本發明涉及一種多甲氧基黃酮在制備治療皮膚乳頭狀瘤的藥物上的應用。
背景技術：
：在防御機制中，體內適當的發炎反應可以活化免疫系統，并啟動免疫與發炎反應，清除外來物的傷害。當外來物被清除及組織修補后，急性發炎即停止；若外來物清除不完全、免疫系統不全或解除發炎作用的信號傳遞失調等，就會形成慢性發炎反應，正常細胞或組織受到發炎或免疫細胞產生的自由基的破壞，導致血管過度舒張、組織壞死，產生致癌性影響，其中包含引起DNA堿基突變及蛋白質的結構修飾，影響細胞膜功能或造成細胞內蛋白質或酶的功能喪失。炎癥細胞開始轉變成腫瘤細胞并不斷增生[Allavena,P.,Garlanda,C.,Borrello,M.G.,Sica,A.,andMantovani,A.(2008)Pathwaysconnectinginflammationandcancer.Curr.Opin.Genet.Dev.,18,3-10.]。化學致癌作用通常是在化合物的作用下，誘發腫瘤形成。早在1947年，Bernblum及Shubik的研究結果就證實，在小鼠皮膚表面局部涂抹化學致癌藥物，會使相應部位皮膚形成乳頭狀腫瘤[Berenblum,I.andShubik,P.(1949)Thepersistenceoflatenttumourcellsinducedinthemouse'sskinbyasingleapplicationof9:10-dimethyl-1:2-benzanthracene.Br.J.Cancer,3,384-386.]。這種處理方法能夠縮短長期致癌實驗的時間，涂抹過程中可以清楚觀察到腫瘤生長的動態，有助于了解致癌物在腫瘤發生與發展的不同階段，對腫瘤形成與發展的作用機制[Mueller,M.M.(2006)Inflammationinepithelialskintumours:oldstoriesandnewideas.Eur.J.Cancer,42,735-744.]。化學致癌作用較常使用的化學致癌劑包括二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthraene,DMBA)和三(2-吡啶甲基)胺(12-O-Tetradecanoyl-phorbol13-Acetate,TPA)。作為一種多環的芳香烴基類多潛能致癌物，DMBA經皮膚吸收后進入生物體內，能誘發DNA的多位點突變，影響一系列癌基因和抑癌基因的表達，啟動細胞的癌變。在小鼠皮膚的局部涂抹TPA會造成氧化自由基的增加，導致氧化壓力上升及局部發炎的現象。TPA將造成細胞內抗氧化系統失衡，使腫瘤組織維持在發炎的微環境，促進細胞發生癌變。在發炎反應中，誘導型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)及其產物一氧化氮(NitrogenMonoxide,NO)的含量要高于正常組織，會導致DNA損傷、破壞錯誤復制DNA的修復能力，導致所表達的蛋白質發生變化，使其喪失原有的功能與活性；NO具有促進血管新生、白細胞的黏附、浸潤與腫瘤細胞的轉移。已有許多研究證實，在不同慢性炎癥性疾病和惡性腫瘤組織中，都具有較高含量的NO。在細胞外，NO極不穩定，幾秒鐘后便轉化為亞硝酸鹽，通常都通過測定亞硝酸鹽的含量來檢測細胞內NO的含量[Moncada,S.,Palmer,R.M.,andHiggs,E.A.(1991)Nitricoxide:physiology,pathophysiology,andpharmacology.Pharmacol.Rev.,43,109-142.]。環氧合酶-2(cyclooxygenase,COX-2)是由前列腺素合成，COX-2的合成受到腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)的誘發，在發炎反應時期，COX-2的表達會增加血管通透性，提升白血球與免疫細胞的趨化性，擴大發炎反應的范圍[Tsujii,M.,Kawano,S.,Tsuji,S.,Sawaoka,H.,Hori,M.,andDuBois,R.N.(1998)Cyclooxygenaseregulatesangiogenesisinducedbycoloncancercells.Cell,93,705-716.]；另有研究指出，在DMBA和TPA處理之前，用iNOS與COX-2抑制劑預處理小鼠皮膚后，能夠明顯降低DMBA和TPA所誘發的腫瘤發生率與形成腫瘤的數量[Chun,K.S.,Cha,H.H.,Shin,J.W.,Na,H.K.,Park,K.K.,Chung,W.Y.,andSurh,Y.J.(2004)Nitricoxideinducesexpressionofcyclooxygenase-2inmouseskinthroughactivationofNF-kappaB.Carcinogenesis,25,445-454.]