本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及抗瘧藥物—雙氫青蒿素(DHA)在抑制STAT3異常激活藥物中的應(yīng)用。同時，本發(fā)明還涉及一種含有該雙氫青蒿素的抑制藥物，以及該抑制藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DHA是抗瘧中藥青蒿素的重要衍生物和主要活性成分，其藥效是其他青蒿素類衍生物的3～5倍。DHA和青蒿素由著名藥學(xué)家屠呦呦教授所發(fā)現(xiàn)并由此獲得了2015年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎，兩者已被用于治療多種瘧疾尤其是惡性瘧疾、耐藥瘧疾和腦型瘧疾并取得了良好效果，被認為是治療瘧疾的一線藥物。在體內(nèi)，青蒿素及其衍生物迅速轉(zhuǎn)變成DHA后才能發(fā)揮抗瘧活性，分子結(jié)構(gòu)中的過氧化物鍵是DHA消滅瘧原蟲的關(guān)鍵所在。在肝膽小管內(nèi)，DHA被UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶葡糖醛酸化，然后經(jīng)膽總管排入小腸內(nèi)，經(jīng)過多次肝腸循環(huán)最終通過尿液和糞便排出體外。其分布特點是脾臟中濃度最高，其次為腎臟、腎上腺和肝臟。研究發(fā)現(xiàn)，除了抗瘧和抗血吸蟲病，DHA還有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、改善紅斑狼瘡、抗菌和抗病毒等多重藥效。

眾多研究已經(jīng)證實，STAT3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要的促進作用。生理狀態(tài)下，單體的STAT3位于細胞質(zhì)內(nèi)，且無活性，需要磷酸化激活發(fā)揮效應(yīng)。STAT3分子有Tyr 705和Ser 727兩個磷酸化激活位點，Tyr 705為STAT3二聚化、核轉(zhuǎn)位和結(jié)合DNA的關(guān)鍵位點；Ser 727則為ERK1/2和JNK等激活STAT3的位點。Jak2、EGFR和SRC等通過受體/非受體激活途徑激活單體STAT3，二聚化形成同源或異源二聚體，進入胞核內(nèi)與特定靶基因結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄，調(diào)控下游蛋白的表達。正常組織內(nèi)，STAT3的激活迅速而短暫，在腫瘤細胞內(nèi)，STAT3則持續(xù)被激活。激活的STAT3不僅促進正常細胞惡變、腫瘤血管生成和癌細胞遷移，而且維持乳腺癌和頭頸部腫瘤細胞(HNSCC)等腫瘤干細胞的“干細胞”特性。肺癌、肝癌、頭頸鱗癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病等均發(fā)現(xiàn)了高表達的、激活的STAT3，其發(fā)生率在肝癌、肺癌和乳腺癌中大于50％，而在HNSCC細胞則高達95％以上。眾多研究結(jié)果提示，STAT3的激活是正常細胞惡變的必需條件，是維持腫瘤細胞及其干細胞特性的必需條件，是維持腫瘤細胞增殖生長的必需條件，是其他一些癌基因激活的必需條件。此外，STAT3對腫瘤細胞產(chǎn)生放療和化療抵抗也有重要促進作用，如用抑制劑或Decoy寡核苷酸阻斷其激活則能逆轉(zhuǎn)這種放化療抵抗。

許多因素可以激活STAT3，如SRC、EGFR、IL-6、IL-10、CXCL12和COX-2等蛋白和因子能直接或間接激活STAT3，而在低氧等環(huán)境時，同樣可以活化STAT3。由于STAT3是許多信號通路的交匯點和共用信號蛋白，因此，除了腫瘤，其還與多種疾病密切相關(guān)。IL-6等炎癥因子激活STAT3釋放發(fā)熱物質(zhì)或影響免疫細胞進而導(dǎo)致急性炎癥。STAT3能靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，故其對心臟和血管疾病的發(fā)生發(fā)展有重要影響，且是擴張性心肌病進展加重的必要條件。研究還發(fā)現(xiàn)，STAT3激活后可以加重系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床癥狀，并加重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥表現(xiàn)，導(dǎo)致病情的加重。此外，STAT3的自身狀態(tài)還與克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生有關(guān)，且促進潰瘍性結(jié)腸炎向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變。

