本發明涉及藥物，具體涉及吳茱萸在制備治療瘧疾藥物中的應用，尤其涉及吳茱萸提取物在制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾藥物中的應用。

背景技術：

瘧疾(malaria)是嚴重危害人類身體健康和生命安全、影響社會經濟發展的重要寄生蟲病。瘧疾與艾滋病、結核病一起被世界衛生組織列為全球亟需控制的公共衛生問題，是聯合國千年發展目標中重點防控的3種傳染病之一。根據世界衛生組織報道，僅在2015年內，全球有438000瘧疾死亡病例，并且絕大部分發生在撒哈拉以南的非洲的五歲以下兒童。瘧疾由瘧原蟲引起，其瘧原蟲包括了惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲，其中以惡性瘧原蟲致死率最高。帶有成熟子孢子的雌按蚊叮咬人體后，將瘧原蟲注入人體，經10～20天會發生典型的瘧疾臨床癥狀，可分為四期：前驅期、發冷(寒戰)期、發熱期、出汗期和間歇期。瘧疾的反復發作后，病人會出現貧血、肝脾腫大，甚至出現腦型、超高熱型、厥冷型和胃腸型等兇險癥狀，甚至危及生命。

目前,由于瘧原蟲抗藥性的迅速蔓延,特別是多重抗藥性惡性瘧不斷地擴散與蔓延,在很多瘧疾重災區,可供選擇的抗瘧藥物已十分有限,新藥的產生速度跟不上抗藥性出現的速度。抗瘧藥物的研究開發,主要還是依賴于對原有藥物的結構改造及經驗篩選。在該領域中,經驗方法仍十分有效。但隨著分子生物學的進展,對病原生物的研究逐漸深入,已經發現了瘧原蟲在核酸、蛋白質、糖和磷脂等代謝方面與宿主的代謝上有很多差異。研究者們正利用這些差異作為靶點,進行新抗瘧藥的開發和設計。新的藥物合成手段,如組合化學等,也為加快新藥研究奠定了基礎。另外,從有抗瘧作用的藥用植物中提取有效成份,可以作為抗瘧藥研究和開發的切入點。總之,人類與瘧疾的斗爭任重而道遠,對新藥的需求也更加迫切,新抗瘧藥的市場前景廣闊,這無疑將會帶來更可喜的經濟效益和社會效益。

中醫藥作為瘧疾預防和治療的重要組成部分,具有良好的療效和提高生活質量的優勢,成為瘧疾治療的重要手段之一。在中國著名書籍《本草綱目》和《瘧疾論》記載了如常山、青蒿、鴉膽子、草果和砂仁等是在民間用來治療瘧疾的中草藥。從中草藥青蒿中發現的活性化合物青蒿素用于治療瘧疾取得了很好的效果，廣泛用于臨床，因此從中藥中尋找具有抗瘧活性中草藥和有效成分意義重大。本發明人通過研究發現吳茱萸提取物具有顯著抗瘧作用。

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Evodia rutaecarpa(J uss.)Benth.Var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸Evodia rutaecarpa(J uss.)Benth.Var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實。主要分布于長江流域及華南一帶。吳茱萸始載于《神農本草經》，列為中品，其藥性辛，苦熱，有小毒。歸肝，脾，胃，腎經。其功效主要為溫中止嘔，散寒止痛，助陽止瀉。主要應用于疼痛癥、胃寒嘔吐、呃逆癥、虛寒泄瀉癥等。現代藥理研究發現，吳茱萸有明顯的鎮痛、抗炎、抗胃潰瘍、止嘔、止瀉及降血壓等作用。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于研究設計吳茱萸在制備治療瘧疾藥物中的應用。

本發明提供了吳茱萸提取物在制備治療瘧疾藥物中的應用。

體內外抗瘧活性測定結果顯示，吳茱萸提取物有較好的體內外抗瘧原蟲活性。因此，可用于制備治療瘧疾的藥物。

本發明的另一目的是提供以吳茱萸及其提取物為活性成分，用于制備治療瘧疾的中草藥組合物，尤其用于制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾的中草藥組合物。

本發明所述藥物組合物含有治療有效量的吳茱萸及其提取物為活性成分，以及含有一種或多種中草藥作為輔助藥物或者含有一種或多種藥學上可接受的載體。其中活性成分在藥物組合物中的重量為5-95％。