。所以，從發炎的誘導到發展成腫瘤的過程中，iNOS與COX-2都起著重要作用。皮膚乳頭狀瘤是由于表皮乳頭樣結構的上皮組織增生后形成的。皮膚乳頭狀瘤的發病率呈現出逐年增高及年輕化的趨勢，由于該病誘發因素較多，病因復雜，確切發病機理仍不清楚。在臨床治療上，皮膚乳頭狀瘤具有容易惡變成為皮膚癌、手術治療后容易復發、多發性和產生組織破壞等特點。目前，國內外關于皮膚乳頭狀瘤治療方面的研究報道相對較少，如何有效控制該病的發生，提高治療效果，防止腫瘤的復發和惡變，具有非常重要的意義。近年來，眾多的研究結果證實，部分從植物中提取的天然物質，具有較強的預防腫瘤細胞生長的活性。多甲氧基黃酮屬于黃酮類化合物，在柑橘果皮中具有較高的含量。此類化合物的C6-C3-C6骨架上接有兩個以上的甲氧取代基，因極性較低而具有較好的生物可利用率。現有的研究結果表明，多甲氧基黃酮類物質具有抗發炎的生物活性[MiddletonEJr,Kandaswami,C.,andTheoharides,T.C.(2000)Theeffectsofplantflavonoidsonmammaliancells:implicationsforinflammation,heartdisease,andcancer.Pharmacol.Rev.,52,673-751.Manthey,J.A.,Grohmann,K.,andGuthrie,N.(2001)Biologicalpropertiesofcitrusflavonoidspertainingtocancerandinflammation.Curr.Med.Chem.,8,135-153.]。許多研究證實，多甲氧基黃酮具有和未被甲基化黃酮相似的活性，如抗癌、抗病毒等，并且生物可利用率高于未被甲基化的黃酮[Nielsen,S.E.,Breinholt,V.,Cornett,C.,andDragsted,L.O.(2000)Biotransformationofthecitrusflavonetangeretininrats.Identificationofmetaboliteswithintactflavanenucleus.FoodChem.Toxicol.,38,739-746.]。本發明所使用的多甲氧基黃酮化合物為以下三種：5,7,3’,4’-四甲氧基黃酮(3’,4’,5,7-Tetramethoxyflavone,4-PMF)、5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黃酮(5,7,3’,4’,5’-pentamethoxyflavones,5-PMF)以及5,6,7,3’,4’,5’-六甲氧基黃酮(5,6,7,3’,4’,5’-Hexamethoxyflavone,6-PMF)，三者都屬于多甲氧基黃酮，而4-PMF為月橘(Murrayapaniculata)與黑姜(Kaempferiaparviflora)中主要的多甲氧基黃酮之一，這些植物的提取物已被證實具有抗發炎、抗腫瘤以及抗氧化等生物活性[Kinoshita,T.andShimada,M.(2002)IsolationandstructureelucidationofanewprenylcoumarinfromMurrayapaniculatavar.omphalocarpa(Rutaceae).Chem.Pharm.Bull.(Tokyo),50,118-120.Yenjai,C.,Prasanphen,K.,Daodee,S.,Wongpanich,V.,andKittakoop,P.(2004)BioactiveflavonoidsfromKaempferiaparviflora.Fitoterapia,75,89-92.]。本專利為多甲氧基黃酮在制備治療皮膚乳頭狀瘤上的應用，達到治療皮膚乳頭狀瘤的目的。技術實現要素：針對大多皮膚乳狀瘤具有易惡變為皮膚癌、術后易復發、多發性生長并易產生組織破壞的特點，本發明提供了一種多甲氧基黃酮在制備治療皮膚乳頭狀瘤的藥物上的應用。通過細胞實驗和動物實驗，發現該類化合物對皮膚乳頭狀瘤具有明顯的作用效果。所述的多甲基黃酮包括所有C6-C3-C6骨架上接有兩個以上的甲氧取代基的黃酮，包括，4-PMF(結構式見圖1)、5-PMF(結構式見圖1)以及6-PMF(結構式見圖1)。化學試劑的配制：DMBA：準確稱取1.2815mgDMBA，用200μL丙酮溶解后，配制成1μmol/mL的DMBA溶液，現配現用。TPA：準確稱取5mgTPA，用200μL丙酮溶解后配制成100nmol/200μL的TPA貯備液，使用前用丙酮稀釋成5nmol/200μL。