在腫瘤細胞及炎癥組織中STAT3被持續(xù)激活，將其阻斷能逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。目前，已開發(fā)了多種直接和間接抑制劑阻斷STAT3的激活。直接抑制劑包括Stattic、S3I-1757和BP-1-102等，此類抑制劑與STAT3分子結(jié)合，使之不能發(fā)揮激活功能；間接抑制劑則通過調(diào)控SRC、EGFR和Jak2等蛋白間接抑制STAT3激活，AG490、AZD1480、葫蘆素B和姜黃素等屬于間接抑制劑。盡管上述抑制劑顯著的抗癌效果，但由于穩(wěn)定性、水溶性和毒副作用等原因，只有極少數(shù)抑制劑用于動物實驗及臨床試驗研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種抗瘧常用藥物—雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)在抑制STAT3異常激活中的應(yīng)用。

雙氫青蒿素用于抑制STAT3異常激活，所述雙氫青蒿素的分子式如下：

相較其他STAT3抑制劑，來源于植物的DHA已經(jīng)可以大規(guī)模合成，藥物成本相對較低，對降低治療費用及醫(yī)療負擔(dān)、提高藥物治療的經(jīng)濟性有很大的幫助。

DHA已經(jīng)在臨床上應(yīng)用很長時間，對其藥物本身的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)已清楚掌握，這些臨床經(jīng)驗?zāi)軒椭x擇最佳藥物劑量、用藥周期和用藥方法等，能夠大大縮短臨床試驗時間，是其他任何STAT3抑制劑不能比及的。

DHA對STAT3激活的抑制作用顯著且有較高的特異性，只對異常的細胞和組織STAT3激活有重要的抑制作用，正常細胞和組織受其影響很小，有利于臨床降低毒副作用提高病人的耐受度。

進一步的，雙氫青蒿素用于抑制在低氧或/和IL-6蛋白因子刺激時的STAT3激活。

低氧是細胞內(nèi)常見的微環(huán)境，雙氫青蒿素不僅在常氧時選擇性抑制STAT3激活，此作用在低氧條件下也能發(fā)揮。IL-6蛋白因子能直接或間接激活STAT3，而在低氧等環(huán)境時，同樣可以活化STAT3，雙氫青蒿素對STAT3異常激活的抑制作用在低氧條件或/和IL-6蛋白因子刺激時也能發(fā)揮。

一種抑制藥物，所述抑制藥物含有雙氫青蒿素。

進一步的，所述抑制藥物含有藥物賦形劑或載體。

進一步的，所述藥物賦形劑或載體包括甘油、乙醇、緩沖鹽水、二甲基亞砜、生理鹽水中的一種或幾種。

進一步的，所述抑制藥物中雙青青蒿素濃度為40-200μmol/L。

進一步的，所述的抑制藥物用于對具有STAT3異常激活特性的疾病干預(yù)中。

進一步的，所述的抑制藥物用于對具有STAT3異常激活特性的疾病干預(yù)時間≥12h。

進一步的，所述STAT3異常激活特性的疾病包括腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥性疾病。

所述自身免疫系統(tǒng)疾病和炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、自發(fā)性血小板減少性紫癜、銀屑病、多發(fā)性硬化癥、慢性腎炎、胃炎、胰腺炎、炎癥性肺病、支氣管哮喘、梗阻性腎病、視網(wǎng)膜炎等疾病。

所述腫瘤包括肝癌、乳腺癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、食道癌、直腸癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、黑色素瘤、前列腺癌、腦瘤和宮頸癌等。

進一步的，所述抑制藥物與抗癌藥物或抗炎藥物聯(lián)合使用。

本發(fā)明首先進行體外實驗，選用三種具有代表性的頭頸鱗癌細胞，采用免疫印跡(Western blotting)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等技術(shù)，證明了DHA能抑制Jak2/STAT3信號通路的激活，這種作用在炎癥因子IL-6刺激、低氧環(huán)境下也能發(fā)揮。接著將其與最常用的STAT3抑制劑AG490和AZD1480比較，發(fā)現(xiàn)三種藥物隨著藥物濃度增加均能抑制STAT3激活，表明DHA是一種STAT3激活抑制劑。最后建立移植瘤動物模型，進一步證明DHA能顯著抑制移植瘤的生長，并下調(diào)Jak2和STAT3的激活蛋白，實驗動物無明顯的毒副作用。體外和體內(nèi)的實驗結(jié)果顯示，通過特異性抑制Jak2/STAT3信號激活，DHA可顯著抑制HNSCC細胞的生長。

