本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及熊果酸新用途及含有熊果酸的組合物及其用途。
背景技術：
：金黃色葡萄球菌是人體皮膚和鼻腔的常見定植菌，同時也是引起臨床感染的常見致病菌，既可引起局部化膿性感染，如癰、癤、毛囊炎、甲溝炎和外科切口等局部膿性感染，也可引起肺炎、骨髓炎、腦膜炎、化膿性關節炎、心內膜炎及膿毒癥、敗血癥等全身性感染。細菌生物膜也稱生物被膜，是細菌粘附在組織或醫學材料表面，通過釋放多糖和蛋白形成含水基質包繞菌體而構成的具有立體結構的細胞群落，是細菌為了適應生存環境而形成的一種與浮游細胞相對應的存在形式。現今，臨床上很多慢性感染與細菌生物膜有很大關聯。生物膜將整個菌體包裹，導致抗生素難以接觸菌體，不能直接殺滅菌體，極大影響抗生素的治療效果。臨床上常常使用抗生素-抗生素聯合作用，對細菌進行殺滅，但達不到預想的效果。熊果酸，在自然界分布很廣，可來源于金銀花、烏梅、山楂、山茱萸、刺玫果等天然植物中，有研究表明熊果酸具有鎮靜、抗炎抗菌、抗糖尿病、抗癌等多種藥理活性。目前，已有報道指出熊果酸與抗生素聯用能夠取得很好的殺菌效果。如中國專利申請CN101543499A一種天然化合物熊果酸在抗菌方面的應用，其涉及將熊果酸與青霉素聯用在抗耐藥金黃色葡萄球菌方面的應用，該發明指出，熊果酸與青霉素聯用在體外對金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性，最低抑菌濃度為1.3μg/disc。但是，該發明對熊果酸的研究僅在其體外抗菌活性方面，并未涉及其是否能夠在體外抑制或防止金黃色葡萄球菌生物膜形成。另外，目前由于抗生素用量過大導致的人體神經、骨髓、肝臟、腎臟等臟器產生較大不良反應的事件越來越多。如慶大霉素過量使用容易導致腎毒性反應，經動物實驗證明，慶大霉素可引起少數近端腎小管損傷，腎小球濾過功能障礙以及腎小球超微結構異常和功能降壓。另外，由頭孢拉定引起的人體嚴重不良反應的事件也越來越多，在國家藥品不良反應檢測中心發布的《藥物不良反應信息通報》中指出，因頭孢拉定引起的嚴重不良反應事件為15.0％，其中，有關血尿的不良反應事件占97.63％。因此，如何在保持抗生素的有效性的同時控制抗生素的用量成為目前亟需解決的技術問題。技術實現要素：為了解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種熊果酸的新用途及有熊果酸的組合物及其用途，以解決以上缺陷。本發明目的之一在于提供一種含有熊果酸的組合物在制備用于抑制或防止金黃色葡萄球菌生物膜生長藥物中的用途。進一步地，所述組合物包括熊果酸和抗生素，所述組合物中熊果酸的含量為1.83～10.05μg/ml。進一步地，所述抗生素選自左氧氟沙星、羅紅霉素、頭孢拉定、慶大霉素和阿莫西林中的一種。進一步地，所述抗生素選自左氧氟沙星，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述左氧氟沙星的含量為0.03μg/ml～0.12μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為10.05μg/ml，所述左氧氟沙星的含量為0.12μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml，所述左氧氟沙星的含量為0.12μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為7.76μg/ml，所述左氧氟沙星的含量為0.12μg/ml.。進一步地，所述抗生素選自羅紅霉素，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述羅紅霉素的含量為0.15μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為10.05μg/ml，所述羅紅霉素的含量為0.15μg/ml。進一步地，所述抗生素選自頭孢拉定，所述組合物中熊果酸的含量為3.65μg/ml～10.05μg/ml，所述頭孢拉定的含量為0.3μg/ml～1.2μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為10.05μg/ml，所述頭孢拉定的含量為0.3μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為7.76μg/ml，所述頭孢拉定的含量為0.6μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為10.05μg/ml，所述頭孢拉定的含量為0.6μg/ml。