本發(fā)明是關(guān)于鹽酸阿比多爾在二型單純胞疹病毒感染方面的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(HSV)為DNA病毒，大小約180納米，呈球形，由核衣殼及病毒包膜組成。依據(jù)抗原性不同分為一型和二型。一型主要由口唇病灶獲得，二型可從生殖器病灶分離獲得，二型主要引起生殖器部位或新生兒感染，但兩型病毒感染部位并無嚴(yán)格界限。相對而言，二型往往更難治愈。二型主要通過性接觸傳播，二型單純皰疹病毒引起的疾病即生殖器皰疹是一種復(fù)發(fā)率高，難治愈的性傳播疾病之一，因?yàn)檫@種病毒相當(dāng)頑固，他可在感覺神經(jīng)節(jié)中終身潛伏，當(dāng)機(jī)體受到多種因素如紫外線、發(fā)熱、創(chuàng)傷和情緒緊張、細(xì)菌或病毒感染以及使用腎上腺素等影響后，在缺少預(yù)防的狀態(tài)下，約有80％的原發(fā)性病人可再次復(fù)發(fā)。所以要治愈，必須把以內(nèi)的毒素徹底殺死即可不再復(fù)發(fā)。新生兒可在娩出時(shí)通過患有生殖器皰疹母親的產(chǎn)道也會(huì)受染，病毒亦可由子宮頸上行而感染胎兒。所以對于二型單純皰疹病毒引起的疾病不可小視。[New England Journal of Medicine,2000,342(12):844-850.]。
至今為止，對治療二型單純皰疹病毒引起的疾病仍然是一個(gè)棘手的問題。以往對單純皰疹病毒臨床上的治療主要使用阿昔洛韋和西多福韋等藥物。可效果并不佳，因?yàn)樵l(fā)性感染人群有80％的概率會(huì)復(fù)發(fā)。同時(shí)，有報(bào)道指出國內(nèi)外已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)室成功分離了阿昔洛韋的耐藥株[Antiviral Research，2008，79:28]。對此，傳統(tǒng)臨床藥物阿昔洛韋對二型單純皰疹病毒可能產(chǎn)生耐藥性，綜上所述，對新藥研究是十分有必要的。
鹽酸阿比多爾，對多種病毒具有抗病毒廣譜作用已被廣泛報(bào)道[Arbidol:a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion.Curr Med Chem.2008,15(10):997-1005]。其廣譜性的作用機(jī)制源于它存在膜融合抑制作用[Membrane fusion.Nature Structural&Molecular Biology.2008,15(7):658-64]。但是還未有專門針對鹽酸阿比多爾對二型單純皰疹病毒的抗病毒作用及應(yīng)用的相關(guān)研究與文獻(xiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供鹽酸阿比多爾在治療抗二型單純皰疹病毒的藥物中的應(yīng)用。
具體而言，為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
本發(fā)明提供了如結(jié)構(gòu)式(1)所示的鹽酸阿比多爾在制備預(yù)防和治療抗二型單純胞疹病毒的藥物中的應(yīng)用,
其中：其中HO-代表羥基，Br-代表溴。
所述的藥物是以結(jié)構(gòu)式(II)所示的鹽酸阿比多爾作為有效成分的藥物,
所述藥物為鹽酸阿比多爾及其藥學(xué)上可接受的鹽及其在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
一種用于治療抗二型單純胞疹病毒的藥物組合物，所述的藥物組合物含有如式(I)所示的鹽酸阿比多爾，
所述的藥物組合物以式(I)所示的鹽酸阿比多爾作為有效成份，
所述的藥物組合物含有式(I)所示的鹽酸阿比多爾及其藥學(xué)上可接受的鹽及其在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
所述藥物的劑型為丸劑、片劑、膠囊或口服液。
本發(fā)明的化合物的體外半數(shù)細(xì)胞毒性評價(jià)模型為MTT法半數(shù)細(xì)胞毒性的檢測評價(jià)模型。
本發(fā)明所述的MTT法半數(shù)細(xì)胞毒性評價(jià)模型是指使用MTT染色劑能與活細(xì)胞線粒體結(jié)合，可定量檢測出細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(TC50)。
本發(fā)明化合物體外抗病毒給藥模型分別是治療給藥模型和阿比多爾體外抗HSV-2作用靶點(diǎn)探索模型。
本發(fā)明所述的治療給藥模型是加100μL病毒滴度為100TCID50/0.1mL的病毒液到96孔板中，吸附兩小時(shí)，去病毒液，換100μL的倍比稀釋的藥物的維持培養(yǎng)基，72小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變，計(jì)算IC50，評價(jià)藥物治療指數(shù)。
本發(fā)明所述的阿比多爾體外抗HSV-2作用靶點(diǎn)探索模型是HSV-2病毒在Vero細(xì)胞孵育2小時(shí)后，用PBS清洗2遍，用阿比多爾(有效濃度>IC50)處理，在37℃孵育分別3h，6h，24h，棄上清，PBS清洗2遍，加入新鮮培養(yǎng)基，37℃孵育72h后凍板，測定上清病毒滴度。
本發(fā)明通過運(yùn)用三種體外抗病毒藥效評價(jià)模型，評價(jià)鹽酸阿比多爾對二型單純皰疹病毒的抵制作用，首次發(fā)現(xiàn)鹽酸阿比多爾對二型單純皰疹病毒有抗病毒作用，可阻斷二型單純皰疹病毒感染宿主細(xì)胞，可用作治療二型單純皰疹病毒感染方面的疾病治療。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.藥物評價(jià)原理
病毒擴(kuò)增
將非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)按3X105個(gè)/孔，接種至96孔板中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)，待長滿單層。將二型單純皰疹病毒100倍稀釋接種到長滿單層細(xì)胞的96孔板中,置37℃，5％CO2培養(yǎng)兩天(含正常對照組)。
兩天后，病變程度高達(dá)75％以上，置-80℃超低溫冰箱，反復(fù)凍融一次，收集細(xì)胞擴(kuò)增的病毒液，3000r/min離心30分鐘，去沉淀物，分裝小管置-80℃超低溫冰箱長期保存。
二型單純皰疹病毒半數(shù)致死滴度(TCID50)測定