附圖說明

圖1為常氧狀態(tài)下DHA抑制HNSCC細胞STAT3的激活。

圖2為低氧狀態(tài)下DHA抑制HNSCC細胞STAT3的激活。

圖3為DHA抑制HNSCC細胞p-STAT3表達具有特異性。

圖4為DHA抑制STAT3信號通路上游p-Jak2蛋白表達。

圖5為DHA抑制IL-6引起的Jak2和STAT3激活。

圖6為DHA作為一種新型Jak2/STAT3信號通路抑制劑。

圖7為DHA抑制動物移植瘤組織內(nèi)Jak2/STAT3信號通路的激活。

具體實施方式

實施例一

常氧狀態(tài)下DHA抑制HNSCC細胞STAT3的激活。

配制DHA溶液。稱取DHA粉劑1g，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液17.584ml，無菌環(huán)境下用1ml移液器反復(fù)吹吸將藥物完全溶解，制備成200mM/L的DHA溶液，分裝入無菌小瓶，置于-80℃凍存?zhèn)溆茫脮r現(xiàn)配。

Western blotting檢測DHA對HNSCC細胞相關(guān)蛋白表達情況。細胞蛋白的提取：選取對數(shù)生長期Fadu、Cal-27和Hep-2頭頸鱗癌細胞，消化計數(shù)后以4×10⁵/2ml/well細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入現(xiàn)配制的、含不同濃度DHA的培養(yǎng)基2ml。藥物干預(yù)結(jié)束后加入RAPI裂解液100μl提取細胞蛋白。瘤組織蛋白提取：從液氮中取出瘤組織，將其切成細小碎塊后置入勻漿器勻漿，加入500μl含PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，裂解過程中反復(fù)勻漿研磨徹底裂解組織細胞。然后將組織裂解物移入離心管中，4℃條件下，12000rpm離心15min，吸取上清液置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法定量蛋白濃度，計算出提取的各樣品的蛋白濃度，分裝入200μ1離心管內(nèi)，每管含有40μg蛋白，而后進行蛋白變性。配制8～12％的分離膠，室溫放置30min。待膠凝結(jié)呈果凍狀，配制4％濃縮膠，插入梳子。待膠凝結(jié)后拔出梳子，倒入電泳液，進樣器加入蛋白樣品和標(biāo)準品蛋白Marker作為對照，接通電流，進行SDS-PAGE電泳，時間約2h。結(jié)束后依次放入濾紙、PVDF膜、凝膠，注意正負極，倒入電轉(zhuǎn)液，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，時間約為4h。然后用脫脂奶粉封閉1h并用含一抗的脫脂奶粉與PVDF膜4℃孵育過夜。次日洗膜并孵育二抗1h，采用ECL方法顯影。

常氧狀態(tài)下DHA抑制HNSCC細胞STAT3的激活。三種腫瘤細胞Fadu、Hep-2、Cal-27用DHA干預(yù)24h，F(xiàn)adu用DHA濃度為0、20、40、80、160μmol/L，Hep-2和Cal-27用DHA濃度為0、10、20、40、80μmol/L；抑或一定劑量的DHA作用三種癌細胞，F(xiàn)adu用DHA濃度為160μmol/L，Hep-2和Cal-27用DHA濃度為80μmol/L，用Western blotting檢測0、6h、12h、24h和48h時p-STAT3的表達情況。結(jié)果如圖1所示：腫瘤細胞內(nèi)的p-STAT3隨著DHA濃度和干預(yù)時間的增加而減少，對照組無明顯變化。這說明，DHA明顯抑制STAT3的激活，且與干預(yù)劑量和時間呈依賴關(guān)系。

實施例二

低氧狀態(tài)下DHA抑制HNSCC細胞STAT3的激活。

低氧是惡性腫瘤細胞內(nèi)常見的微環(huán)境，能促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及產(chǎn)生放化療抵抗，故在低氧條件下研究DHA的抗瘤作用有重要意義。