進一步地，所述抗生素選自慶大霉素，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述慶大霉素的含量為0.03μg/ml～0.125μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml～10.05μg/ml，所述慶大霉素的含量為0.06μg/ml～0.123μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為10.05μg/ml，所述慶大霉素的含量為0.123μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為7.76μg/ml，所述慶大霉素的含量為0.123μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為10.05μg/ml，所述慶大霉素的含量為0.061μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為7.76μg/ml，所述慶大霉素的含量為0.061μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml，所述慶大霉素的含量為0.123μg/ml。進一步地，所述抗生素選自阿莫西林，所述組合物中熊果酸的含量為3.65μg/ml～10.05μg/ml，所述阿莫西林的含量為0.015μg/ml～0.06μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml，所述阿莫西林的含量為0.06μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為3.65μg/ml，所述阿莫西林的含量為0.03μg/ml。進一步地，所述組合物中熊果酸的含量為5.93μg/ml，所述阿莫西林的含量為0.06μg/ml。進一步地，所述組合物為口服制劑或外用制劑。進一步地，所述口服制劑包括片劑、膠囊、散劑、滴丸、丸劑、顆粒劑、混懸劑、噴霧劑、栓劑或酏劑；所述外用制劑包括霜劑或膏劑。本發明的另一發明目的在于提供一種抑制或防止金黃色葡萄球菌生物膜生長的組合物，所述組合物包括熊果酸和抗生素。進一步地，所述抗生素選自左氧氟沙星、羅紅霉素、頭孢拉定、慶大霉素和阿莫西林中的一種。除外，本發明還提供了上述的組合物在制備抑制或防止金黃色葡萄球菌生物膜生長藥物中的用途。本發明提供的熊果酸的分子式為：C30H48O3，CAS號為：77-52-1。目前對熊果酸的研究僅在其體外抗菌活性方面，并未涉及其是否能夠在體外抑制或防止金黃色葡萄球菌生物膜形成。發明人意外發現，熊果酸對金黃色葡萄球菌生物膜的形成有抑制和防止作用，試驗證明，濃度為1.83～10.05μg/ml的熊果酸在體外對金黃色葡萄球菌生物膜的形成有抑制作用，其可使金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力降低8～32.8％。對生物膜被膜形態結構觀察得出，加入熊果酸，生物膜形成量有明顯減少，且結構疏松，其中以濃度為10.05μg/ml時，抑制效果最強，可使生物膜形成能力降低32.8％。雖然發明人無意中發現熊果酸能顯著抑制生物膜的形成，但其抑制生物膜的機理不明，有待進一步研究。另一方面，發明人嘗試將熊果酸分別與左氧氟沙星、羅紅霉素、頭孢拉定、慶大霉素和阿莫西林聯用，考察其對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。結果顯示，熊果酸分別與左氧氟沙星、羅紅霉素、頭孢拉定、慶大霉素和阿莫西林聯用均能提高熊果酸對金黃色生物膜形成的抑制作用，如熊果酸分別與頭孢拉定、左氧氟沙星和羅紅霉素聯用時，能使金黃色葡萄球菌的生物膜的抑制率最高達到90％，優于熊果酸單獨用藥效果。另外，熊果酸的存在還能明顯降低各抗生素的用量，如熊果酸分別與左氧氟沙星、羅紅霉素、頭孢拉定和阿莫西林聯用均能使各抗生素的有效用量降低到原有效用量的1/2～1/8；熊果酸與慶大霉素定聯用能使其有效用量降低到原有效用量的1/8～1/32。