本發明是關于一種通過抑制核因子-κb配體的受體活化劑（receptoractivatorofnuclearfactor-κbligand，rankl）誘發的蝕骨細胞分化，以治療骨質流失疾病的方法。

背景技術：

骨骼是在一種稱作改造的過程中不斷被重塑的一種活器官。在這個過程中，稱為蝕骨細胞的細胞再吸收骨組織，而稱為成骨細胞的細胞沉積新的骨組織。成骨細胞可以被封鎖在其所分泌的骨基質內，促其分化成骨細胞。這些細胞被認為在感測骨負載中扮演重要的角色。在高負載條件下，成骨細胞增加骨質量，而在低負載條件下，蝕骨細胞去除骨組織，優化其結構。因此，蝕骨細胞與骨質流失或骨密度的降低有密切的關系。

人們可能因為生理因素或其它外在因素而骨質流失或骨密度降低，導致骨質疏松癥。骨質疏松癥的癥狀包括骨折、背痛、活動能力受限（甚至無法移動）。目前骨質疏松癥的治療方法包括改善營養、運動、藥物治療等。關于藥物治療，臨床使用的藥物包括：雌激素或雌激素的同功異構物、治療糖皮質激素誘發的骨質疏松癥的藥物、二磷酸鹽或降鈣素等。然而上述這些藥物全都有副作用，例如，二磷酸鹽會造成惡心、消化不良、腹瀉或便秘，而降鈣素會引起面部潮紅、頻尿、惡心或皮膚瘙癢。最重要的是，上述這些藥物不能抑制蝕骨細胞的產生，因此不能有效地治療骨質疏松癥。

核因子-κb配體受體活化劑（receptoractivatorofnuclearfactor-κbligand，rankl）是誘發衍生自骨髓的巨噬細胞（bmm）的蝕骨細胞分化的關鍵因素。

技術實現要素：

本發明的目的是治療與骨質流失相關的疾病、病況或失調。在本發明中，通過抑制核因子-κb配體受體活化劑（rankl）誘發的蝕骨細胞分化的受體活化劑，達到治療骨質疏松癥的效果。在本發明中使用的血栓調節蛋白（tm）是天然存在的酶。血栓調節蛋白類凝集素結構域（tm的第一結構域，tmd1）可以配制成用于抑制rankl的活化的蛋白質藥物，從而通過抑制蝕骨細胞分化達成骨質疏松癥的治療。

本發明在raw264.7細胞中使用rankl誘發蝕骨細胞分化的模型，第一次顯示tmd1的補充能以劑量依賴的方式顯著的緩解蝕骨細胞分化和骨質再吸收。總而言之，如圖7所闡述的模型所示，本發明證明由單核細胞/巨噬細胞表達的tm，是蝕骨細胞生成的負調節劑，rtmd1的治療能抑制ovx誘發的骨質流失。這些觀察結果，為骨質流失的病癥提供了新的治療策略。因此，tmd1可能是骨質流失疾病的新治療方法。

因此，本發明提供了一種在有需要的個體中治療骨質流失疾病、病況或失調的方法，包含投予所述個體一醫藥上有效劑量的組合物，其包含血栓調節蛋白類凝集素結構域（tmd1）。

在一實施例中，所述方法抑制個體體內的蝕骨細胞分化。

在另一實施例中，所述方法抑制個體體內核因子-κb配體受體活化劑(rankl)的活化。

在一實施例中，所述骨質流失疾病、病況或失調包括、但不限于骨質疏松癥或風濕性關節炎。

在一實施例中，所述個體是一個哺乳類動物。在另一實施例中，所述個體是人類。

本發明另提供了一種組合物用于制備治療骨質流失疾病、病況或失調的藥物的方法，其中所述組合物包含一醫藥上有效劑量的血栓調節蛋白類凝集素結構域tmd1。

在一實施例中，所述組合物抑制蝕骨細胞分化。

在另一實施例中，所述組合物抑制核因子-κb配體受體活化劑rankl的活化。

在一實施例中，所述骨質流失疾病、病況或失調包含骨質疏松癥或風濕性關節炎。

在一實施例中，所述藥物是用于哺乳動物。在另一實施例中，所述藥物是用于人類。

附圖說明

圖1顯示在raw264.7-分化的蝕骨細胞中下調的tm表達。(a)以m-csf（20ng/ml）與rankl（30ng/ml）處理4天的raw264.7細胞和分化的類蝕骨細胞中，使用if染色偵測到的tm蛋白表達（原始放大倍數×200)。(b)經m-csf和rankl處理的raw264.7細胞中，tm和catk表達的免疫印跡分析。所示的代表性數據得自三個獨立實驗。(c)將(b)以定量表示。**p<0.01。

圖2顯示在pbmc分化的蝕骨細胞中下調的tm表達。(a)經m-csf（20ng/ml）和rankl（30ng/ml）處理1周的pbmc和分化的類蝕骨細胞（osteoclast-likecell）中，使用if染色偵測到的tm蛋白表達。（原始放大倍數×200）(b)經m-csf和rankl處理的pbmc中，tm和catk表達的免疫印跡分析。所示的代表性數據得自三個獨立實驗。(c)(b)的定量表征。**p<0.01，***p<0.001。