4-PMF、5-PMF、6-PMF：準確稱取0.0342g4-PMF、0.0372g5-PMF、0.0402g6-PMF，分別用200μL丙酮溶解后，配制成100μmol/200μL的儲備液，使用前用丙酮稀釋成所需要的濃度。該多甲氧基黃酮的使用濃度為2.5-40μmol/L。本發明所述的多甲氧基黃酮對小鼠巨噬細胞RAW264.7生長抑制作用的使用方法為：將細胞培養在含100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素、10％胎牛血清的DMEM培養基中，培養溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％的條件下，當細胞生長到8分滿時，分別在DMEM培養基加入終濃度為100ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和終濃度為2.5-10μmol/L以丙酮溶解的多甲氧基黃酮，培養24h后，收集細胞培養液的上清液，測定亞硝酸鹽含量。本發明所述的多甲氧基黃酮對化學誘導ICR小鼠皮膚乳頭狀瘤生長抑制作用的使用方法為：將ICR小鼠按6只/籠隨機分配至各個籠子，二籠為一組(即一組共有12只)，共分為誘導組，對照組、5μmol/200μL4-PMF處理組、5μmol/200μL5-PMF處理組和5μmol/200μL6-PMF處理組。適應飼養一周后，用小型剃刀將ICR小鼠背部靠近尾巴部位剔除一塊面積約2cm2區域的毛發。在剔除毛發部位涂抹200μL濃度為1μmol/mL的DMBA，2天后再在相同部位涂抹200μL相同濃度的DMBA。經過DMBA處理一星期后，在剔除毛發部位，誘導組持續每星期用5nmol/200μL濃度的TPA涂抹2次；對照組持續每星期用200μL的丙酮涂抹2次；4-PMF處理組持續每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的4-PMF涂抹2次；5-PMF處理組持續每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的5-PMF涂抹2次；6-PMF處理組持續每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的6-PMF涂抹2次，在第2次DMBA處理后，所有組再持續處理20周。每周記錄直徑大于1mm并持續存在2星期以上的腫瘤數量，并測量腫瘤大小。20周后處死小鼠，統計腫瘤數量、腫瘤發生率(％)及腫瘤大小。本發明具有的有益效果：本發明中所選用的多甲氧基黃酮，均能夠從植物中提取分離，屬于植物天然化合物，來源廣泛，也能夠直接從試劑公司購買。與誘導組相比，分別以5mol/L濃度的4-PMF、5-PMF或6-PMF處理后，小鼠皮膚腫瘤數量分別減少24.2％、42.5％與54.2％。實驗結果表明，多甲氧基黃酮對皮膚乳頭狀瘤的治療效果顯著。本發明可指導開發新的皮膚乳頭狀瘤治療方法，為今后開發利用多甲氧基黃酮類化合物提供了新的方向和策略。附圖說明圖1為4-PMF、5-PMF和6-PMF的分子結構。圖2為RAW264.7細胞用100ng/ml的LPS和不同濃度多甲氧基黃酮處理24h后培養基中亞硝酸鹽的含量。圖3為不同組ICR小鼠背部皮膚中iNOS和COX-2的表達情況。圖4為不同組ICR小鼠背部皮膚中DNMT1和DNMT3b的表達情況。圖5為不同組ICR小鼠背部皮膚中GPR55的表達情況。圖6為不同組ICR小鼠背部皮膚中p38和p-p38的表達情況。圖7為不同組ICR小鼠背部皮膚中p-PI3K和p-Akt的表達情況。圖8為多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導的ICR小鼠皮膚腫瘤數量的作用。圖9為不同組ICR小鼠皮膚腫瘤誘導百分率。圖10為多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導的ICR小鼠皮膚腫瘤的抑制作用。具體實施方式實施例1多甲氧基黃酮對小鼠巨噬細胞RAW264.7亞硝酸鹽含量的影響所培養的細胞為小鼠巨噬細胞RAW264.7，培養基為DMEM培養基，含有終濃度為100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素、體積比為10％的胎牛血清，培養溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％。