配制DHA溶液。稱取DHA粉劑1g，加入二甲基亞砜DMSO溶液10.284ml，乙醇溶液7.3ml，無菌環(huán)境下用1ml移液器反復(fù)吹吸將藥物完全溶解，制備成200mM/L的DHA溶液，分裝入無菌小瓶，置于-80℃凍存?zhèn)溆茫脮r現(xiàn)配。

低氧裝置及低氧條件。微生物培養(yǎng)箱內(nèi)的低氧設(shè)備為自制裝置，低氧裝置由六塊厚8mm的有機玻璃板粘接而成，分為室和蓋兩部分，在室的兩側(cè)分別有控制氣體進出的管道，進氣道靠近底部，出氣道靠近頂部，關(guān)閉上蓋并墊上一層軟橡皮墊，以防漏氣，擰緊固定螺絲，確保缺氧箱完全密閉。我實驗室以往進行的低氧相關(guān)實驗研究可以證實該裝置用于研究低氧的可行性。本次實驗低氧條件為37℃、5％CO₂、1％O₂、94％N₂。進氣流量及容器內(nèi)所需氧分壓達標(biāo)時間又氧化鋯氧分析儀測定。由進氣道通入混合氣(95％N₂，5％CO₂)，同時打開出氣管道，通氣速度為3L/min，通氣8min后，再向低氧裝置內(nèi)通入(1％O₂,94％N₂,5％CO₂)混合氣，通氣速度為3L/min，通氣5min后，箱內(nèi)氧濃度變化由氧化鋯氧分析儀全程監(jiān)測，最終為實驗所需低氧濃度。當(dāng)?shù)脱跹b置內(nèi)氧分壓達標(biāo)時，通氣速度改為低氣流通氣0.8L/min，以維持低氧箱內(nèi)氧濃度，以保證低氧箱內(nèi)氧濃度的穩(wěn)定。通過配制不同氧含量的混合氣獲得相應(yīng)的低氧濃度，本模型誤差極小(<0.02)，尤其是可獲得穩(wěn)定的低氧濃度。本模型方便易行，可滿足各種不同細胞低氧研究的需要。另外，本模型制作經(jīng)濟，操作簡單，可進行高壓滅菌等消毒處理，便于推廣應(yīng)用。

Western blotting檢測DHA對HNSCC細胞相關(guān)蛋白表達情況。細胞蛋白的提取：選取對數(shù)生長期Fadu、Cal-27和Hep-2頭頸鱗癌細胞，消化計數(shù)后以4×10⁵/2ml/well細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入現(xiàn)配制的、含不同濃度DHA的培養(yǎng)基2ml。藥物干預(yù)結(jié)束后加入RAPI裂解液100μl提取細胞蛋白。瘤組織蛋白提取：從液氮中取出瘤組織，將其切成細小碎塊后置入勻漿器勻漿，加入500μl含PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，裂解過程中反復(fù)勻漿研磨徹底裂解組織細胞。然后將組織裂解物移入離心管中，4℃條件下，12000rpm離心15min，吸取上清液置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法定量蛋白濃度，計算出提取的各樣品的蛋白濃度，分裝入200μ1離心管內(nèi)，每管含有40μg蛋白，而后進行蛋白變性。配制8～12％的分離膠，室溫放置30min。待膠凝結(jié)呈果凍狀，配制4％濃縮膠，插入梳子。待膠凝結(jié)后拔出梳子，倒入電泳液，進樣器加入蛋白樣品和標(biāo)準品蛋白Marker作為對照，接通電流，進行SDS-PAGE電泳，時間約2h。結(jié)束后依次放入濾紙、PVDF膜、凝膠，注意正負極，倒入電轉(zhuǎn)液，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，時間約為4h。然后用脫脂奶粉封閉1h并用含一抗的脫脂奶粉與PVDF膜4℃孵育過夜。次日洗膜并孵育二抗1h，采用ECL方法顯影。

本實驗選擇低氧的條件為1％O₂，DHA干預(yù)Fadu、Hep-2、Cal-27三種HNSCC細胞24h，F(xiàn)adu用DHA干預(yù)濃度為160μmol/L，Cal-27和Hep-2用DHA干預(yù)濃度為80μmol/L。結(jié)果如圖2所示，p-STAT3蛋白表達仍受到明顯抑制(“+”為加入相應(yīng)藥物或低氧處理，“-”為加入溶劑對照，Actin為蛋白內(nèi)參)。因此，在低氧環(huán)境下，DHA也能抑制STAT3蛋白的激活。