與現有技術相比，本發明具有以下優勢：1)本發明提供了熊果酸在制備抑制或防止金黃色葡萄球菌生物膜生長藥物中的用途，為治療金黃色葡萄球菌感染患者提供了一種新的治療藥物，并對臨床醫藥的發展起到了明顯的推動作用。2)本發明還提供了一種高效低毒藥物，其包括熊果酸和抗生素，該藥物不僅能提高熊果酸對抑制生物膜形成的抑制作用，并能明顯降低抗生素的有效用量，從而降低不良反應的產生。附圖說明圖1是不同濃度的熊果酸對金黃色葡萄球菌生物膜的生成量的抑制影響；圖2是不同濃度的熊果酸對金黃色葡萄球菌生物膜形態結構的影響。具體實施方式：以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。實施例1、熊果酸與左氧氟沙星干混懸劑的制備熊果酸1005μg左氧氟沙星12μgβ環糊精10g羧甲基纖維素鈉5g甘油25mla)取熊果酸、左氧氟沙星、β環糊精和羧甲基纖維素鈉分別過80目篩后混勻，得混合粉料；b)將混合粉料加入甘油制軟材，過30目篩后80℃烘干，過30目篩整粒，包裝，得干混懸劑。服用時，加入100ml水，搖勻，即得液體懸浮劑。實施例2、熊果酸與羅紅霉素干混懸劑的制備熊果酸1005μg羅紅霉素15μgβ環糊精12g羧甲基纖維素鈉5g甘油23ml制備方法如實施例1。實施例3、熊果酸與頭孢拉定干混懸劑的制備熊果酸1005μg頭孢拉定15μgβ環糊精16g羧甲基纖維素鈉5g甘油20ml制備方法如實施例1。實施例4、熊果酸與頭孢拉定干混懸劑的制備熊果酸776μg頭孢拉定60μgβ環糊精6g羧甲基纖維素鈉5g甘油15ml制備方法如實施例1。實施例5、熊果酸與慶大霉素干混懸劑的制備熊果酸1005μg慶大霉素12.3μgβ環糊精12g羧甲基纖維素鈉5g甘油20ml制備方法如實施例1。實施例6、熊果酸與慶大霉素干混懸劑的制備熊果酸776μg慶大霉素12.3μgβ環糊精8g羧甲基纖維素鈉5g甘油10ml制備方法如實施例1。實施例7、熊果酸與慶大霉素干混懸劑的制備制備方法如實施例1。實施例8、熊果酸與阿莫西林干混懸劑的制備熊果酸593μg阿莫西林6μgβ環糊精20g羧甲基纖維素鈉5g甘油20ml制備方法如實施例1。試驗例一、不同濃度熊果酸對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響1.1試驗方法取試管斜面加液體培養基稀釋至1×107CFU/ml，取95μl菌液加入96孔板，熊果酸依次稀釋至0.087μmol/ml、0.17μmol/ml、0.263μmol/ml、0.35μmol/ml、0.438μmol/ml加5μl至96孔板，使得終體積為100μl，另做DMSO的溶劑對照。放入37℃生化培養箱進行培養14h后取出，無菌0.9％氯化鈉沖洗，風干后，加入0.1％結晶紫染色30min，沖洗風干后加入95％乙醇進行脫色15min，于570nm波長測A值，并觀察各濃度的熊果酸對金黃色葡萄球菌生物膜形態結構的改變。1.2結果見表1、圖1和圖2，由圖1(*與空白組相比差異顯著(P＜0.05)；**與空白組相比差異極顯著(P＜0.01))可知，5個濃度梯度的熊估算對金黃色葡萄球菌生物膜形成均有抑制作用，并且隨著熊果酸濃度的增加，生物膜抑制作用越強，當熊果酸濃度為10.05μg/ml時，其能使金黃色葡萄球菌生物膜形成能力降低32.8％。從圖2(A陰性對照組，B.0.004μmol/ml，C.0.008μmol/ml，D.0.13μmol/ml，E.0.17μmol/ml，F.0.022μmol/ml)可知，熊果酸能使金黃色葡萄球菌生物膜的形成量明顯減少，經不同濃度的熊果酸作用后的生物膜結構疏松，這說明，不同濃度熊果酸對金黃色葡萄球菌生物膜有抑制作用。表1熊果酸對金黃色葡萄球菌生物膜的影響熊果酸濃度0μg/ml3.65μg/ml5.93μg/ml7.76μg/ml10.05μg/ml生物膜生成量(％)100±8.1681.3±1.62**76.75±7.12**70.35±4.72**67.18±8.61**與0μg/ml熊果酸相比，**P＜0.01，*P＜0.05。試驗例二、熊果酸與抗生素聯用對金黃色葡萄球菌生物膜的影響1.