將小鼠巨噬細胞RAW264.7培養在24孔細胞培養板中，當細胞生長到8分滿后，分別在不同孔中加入終濃度為100ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和終濃度為2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的4-PMF、5-PMF或6-PMF，繼續培養24小時后，分別取100μL上述各處理的培養基上清液至96孔板中，每孔加入100μL格里斯試劑(含有1％磺胺和0.1％鹽酸萘乙二胺的水溶液)混合均勻后，在波長570nm下，用酶標儀檢測吸光値。吸光值檢測結果如圖2所示，與誘導組相比，4-PMF處理組的NO含量減少3.39～16.42％，抑制效果與誘導組相比并無顯著性差異；在濃度2.5、5及10M時，5-PMF處理組有明顯抑制NO合成的效果，NO含量分別減少30.96％、40.38％與35.75％；濃度為2.5、5、10、20和40M的6-PMF對NO合成的抑制率分別為0.11％、24.60％、31.12％、45.38％與45.76％，呈現劑量依賴的現象，且與誘導組相比具有顯著性差異。從上述結果得知，多甲氧基黃酮具有抑制NO合成的能力，且隨著甲氧基數量的增加，其抑制現象愈明顯，以6-PMF抑制能力最佳。實施例2多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導ICR小鼠皮膚乳頭狀瘤生長的影響實驗用ICR小鼠購自樂斯科生物科技股份有限公司，按6只/籠隨機分配至各個籠子，二籠為一組(即一組共有12只)，共分為誘導組，對照組、5μmol/200μL4-PMF處理組、5μmol/200μL5-PMF處理組和5μmol/200μL6-PMF處理組。飼養環境保持25℃恒溫，每天光照12小時/黑暗12小時，墊料及飲用水每周更換2次。適應飼養一周后，用刀片將ICR小鼠背部靠近尾巴部位剔除一塊面積約為2cm2的毛發。在剔除毛發部位涂抹200μL濃度為1μmol/mL的DMBA，2天后再在相同部位涂抹200μL相同濃度的DMBA。經過DMBA處理一星期后，在剔除毛發部位，各組按如下處理方法連續處理20周：誘導組持續每星期用5nmol/200μL濃度的TPA涂抹2次；對照組持續每星期用200μL的丙酮涂抹2次；4-PMF處理組持續每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的4-PMF涂抹2次，每次涂完4-PMF30分鐘后，在相同部位涂抹5nmol/200μL的TPA；5-PMF處理組持續每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的5-PMF涂抹2次，每次涂完5-PMF30分鐘后，在相同部位涂抹5nmol/200μL的TPA；6-PMF處理組持續每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的6-PMF涂抹2次，每次涂完6-PMF30分鐘后，在相同部位涂抹5nmol/200μL的TPA。實驗全程使用標準可滅菌飼料與單蒸水供實驗動物食用。每周記錄直徑大于1mm并持續存在2星期以上腫瘤的數量并測量腫瘤大小。20周后，在最后一次TPA處理24小時后處死小鼠，統計腫瘤數量、腫瘤發生率(％)及腫瘤大小(圖3、圖4、圖10)。外觀變化：持續處理TPA20周后，誘導組每只小鼠的背部都有乳頭狀瘤生成；對照組則沒有腫瘤發生；預處理PMFs的組別中，4-PMF、5-PMF與6-PMF處理組都有抑制腫瘤數量與大小的現象(圖3、圖4、圖10)。腫瘤生長情形：實驗20周后，各組小鼠腫瘤數量與發生率的統計結果如圖3、圖4。實驗過程中誘導組小鼠持續涂抹TPA至第7周后，即開始有乳頭狀瘤的生成，到第20周后，每只小鼠只腫瘤數量平均為21顆，腫瘤發生率達百分之百；對照組則直到實驗20周結束都沒有形成乳頭狀瘤，表明該實驗的腫瘤誘導模式是成立的；4-PMFs組每只小鼠腫瘤數量平均為12.0顆，腫瘤發生率為92％；5-PMF組每只小鼠腫瘤數量平均為9.1顆，腫瘤發生率為83％；6-PMF組每只小鼠腫瘤數量平均為4.7顆，腫瘤發生率為100％。腫瘤數量與大小分布：誘導組ICR小鼠皮膚腫瘤大小為：1-3mm3的有7.8±3.8顆；3-5mm3的有3.0±1.1顆；≧5mm3的有10.3±6.9顆。4-PMF組腫瘤大小為1-3mm3的有6.4±2.4顆；3-5mm3的有2.2±2.2顆；≧5mm3的有3.5±3.8顆。5-PMF組腫瘤大小為1-3mm3的有5.4±4.3顆；3-5mm3的有0.8±1.0顆；≧5mm3的有2.9±3.3顆。6-PMF組腫瘤大小為1-3mm3的有2.1±2.0顆；3-5mm3的有0.8±1.0顆；≧5mm3的有1.8±2.0顆。從上述結果得知，用濃度為5μmol/L的4-PMF、5-PMF或6-PMF處理后，實驗小鼠的腫瘤數量均明顯減少，與誘導組相比，分別減少24.2％、42.5％與54.2％。