實施例三

DHA抑制HNSCC細胞p-STAT3表達具有特異性。

配制DHA溶液。稱取DHA粉劑1g，加入甘油10.584ml，緩沖鹽水7ml，無菌環(huán)境下用1ml移液器反復(fù)吹吸將藥物完全溶解，制備成200mM/L的DHA溶液，分裝入無菌小瓶，置于-80℃凍存?zhèn)溆茫脮r現(xiàn)配。

Western blotting檢測DHA對HNSCC細胞相關(guān)蛋白表達情況。細胞蛋白的提取：選取對數(shù)生長期Fadu、Cal-27和Hep-2頭頸鱗癌細胞，消化計數(shù)后以4×10⁵/2ml/well細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入現(xiàn)配制的、含不同濃度DHA的培養(yǎng)基2ml。藥物干預(yù)結(jié)束后加入RAPI裂解液100μl提取細胞蛋白。瘤組織蛋白提取：從液氮中取出瘤組織，將其切成細小碎塊后置入勻漿器勻漿，加入500μl含PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，裂解過程中反復(fù)勻漿研磨徹底裂解組織細胞。然后將組織裂解物移入離心管中，4℃條件下，12000rpm離心15min，吸取上清液置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法定量蛋白濃度，計算出提取的各樣品的蛋白濃度，分裝入200μ1離心管內(nèi)，每管含有40μg蛋白，而后進行蛋白變性。配制8～12％的分離膠，室溫放置30min。待膠凝結(jié)呈果凍狀，配制4％濃縮膠，插入梳子。待膠凝結(jié)后拔出梳子，倒入電泳液，進樣器加入蛋白樣品和標(biāo)準品蛋白Marker作為對照，接通電流，進行SDS-PAGE電泳，時間約2h。結(jié)束后依次放入濾紙、PVDF膜、凝膠，注意正負極，倒入電轉(zhuǎn)液，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，時間約為4h。然后用脫脂奶粉封閉1h并用含一抗的脫脂奶粉與PVDF膜4℃孵育過夜。次日洗膜并孵育二抗1h，采用ECL方法顯影。

三種腫瘤細胞Fadu、Hep-2、Cal-27用DHA干預(yù)24h，F(xiàn)adu用DHA濃度為0、20、40、80、160μmol/L，Hep-2和Cal-27用DHA濃度為0、10、20、40、80μmol/L，結(jié)果如圖3所示，p-STAT3明顯被抑制，而p-Erk1/2和p-Akt蛋白無明顯變化。

實施例四

DHA抑制STAT3信號通路上游p-Jak2蛋白表達。

配制DHA溶液。稱取DHA粉劑1g，加入甘油7.584ml，生理鹽水10ml，無菌環(huán)境下用1ml移液器反復(fù)吹吸將藥物完全溶解，制備成200mM/L的DHA溶液，分裝入無菌小瓶，置于-80℃凍存?zhèn)溆茫脮r現(xiàn)配。

Western blotting檢測DHA對HNSCC細胞相關(guān)蛋白表達情況。細胞蛋白的提取：選取對數(shù)生長期Fadu、Cal-27和Hep-2頭頸鱗癌細胞，消化計數(shù)后以4×10⁵/2ml/well細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入現(xiàn)配制的、含不同濃度DHA的培養(yǎng)基2ml。藥物干預(yù)結(jié)束后加入RAPI裂解液100μl提取細胞蛋白。瘤組織蛋白提取：從液氮中取出瘤組織，將其切成細小碎塊后置入勻漿器勻漿，加入500μl含PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，裂解過程中反復(fù)勻漿研磨徹底裂解組織細胞。然后將組織裂解物移入離心管中，4℃條件下，12000rpm離心15min，吸取上清液置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法定量蛋白濃度，計算出提取的各樣品的蛋白濃度，分裝入200μ1離心管內(nèi)，每管含有40μg蛋白，而后進行蛋白變性。配制8～12％的分離膠，室溫放置30min。待膠凝結(jié)呈果凍狀，配制4％濃縮膠，插入梳子。待膠凝結(jié)后拔出梳子，倒入電泳液，進樣器加入蛋白樣品和標(biāo)準品蛋白Marker作為對照，接通電流，進行SDS-PAGE電泳，時間約2h。結(jié)束后依次放入濾紙、PVDF膜、凝膠，注意正負極，倒入電轉(zhuǎn)液，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，時間約為4h。然后用脫脂奶粉封閉1h并用含一抗的脫脂奶粉與PVDF膜4℃孵育過夜。次日洗膜并孵育二抗1h，采用ECL方法顯影。