將非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)按3X105個(gè)/孔，接種至96孔板中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)，待長滿單層。加入十倍倍比稀釋的HSV-2病毒液，100μL/孔，37℃孵育2小時(shí)或3000轉(zhuǎn)離心1小時(shí)；棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液，100μL/孔，2日后觀察結(jié)果，記錄CPE。并用Reed-Muench計(jì)算病毒半數(shù)致死滴度(TCID50)[Reed LJ,Muench H.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg,1938,27(3):493-497]。
鹽酸阿比多爾抗二型單純皰疹病毒藥效評價(jià)
96孔板單層細(xì)胞以PBS洗滌1次，加入含約100TCID50的病毒稀釋液100μL/孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，棄去病毒液，加入2倍梯度稀釋的藥物，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，以最大無毒濃度為藥物起始濃度，在34℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2天。記錄細(xì)胞病變(Cytopathogenic Effect，CPE)。細(xì)胞出現(xiàn)CPE按6級標(biāo)準(zhǔn)記錄。記錄CPE后，用MTT染色，進(jìn)行OD值測定。用Reed-Muench法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(IC50)，計(jì)算治療指數(shù)(Selective Index，SI)：SI＝TC50/IC50)。[參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，徐叔云主編》，治療指數(shù)(SI)>1表示有效]。
鹽酸阿比多爾藥物毒性評價(jià)
鹽酸阿比多爾粉末用DMSO溶解后，加入培養(yǎng)液稀釋至20mg/mL，DMSO終濃度為1％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后置4℃保存；過濾后置4℃保存。按每孔約2.5×104細(xì)胞接種到96孔板，24～48h后待細(xì)胞長成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入不同稀釋度的藥物100μL/孔，正常細(xì)胞對照孔加入100μL/孔MEM，37℃5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)2～5天，每孔加MTT溶液(5mg/mL)20μL，置37℃，5％CO2溫箱中繼續(xù)孵育4小時(shí)。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加100μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。按照下列公式計(jì)算抑制率，并用Reed-Muench法計(jì)算50％毒性濃度為藥物半數(shù)有毒濃度(TC50)。計(jì)算抑制率＝(正常組－給藥組)/正常組×100％。
阿比多爾體外抗HSV-2作用靶點(diǎn)探索
先用200μL病毒滴度為100TCID50/0.1mL的病毒液吸附兩小時(shí)。然后去病毒孵育液。用最大無毒濃度的鹽酸阿比多爾藥物在長滿單層的24孔板細(xì)胞板分別作用3、6、24小時(shí)。后去除藥物，換200μL的倍比稀釋的藥物的維持培養(yǎng)基，72小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變，收集病毒液，測試各組的TCID50病毒滴度，評價(jià)作用時(shí)間點(diǎn)。通過作用時(shí)間點(diǎn)分析，我們可以分析出他是在吸附過程殺滅病毒還是吸附后殺滅病毒的，因?yàn)镠SV-2病毒復(fù)制周期大于6小時(shí)。
實(shí)施例2.鹽酸阿比多爾抗病毒模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
鹽酸阿比多爾藥物毒性評價(jià)
鹽酸阿比多爾以DMSO溶解后，完全溶解，無色澄清，加入培養(yǎng)液過濾后，有少許白色析出，震蕩均勻溶液澄清。鹽酸阿比多爾在非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)的半數(shù)有毒濃度(TC50)為(61.3±0.02)μM，最大無毒濃度為48.25μM。
二型單純皰疹病毒半數(shù)致死滴度(TCID50)測定
通過Reed-Muench方法學(xué)，檢測出擴(kuò)增的二型單純皰疹病毒為106.25TCID50/0.1mL。
鹽酸阿比多爾抗二型單純皰疹病毒藥效評價(jià)
通過VERO細(xì)胞病變抑制法及MTT法對鹽酸阿比多爾進(jìn)行藥效評價(jià)，對二型單純皰疹的半數(shù)有效濃度IC50分別為9.49±0.33、8.99±0.29，治療指數(shù)分別是6.46、6.82，有效。而阿昔洛韋的兩種方法的治療止損分別為5.11、5.91，見表1。
表1. VERO細(xì)胞二型單純皰疹病毒病變抑制法及MTT法對阿比多爾進(jìn)行藥效評價(jià)
阿比多爾體外抗HSV-2作用時(shí)間點(diǎn)
先用200μL病毒滴度為100TCID50/0.1mL的病毒液吸附兩小時(shí)。然后去病毒孵育液。使用VERO細(xì)胞的最大無毒濃度為48.25μM的鹽酸阿比多爾藥物在長滿單層的24孔板細(xì)胞板分別作用3、6、24小時(shí)。作用時(shí)間點(diǎn)后去除藥物，換200μL的維持培養(yǎng)基。72小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)3小時(shí)和6小時(shí)藥物作用下，病毒滴度差別不大，分別為4.42±0.14、4.33±0.14[單位：Lg(TCID50/0.1mL)]，而藥物作用24小時(shí)，72小時(shí)候收集的病毒滴度為2.58±0.29[單位：Lg(TCID50/0.1mL)]。可見藥物是在病毒吸附后產(chǎn)生抗病毒藥效作用。具體見表2。
表2鹽酸阿比多爾阻斷二型單純皰疹病毒感染活性