材料1.1藥物熊果酸(上海晶純生化科技股份有限公司的，分析純，批號U107243)、頭孢拉定(廣州白云山醫藥集團股份有限公司，批號：2160005)、左氧氟沙星(第一三共和制藥有限公司，產品批號BP009A1)、阿莫西林(廣州白云山醫藥集團股份有限公司,產品批號：4150095)、慶大霉素(廣州白云山天心制藥股份有限公司，產品批號：1640401)、羅紅霉素膠囊(揚子江藥業集團有限公司，批號15112041)、氯化鈉(天津百世化工有限公司，分析純，批號20130322)、營養瓊脂(廣東環凱微生物科技有限公司，生化純，批號3103128)、營養肉湯(廣東環凱微生物科技有限公司，生化純，批號3104063)、結晶紫(天津市大茂化學試劑廠，批號20160103)、二甲基亞砜(DMSO，IGMA-ALDDICH，批號WXBB3106V)、水為純化水。1.2儀器紫外可見分光光度計(日本島津UV-2450型)、手提式壓力蒸汽滅菌鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司GMSX-280)、生化培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠SPX-150B-Z系列)、潔凈工作臺(上海蘇凈實業有限公司型號SW-CJ-1D)、電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠型號JJ323BC)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海深信實驗儀器有限公司，型號DGG-9203A)、超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責任公司，型號DW-HI388)、酶標儀(上海永創醫療器械有限公司，型號M-600)、倒置顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司，型號MIT100)。1.3菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.a，菌株號:ATCC25923)。2.方法2.1菌液制備將金黃色葡萄球菌接種于MH肉湯培養基，制備單菌落。擴大培養后，用無菌生理鹽水洗脫并稀釋至2×107CFU/ml，備用。2.2抗生素供試藥液制備用無菌水將5種抗生素分別配制成7.16mmol/L的溶液，備用。2.3最小抑菌濃度的測定采用微孔法測定熊果酸對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)。取凍存菌接種于營養瓊脂固體培養板，培養24h后，挑取單菌落于固體斜面培養基，生化培養箱37℃培養24h，用營養肉湯洗脫下來，稀釋至1×107CFU/ml(OD＝0.05)菌懸液備用。無菌96孔板上，在1～8列各孔中加100μl肉湯。第1列孔中各加入濃度為8.77μmol/ml熊果酸溶液100μl，采用倍比稀釋法，依次稀釋至第2～8列孔內。然后將配好的菌液依次加入各孔，每孔100μl。第9列孔內加入菌液100μl和培養液100μl，不加藥液，作為陰性對照組；各孔的終濃度為2.19μmol/ml、1.09μmol/ml、0.54μmol/ml、0.27μmol/ml、0.13μmol/ml、0.068μmol/ml和0.034μmol/ml、0.017μmol/ml。生化培養箱37℃恒溫靜置培養24h，取出以肉眼觀察，無細菌生長的最低濃度，即藥物對受試菌的最低抑菌濃度MIC。各抗生素的最小抑菌濃度參考上述方法。2.4熊果酸與抗生素聯用對金黃色生物膜形成的影響根據上述測得的熊果酸與各抗生素的最低抑菌濃度，取不同MIC濃度的熊果酸分別與不同MIC濃度的抗生素按1:1的體積比分別加入孔內，加入90μl菌液，經培養后，結晶紫法染色后，于570nm波長測A值。2.5試驗結果如表2～5所示，結果表明，熊果酸與各抗生素聯用，一方面能夠明顯提高熊果酸的對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用；另一方面可明顯降低抗生素的用量，兩者聯用具有協同增效的作用。表2熊果酸與左氧氟沙星聯用對生物膜形成量的影響注：與空白組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。