三種腫瘤細胞Fadu、Hep-2、Cal-27用DHA干預(yù)24h，F(xiàn)adu用DHA濃度為0、20、40、80、160μmol/L，Hep-2和Cal-27用DHA濃度為0、10、20、40、80μmol/L，觀察p-EGFR、p-Jak2、p-SRC以及p-STAT3蛋白表達情況。結(jié)果如圖4提示，三種腫瘤細胞p-Jak2和p-STAT3蛋白表達隨著DHA劑量的增加而下降，而p-EGFR和p-SRC兩種蛋白則無明顯改變。

實施例五

DHA抑制IL-6引起的Jak2和STAT3激活。

配制DHA溶液。稱取DHA粉劑1g，加入二甲基亞砜DMSO溶液6.584ml，甘油11ml，無菌環(huán)境下用1ml移液器反復(fù)吹吸將藥物完全溶解，制備成200mM/L的DHA溶液，分裝入無菌小瓶，置于-80℃凍存?zhèn)溆茫脮r現(xiàn)配。

Western blotting檢測DHA對HNSCC細胞相關(guān)蛋白表達情況。細胞蛋白的提取：選取對數(shù)生長期Fadu、Cal-27和Hep-2頭頸鱗癌細胞，消化計數(shù)后以4×10⁵/2ml/well細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入現(xiàn)配制的、含不同濃度DHA的培養(yǎng)基2ml。藥物干預(yù)結(jié)束后加入RAPI裂解液100μl提取細胞蛋白。瘤組織蛋白提取：從液氮中取出瘤組織，將其切成細小碎塊后置入勻漿器勻漿，加入500μl含PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，裂解過程中反復(fù)勻漿研磨徹底裂解組織細胞。然后將組織裂解物移入離心管中，4℃條件下，12000rpm離心15min，吸取上清液置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法定量蛋白濃度，計算出提取的各樣品的蛋白濃度，分裝入200μ1離心管內(nèi)，每管含有40μg蛋白，而后進行蛋白變性。配制8～12％的分離膠，室溫放置30min。待膠凝結(jié)呈果凍狀，配制4％濃縮膠，插入梳子。待膠凝結(jié)后拔出梳子，倒入電泳液，進樣器加入蛋白樣品和標(biāo)準品蛋白Marker作為對照，接通電流，進行SDS-PAGE電泳，時間約2h。結(jié)束后依次放入濾紙、PVDF膜、凝膠，注意正負極，倒入電轉(zhuǎn)液，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，時間約為4h。然后用脫脂奶粉封閉1h并用含一抗的脫脂奶粉與PVDF膜4℃孵育過夜。次日洗膜并孵育二抗1h，采用ECL方法顯影。

Fadu用DHA濃度為160μmol/L，Hep-2和Cal-27用DHA濃度為80μmol/L，DHA干預(yù)24h后，加入人重組IL-6(20ng)干預(yù)1h(“+”為加入相應(yīng)藥物處理，“-”為加入溶劑對照，Actin為蛋白內(nèi)參)。結(jié)果如圖5提示，IL-6能使三種癌細胞內(nèi)的p-Jak2和p-STAT3蛋白表達明顯增加，而DHA則明顯減少兩種蛋白。

實施例六

DHA可作為一種新型Jak2/STAT3信號通路抑制劑。

配制DHA溶液。稱取DHA粉劑1g，加入乙醇17.584ml，無菌環(huán)境下用1ml移液器反復(fù)吹吸將藥物完全溶解，制備成200mM/L的DHA溶液，分裝入無菌小瓶，AZD1480和AG490均為100mM/L濃度的二甲基亞砜DMSO溶液，三種藥物置于-80℃凍存?zhèn)溆茫脮r現(xiàn)配。

