtaatatattggaatatttattacattattttaataaataccaactagaaataattaaa1140actacacaagatactgattttgacttacatggtatgatggaacataaatatataaaagat1200tatttcttttcatttatgtgtaatgatcctaaagaatgtattatttatcatacgaatcaa1260tttaaaaaagaagccaacgaagaaaacacatttcctgaacaagaagaacctaaccgtcaa1320ataagtgcatttaatttatatttaaattattattatttcatgaaacgttatagttcatat1380ggagtaaaaaagacattatatgttcatttattaaatttaactggacttttaaattatgat1440acaagagcatacgtgacatcactttatttaccaggatattacaacgctgtcgaaatgtct1500tttacggaagaaaaagagttttccaaactttttgaaagcttaatacaatgtattgaaaaa1560tgccattcagaccaagcaaggcaaatatcaaaagatagtaatttacttaataatataaca1620aaatgtgatttgtgtaaaggagcctttttatatgctaatatgaaattcgatgaagttcct1680tcaatgttgcaaaaattttacgtatatttaactaaaggtctcaaaatacaaaaagtatca1740tcactaatcaaaacgctagatatatatcaagattacagcaattacttatcacatgatatt1800aattggtacacattcctatttttatttagacttacaagttttaaagaaattgcaaagaaa1860aatgttgctgaagcaatgtatttaaatataaaagatgaagacacattcaacaaaacggta1920gtaacaaactattggtacccatctcctataaaaaaatattatacattatatgttagaaaa1980catataccaaataatttagtagatgaattggagaaattaatgaaaagtggcactttagaa2040aaaatgaaaaaatctctcacctttttagtacatgtgaattcatttttacaattagatttt2100ttccatcaattaaatgaaccacctcttggattacctcgatcatatccattatcgttagtt2160ctcgaacataaatttaaagaatggatgaacagttcgccagcaggtttctatttttcaaat2220tatcaaaatccatatatcagaaaagatttgcatgataaagttttatcacaaaaatttgaa2280ccacctaaaatgaatcagtggaacaaagttttgaaatcattaattgaatgcgcatatgat2340atgtattttgaacagagacatgttaaaaatttatataaatatcataacatttataatata2400aataacaaattaatgttaatgcgagattcaatcgatttgtataaaaacaattttgacgat2460gtgttattttttgcggatatatttaatatgagaaaatatatgacagctacaccagtatat2520aaaaaagtaaaagacagagtgtaccatacattgcatagtattacaggaaattctgtcaat2580ttttataaatatggtattatatatggatttaaagtaaacaaagaaatattaaaagaagtt2640gtcgatgaattgtattccatctataattttaacaccgacatatttacggatacttccttt2700ttacaaaccgtttatttattatttagaagaatagaagaaacctataggacccaaagaaga2760gatgataaaattagtgtgaataacgtttttttcatgaatgttgctaataattattccaaa2820ttaaacaaagaagaaagagaaatcgaaatacataattccatggcatcaagatattatgca2880aaaacgatgtttgcagcatttcaaatgttattttcaacaatgttgagcaacaatgtagat2940aatcttgataaagcatatggattaagtgaaaatatccaagtagcaacaagtacttccgct3000tttcttacttttgcatatgtatataacggaagtataatggatagtgtgactaacagttta3060ttgccaccatatgcgaagaaacctataacacaattaaaatatggaaaaaccttcgttttc3120tcaaactatttcatgctagcatccaaaatgtatgatatgttaaattataaaaatttaagt3180cttttatgtgaatatcaggctgtggcaagtgccaatttctactctgctaaaaaggtaggt3240cagtttcttggaagaaaatttttacccataactacatattttctagtaatgagaattagt3300tggacacatgcttttacaactggacaacatttgattagcgcttttggttccccaagttct3360actgctaatggtaaaagtaatgctagtggttataaatcccctgaaagttttttcttcact3420cacggacttgctgctgaagcatccaaatatttatttttttattttttcacaaatttatac3480cttgatgcctacaaat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