由表2可知，熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml與左氧氟沙星0.03μg/ml～0.12μg/ml配伍使用對生物膜形成均有抑制效果，其中以熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml與左氧氟沙星0.12μg/ml配伍效果最明顯，對生物膜形成抑制率高達70％以上，特別是當熊果酸10.05μg/ml與左氧氟沙星0.12μg/ml配伍效果最佳，對生物膜形成抑制率高達90％。表3熊果酸與羅紅霉素聯用對生物膜形成量的影響注：與空白組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。由表3可知，熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml與羅紅霉素1.44μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸10.05μg/ml與羅紅霉素1.44μg/ml配伍效果最佳，對生物膜形成抑制率高達80％。表4熊果酸與頭孢拉定聯用對生物膜形成量的影響注：與空白組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。由表4可知，熊果酸3.65μg/ml～10.05μg/ml與頭孢拉定0.3μg/ml～1.2μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸7.76μg/ml～10.05μg/ml與頭孢拉定0.6μg/ml配伍效果最佳，對生物膜形成抑制率均高于80％。表5熊果酸與慶大霉素聯用對生物膜形成量的影響注：與空白組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。由表5可知，熊果酸5.93μg/ml～10.05μg/ml與慶大霉素0.031μg/ml～0.123μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸7.76μg/ml與慶大霉素0.123μg/ml配伍效果最佳，對生物膜形成抑制率高達90％。表6熊果酸與阿莫西林聯用對生物膜形成量的影響注：與空白組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。由表6可知，熊果酸3.65μg/ml～10.05μg/ml與阿莫西林0.015μg/ml～0.060μg/ml配伍使用均有效果，其中以熊果酸5.93μg/ml與阿莫西林0.06μg/ml配伍效果最佳，對生物膜形成抑制率高達45％。試驗例三、臨床應用1.病例選擇選擇250例因金黃色葡萄球菌引起的呼吸系感染患者志愿者，男120例，女130例，年齡20～46歲，平均年齡26±1.5歲，隨機分成5組，分別是實施例1組、實施例2組、實施例3組、實施例6組、實施例8組。1.2治療方法實施例1組：取本發明實施例1所述混懸劑，加100ml水，搖勻，服用3d，1次/d；實施例2組：取本發明實施例2所述混懸劑，加100ml水，搖勻，服用3d，1次/d；實施例3組：取本發明實施例3所述混懸劑，加100ml水，搖勻，服用3d，1次/d；實施例6組：取本發明實施例6所述混懸劑，加100ml水，搖勻，服用3d，1次/d；實施例8組：取本發明實施例8所述混懸劑，加100ml水，搖勻，服用3d，1次/d。1.3療效評定標準顯效：用藥后24～38小時，體溫恢復正常，并且不再回升，其他癥狀好轉或消失；有效：用藥后48～72小時，體溫恢復正常，其他癥狀好轉；無效：用藥后72小時以上體溫仍未恢復正常，其他癥狀為減輕或減輕后又很快復發者。2.結果如表7所示。表7臨床療效結果組別例數顯效(率)有效(率)無效(率)總有效率實施例1組5035(70.0％)12(24％)3(6％)94.0％實施例2組5036(72.0％)12(24％)2(4％)96.0％實施例3組5036(72.0％)13(26％)1(2％)98.0％實施例6組5038(76.0％)12(24％)0100.0％實施例8組5035(70.0％)13(26％)2(4％)96.0％由上表可知，250例呼吸系感染患者中，90.0％以上的患者服用本發明藥物后24～38小時，體溫恢復正常，并且不再回升，其他癥狀好轉或消失，其中，以慶大霉素和熊果酸聯用效果最佳，總有效率達到100.0％，服用后，各患者均無不良反應產生。這說明，本發明熊果酸與抗生素聯用不僅能明顯降低抗生素的有效用量，并且能降低不良反應的產生。當前第1頁1 2 3