Western blotting檢測DHA對HNSCC細胞相關(guān)蛋白表達情況。細胞蛋白的提取：選取對數(shù)生長期Fadu、Cal-27和Hep-2頭頸鱗癌細胞，消化計數(shù)后以4×10⁵/2ml/well細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后用不同濃度的DHA、AZD1480及AG490分別干預(yù)實驗的三種鱗癌細胞。藥物干預(yù)結(jié)束后加入RAPI裂解液100μl提取細胞蛋白。瘤組織蛋白提取：從液氮中取出瘤組織，將其切成細小碎塊后置入勻漿器勻漿，加入500μl含PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，裂解過程中反復(fù)勻漿研磨徹底裂解組織細胞。然后將組織裂解物移入離心管中，4℃條件下，12000rpm離心15min，吸取上清液置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法定量蛋白濃度，計算出提取的各樣品的蛋白濃度，分裝入200μ1離心管內(nèi)，每管含有40μg蛋白，而后進行蛋白變性。配制8～12％的分離膠，室溫放置30min。待膠凝結(jié)呈果凍狀，配制4％濃縮膠，插入梳子。待膠凝結(jié)后拔出梳子，倒入電泳液，進樣器加入蛋白樣品和標(biāo)準品蛋白Marker作為對照，接通電流，進行SDS-PAGE電泳，時間約2h。結(jié)束后依次放入濾紙、PVDF膜、凝膠，注意正負極，倒入電轉(zhuǎn)液，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，時間約為4h。然后用脫脂奶粉封閉1h并用含一抗的脫脂奶粉與PVDF膜4℃孵育過夜。次日洗膜并孵育二抗1h，采用ECL方法顯影。

AZD1480及AG490是兩種STAT3信號通路特異抑制劑，本部分研究先將這兩種藥物以不同的劑量干預(yù)Fadu、Cal-27和Hep-2細胞24h，而后用MTT法觀察三種腫瘤細胞活力受抑制情況，根據(jù)其結(jié)果計算出AZD1480及AG490相應(yīng)的IC50值。再根據(jù)IC50值確定兩種抑制劑的干預(yù)濃度(參考DHA濃度選擇，即最大劑量大于IC50值，而其余值小于IC50值，濃度梯度倍比設(shè)定)。抑制劑濃度設(shè)定后，用不同濃度的DHA、AZD1480及AG490分別干預(yù)實驗的三種鱗癌細胞24h。p-Jak2和p-STAT3蛋白的表達均隨著實驗藥物的濃度而下降。此結(jié)果如圖6所示，與特異性STAT3抑制劑AZD1480和AG490作用相似，DHA同樣能明顯抑制頭頸鱗癌細胞Jak2和STAT3蛋白的激活。而且，在同樣的濃度，DHA對Hep-2細胞抑制較AG490對兩種激活的蛋白抑制更顯著。

實施例七

DHA抑制動物移植瘤組織內(nèi)Jak2/STAT3信號通路的激活。

配制DHA溶液。稱取DHA粉劑1g，加入乙醇9.584ml，生理鹽水8ml，無菌環(huán)境下用1ml移液器反復(fù)吹吸將藥物完全溶解，制備成200mM/L的DHA溶液，分裝入無菌小瓶，置于-80℃凍存?zhèn)溆茫脮r現(xiàn)配。

BALb/c雄性裸鼠的飼養(yǎng)和移植瘤模型的建立。14只BALb/c雄性裸鼠(4～6周，18～20g重)，飼養(yǎng)于白求恩國際和平醫(yī)院實驗動物中心(SPF級)，飼養(yǎng)室為24℃恒溫且隔音處理，每天的明暗時間為12/12h，空氣層流過濾，無菌飼料和滅菌水供動物自由食用，動物飼養(yǎng)于籠中，每個籠最多5只動物，定期更換墊料。裸鼠到達實驗動物中心飼養(yǎng)1周，待其適應(yīng)新的環(huán)境且觀察動物一般情況良好后，消化收集對數(shù)生長期的Cal-27細胞，計數(shù)后將其濃縮為5×10⁷/ml Hanks單細胞溶液，按每只0.2ml接種于左側(cè)腹股溝外側(cè)皮下，成功建立移植瘤動物模型。動物實驗全程均在白求恩國際和平醫(yī)院倫理委員會的監(jiān)督和認可下進行。動物分組和DHA干預(yù)：裸鼠移植瘤直徑長至5mm左右時用隨機表進行分組，即DHA組和對照組(n＝7)。DHA組給予50mg/kg，對照組則給予DMSO，兩組動物均采用腹腔內(nèi)注射給藥，連續(xù)注射2/3天休息1天，每周注射5次，干預(yù)時間共計28天。移植瘤體積和動物體重的測量：每天觀察動物精神狀態(tài)、飲食及排便等一般情況，特別注意有無咬傷、腫瘤局部皮膚有無破潰等。每4天用電子游標(biāo)卡尺測量一次腫瘤體積，同時用電子秤稱動物體重，登記和統(tǒng)計測量數(shù)據(jù)，注意對照組和實驗組體重有無顯著差異。腫瘤體積用以下公式進行計算：體積(cm³)＝寬²(cm²)×長(cm)/2。最后一次DHA腹腔注射24h后，先用CO₂麻醉動物，然后采用斷頸方法處死實驗裸鼠。剝?nèi)〉囊浦擦鼋M織分為兩部分，一部分置于多聚甲醛溶液用于免疫組織化學(xué)染色；另一部分置于液氮中用于Western blot分析Jak2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白變化。