據此，我們推論，隨著PMFs甲氧基數量的增加，PMF抑制DMBA/TPA所導致的腫瘤數量、大小的效果愈明顯，并且達到統計上的顯著性，但對于腫瘤發生率卻無法改善，其原因可能是因為PMFs無法抑制第一周DMBA誘導過程中的基因突變，隨后，涂抹TPA持續刺激皮膚組織，氧化壓力逐漸增加，最終無法抑制乳頭狀瘤的發生。實施例3多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導ICR小鼠基因表達的影響按實施例2的方法處理小鼠，處死后，收集處理部位的皮膚。把皮膚組織剪成細小的碎片后，按照每20mg皮膚組織加入150-250μL裂解液(含150mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、1g/mL的亮抑酶肽、1g/mL的抑蛋白酶肽、1g/mL的胃蛋白酶抑制劑和1mmol/L的PMSF)的比例加入組織裂解液，用玻璃勻漿器勻漿至充分裂解后，10,000rpm離心5分鐘，取上清。以2mg/mLBSA溶液為濃度標準液，用酶標儀測定595nm處的吸光值，換算樣本內蛋白濃度。蛋白質經聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、結合一抗、二抗后，檢測目的蛋白GPR55、phospho-p38、phospho-PI3K、phospho-Akt、DNMT1、DNMT3b、iNOS和COX-2表達水平的變化。每個樣品重復3次，實驗結果均以平均值±標準偏差表示，并分析各組間的差異，當p值小于0.05時即表示在統計學上具有顯著性差異。實驗結果顯示，誘導組與對照組相比，GPR55的蛋白質表達量明顯增加，表明GPR55參與TPA誘使小鼠皮膚產生病變的過程；多甲氧基黃酮預處理組中，以5-PMF組與6-PMF組的抑制現象最為顯明，其中5-PMF的抑制效果優于6-PMF(圖5)。由此可知，多甲氧基黃酮可通過降低TPA引致皮膚中GPR55的作用，進而達到減輕發炎等現象的產生。誘導組小鼠皮膚中的phospho-p38蛋白表達量顯著高于對照組，而4-PMF、5-PMF與6-PMF處理組中，TPA誘導phospho-p38的表達作用都受到了一定的抑制，其中5-PMF處理組的抑制活性最強(圖6)；此外，誘導組的phospho-PI3K和phospho-Akt表達水平與對照組相比均有明顯增加，4-PMF、5-PMF與6-PMF處理組的phospho-PI3K、phospho-Akt的表達水平與對照組相比顯著降低，其中又以5-PMF與6-PMF處理組的抑制作用最為明顯(圖7)；由圖8可知，誘導組的兩個重要的DNA甲基轉移酶：DNMT1和DNMT3b都沒有被活化，而多甲氧基黃酮處理組的DNMT1和DNMT3b表達水平都有增加，5-PMF處理組對DNMT1的表達水平最高，6-PMF處理組的DNMT3b的表達水平最高。綜合上述兩項結果可以推測，多甲氧基黃酮可通過調控DNMT1和DNMT3b的表達來調節iNOS的轉錄活性。由此可知，PMFs抑制發炎因子的表達可能是通過調控phospho-p38MAPK途徑與PI3K/Akt途徑，以抑制NF-κB轉移至細胞核內并轉錄出下游iNOS和COX-2(圖9)，進而達到抑制發炎反應的效果。實施例4多甲氧基黃酮對ICR小鼠的生物毒性評價按實施例2的方法處理小鼠，處死小鼠后，稱量各組ICR小鼠的體重、肝、脾、腎重量，以心臟采血方式采集血液，室溫放置1h后，4℃3000rpm離心10min，收集血清，儲存于-80℃冰箱中。以全自動生化分析儀檢測肝功能生化指數：天門冬酸轉氨酶(aspartateaminotransferase，AST)、丙氨酸轉氨酶(alanineaminotransferase，ALT)、三酸甘油脂(triglyceride，TG)及總膽固醇(totalcholesterol，T-cho)，檢測結果見表1。從檢測結果可以看出，兩組數據間不存在顯著性差異，多甲氧基黃酮對ICR小鼠沒有表現出生物毒性。表1多甲氧基黃酮對ICR小鼠的生物毒性評價組別肝臟/體重腎臟/體重脾臟/體重GOT(Unit/L)GPT(Unit/L)TG(mg/dl)T-cho(mg/dl)誘導組3.91±0.250.85±0.070.25±0.0393.4±9.723.2±4.8113.7±28.978.9±4.24-PMF處理組3.95±0.350.89±0.020.23±0.0493.6±7.224.1±4.9112.4±28.976.5±4.15-PMF處理組3.92±0.280.83±0.070.24±0.0393.1±8.122.5±3.6114.3±15.676.2±3.66-PMF處理組3.99±0.310.88±0.040.26±0.0594.1±6.324.9±5.2113.1±20.379.3±4.7當前第1頁1 2 3