所述其他可以接受的中草藥，例如：馬鞭草、柴胡、生姜、黃芩、狼牙草、常山、草果、人參、大棗等可以輔助吳茱萸發揮藥效的中草藥。

所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如明膠、聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等、另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發明的藥物組合物可通過口服和外敷給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其職稱常規的固體制劑如片劑、顆粒劑、膠囊等或制成液體制劑如水或油懸浮劑、糖漿等；用于外敷給藥時，可將其制成軟膏劑和經皮給藥的劑型等。

本發明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法制備。例如使吳茱萸與其他中草藥進行提取，然后將其制成所需的劑型。

附圖說明

圖1吳茱萸提取物和陽性藥物(氯喹)對3D7蟲株生存率影響圖

圖中氯喹組(分別為：0、0.01、0.1、1μg/mL)，吳茱萸組(分別為：0、5、15、50μg/mL)，*P<0.05**P<0.01***P<0.001

圖2吳茱萸提取物和陽性藥物(氯喹)在體內對伯氏瘧原蟲感染率影響圖

圖中空白模型組，10mg/kg氯喹組，0.6g/kg吳茱萸提取物組，1.2g/kg吳茱萸提取物組，2.4g/kg吳茱萸提取物組，*P<0.05**P<0.01***P<0.001

具體實施方式

實施例1：吳茱萸提取物的制備

將吳茱萸的干燥果實部分50g粉碎后，以500mL85％乙醇室溫冷浸2次，每次24小時，合并兩次浸出液并過濾，60℃以下減壓回收溶劑，得干浸膏，取干浸膏1g，用二甲基亞砜(DMSO)配制為濃度20mg/mL的儲備液。制得的儲備液用于實施例2。

吳茱萸藥材及浸膏經HPLC-UV進行指紋圖譜分析，吳茱萸藥材和提取物的與標準藥材指紋圖譜完全一致。

實施例2：吳茱萸提取物體外抗瘧活性測定

抗瘧活性可以通過測量瘧原蟲dsDNA含量來確定(Corey,V.C.,et al.,A broad analysis of resistance development in the malaria parasite.Nat Commun,2016.7:p.11901.)。在含20μL連續稀釋測試樣本和氯喹陽性藥物(購自中國食品藥品檢定研究所)的96孔板的每個孔中加入感染了3D7蟲株P.falciparum的紅細胞混懸液(100μL，在RPMI 1640培養基(Gibco)中加入5g/L AlbuMAX(Gibco)和50mg/L慶大霉素(Sigma)，使瘧原蟲血癥達到0.5％，紅細胞壓積達到2％)，然后置于37℃，5％CO2培養箱培養48小時。細胞用裂解液(Tris 2.4g/L,EDTA 1.86g/L,Saponin 0.08g/L,TritonX-100 0.8mL/L)進行裂解，來源于Sigma，dsDNA含量用10000X SYBR Green I試劑(Invitrogen)測定，測定程序參照文獻(Plouffe,D.,et al.,In silico activity profiling reveals the mechanism of action of antimalarials discovered in a high-throughput screen.Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105(26):p.9059-64.)。簡要說來，就是將100μL培育的混合物和按文獻說明配制好100μL SYBR Green I試劑混合，在室溫下避光培育30-60分鐘.然后100μL轉移至黑色酶標板中。將酶標板放入EnSpire熒光酶標儀(PerkinElmer)中，在485nm和535nm的吸光值下讀取酵標板中每孔的熒光信號值。從劑量-效應曲線中計算出IC₅₀。吳茱萸提取物的對3D7的IC₅₀值如下表：

結果顯示，吳茱萸提取物有較好的體外抗瘧原蟲活性。

實施例3：吳茱萸提取物體內抗瘧活性測定

伯氏瘧原蟲伯氏株培養，其所用紅細胞為昆明小鼠紅細胞，其他培養條件與瘧原蟲3D7培養方法一致。本發明用的動物是來自中山大學實驗動物中心，品系為昆明種小鼠，所有的動物實驗過程中對實驗動物保護和使用根據NIH標準進行。對小鼠進行輸血感染，抽取雄性小鼠心臟血液，用5％葡萄糖鹽水將血液稀釋成每0.2mL內含1×10⁶個受感染紅細胞的懸液，腹腔接種小鼠。接種伯氏瘧原蟲3小時后，進行分組給藥，每組8只，組別為：1、空白對照組(灌胃給予生理鹽水)，2、氯喹陽性對照組(灌胃給予10mg/kg)，3、吳茱萸提取物(灌胃給予0.6g/kg、1.2g/kg和2.4g/kg)。每天測量體重無明顯差異，在接種感染后第0、2、4、6天尾靜脈取血涂膜檢查減蟲率,結果顯示，吳茱萸提取物有較好的體內抗瘧原蟲活性。