免疫組織化學(xué)染色方法。動物瘤組織標(biāo)本按4μm厚度連續(xù)切片，然后附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃過夜。將切片用二甲苯中脫蠟20min 2次；浸于100％乙醇2min 2次；95％乙醇2min 2次；90％乙醇2min 3次；85％乙醇2min 2次；75％乙醇2min 2次。將切片置于枸櫞酸修復(fù)液中，于高壓鍋內(nèi)加熱；高壓鍋煮沸2～3min后停止加熱，然后降至室溫，用PBS洗滌切片5min，共3次。滴加3％過氧化氫封閉過氧化物酶的活性，接著用PBS洗滌5min3次，滴加山羊血清室溫封閉20min。滴加p-Jak2(Tyr1007/1008)和p-STAT3(Tyr705)一抗，按1：100比例稀釋，4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。用PBS洗滌切片5min 3次，滴加山羊抗兔二抗，室溫孵育20min，再用PBS洗滌5min 3次。于切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20min，PBS洗滌5min 3次。顯微鏡下用DAB控制顯色，用自來水徹底沖洗切片。蘇木精復(fù)染3min，1％鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，每次2min，二甲苯浸泡5min2次，中性樹膠封片。DHA實驗組和DMSO對照組的陽性和陰性組織相采用400×的顯微鏡照相保存。

Western blotting檢測DHA對HNSCC細胞相關(guān)蛋白表達情況。細胞蛋白的提取：選取對數(shù)生長期Fadu、Cal-27和Hep-2頭頸鱗癌細胞，消化計數(shù)后以4×10⁵/2ml/well細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后加入現(xiàn)配制的、含不同濃度DHA的培養(yǎng)基2ml。藥物干預(yù)結(jié)束后加入RAPI裂解液100μl提取細胞蛋白。瘤組織蛋白提取：從液氮中取出瘤組織，將其切成細小碎塊后置入勻漿器勻漿，加入500μl含PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min，裂解過程中反復(fù)勻漿研磨徹底裂解組織細胞。然后將組織裂解物移入離心管中，4℃條件下，12000rpm離心15min，吸取上清液置于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法定量蛋白濃度，計算出提取的各樣品的蛋白濃度，分裝入200μ1離心管內(nèi)，每管含有40μg蛋白，而后進行蛋白變性。配制8～12％的分離膠，室溫放置30min。待膠凝結(jié)呈果凍狀，配制4％濃縮膠，插入梳子。待膠凝結(jié)后拔出梳子，倒入電泳液，進樣器加入蛋白樣品和標(biāo)準品蛋白Marker作為對照，接通電流，進行SDS-PAGE電泳，時間約2h。結(jié)束后依次放入濾紙、PVDF膜、凝膠，注意正負極，倒入電轉(zhuǎn)液，將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，時間約為4h。然后用脫脂奶粉封閉1h并用含一抗的脫脂奶粉與PVDF膜4℃孵育過夜。次日洗膜并孵育二抗1h，采用ECL方法顯影。

圖7為DHA抑制動物移植瘤組織內(nèi)Jak2/STAT3信號通路的激活，結(jié)果表明，對照組Jak2和STAT3激活是高表達的，而DHA組兩種蛋白的激活受到顯著抑制。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。