圖3顯示tm的骨髓特異性缺失提高蝕骨細胞的生成。(a)分化自原代培養的巨噬細胞的蝕骨細胞的trap染色分析，該巨噬細胞是得自經m-csf和各種濃度的rankl處理以進行分化的tm^flox/flox和lysmcre/tm^flox/flox小鼠（原始放大倍數×200）。（b）每孔中trap陽性多核蝕骨細胞（mnc）的定量。***p<0.001。實驗重復三次。

圖4顯示巨噬細胞上的tm類凝集素結構域延緩rankl誘發的蝕骨細胞形成。(a)分化自原代培養的巨噬細胞的蝕骨細胞的trap染色分析，該巨噬細胞是得自經m-csf和各種濃度的rankl處理以進行分化的tm^wt/led和tm^led/led小鼠（原始放大倍數×200）。（b）使用4-npp作為基質的trap活性定量。*p<0.05，**p<0.01。實驗重復三次。

圖5顯示tm的不足提高細胞外hmgb1的產生和卵巢切除誘發的骨質流失。在(a)來自tm^flox/flox和lysmcre/tm^flox/flox小鼠和(b)來自tm^wt/led和tm^led/led小鼠的原代培養巨噬細胞中，以免疫印跡分析評量細胞外hmgb1的產生。使用谷胱甘肽s-轉移酶（gst）作為內部對照。cm：條件培養基。所示的代表性數據來自三個獨立實驗。(c)在卵巢切除術4周后，以μct掃描偵測脛骨的骨質流失。虛線表示橫截面。(d)小梁骨體積分數（bv/tv）的定量結果。bv、小梁骨體積；tv、總骨體積。**p<0.01。n=5。(e)tm的不足對于促進骨質流失的潛在機制。

圖6顯示重組tm類凝集素結構域（rtmd1）抑制rankl誘發的骨質再吸收并降低卵巢切除術誘發的骨質流失。(a)經rankl和rtmd1處理的raw264.7細胞中，骨質再吸收的試驗結果。實驗重復三次。（b）在來自tm^led/led小鼠的骨髓巨噬細胞/單核細胞中，因應rtmd1的處理細胞外hmgb1的產生。cm：條件培養基。lys：細胞溶解產物。(c)以各種不同劑量的腹膜內rtmd1注射處理的卵巢切除的野生型小鼠中，骨體積分數（bv/tv）的定量結果。bv、小梁骨體積；tv、總骨體積。n=5。(d)巢切除術4周內、經過或未經過rtmd1治療的野生型小鼠，藉μct掃描偵測到的脛骨骨質流失。(e)(d)的定量結果。n=5。(f)rtmd1減緩卵巢切除術誘發的骨質流失的建議機制。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖7顯示蝕骨細胞生成中的tm的示意性模型。在蝕骨細胞生成的過程中，rankl降低tm表達并促進單核細胞中細胞外hmgb1的分泌，導致骨質再吸收和骨質流失的提高。此外，rtmd1治療能抑制hmgb1分泌、骨質再吸收和骨質流失。

具體實施方式

以下實施例非用于限定而僅是本發明的各個態樣與特征的代表。

實施例1：

方法與材料

實驗動物

本實驗根據先前的報告，取得具有骨髓特異性tm缺失的lysmcre/tm^flox/flox小鼠。相較于其對照組（tm^flox/flox小鼠），tm的表達在lysmcre/tm^flox/flox小鼠的骨髓系細胞（巨噬細胞和嗜中性粒細胞）中被抑制，但未在其它組織和器官中被抑制。缺乏tm的類凝集素結構域的小鼠（tm^led/led小鼠）及其對照組（tm^wt/led小鼠）是由conway博士無償提供。這些b6背景小鼠存放于成功大學中心（ncku）的無病原體動物設施中。所有動物實驗方案由成功大學的實驗動物照護與使用委員會批準。根據之前所述的方法，在8周齡時進行雙側卵巢切除術（ovx）。

細胞分離

根據廠商說明書，使用ficoll-paqueplus（gehealthcare，brussels，belgium）梯度法，從血液中分離人類pbmc。根據稍做一些修改的先前所述方法，自股骨和脛骨分離小鼠（6至12周齡）骨髓的巨噬細胞/單核細胞（bmm）。簡言之，將分離的全部骨髓細胞在完全最低必需培養基（α修飾；α-mem）中培養過夜。隨后，收集未黏附的細胞，使用ficoll-hypaque（gehealthcare，piscataway，nj，usa）密度梯度離心法制備單核細胞。再將bmm細胞均勻地散布在ficoll-hypaque和培養基之間的界面上。

蝕骨細胞培養和trap染色

使用96孔細胞培養板（1×105個細胞/孔）培養細胞（raw264.7，pbmc或bmm）。添加rankl和m-csf以刺激蝕骨細胞的產生。每2天補充培養基。在第8天時，使用3％的甲醛固定細胞，并用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatase，trap）（sigma，st.louis，mo，usa）染色。將具有三個或更多個核的trap陽性細胞計為蝕骨細胞。

trap活性分析

以4-npp作為基質，根據經修改的微孔板分析法，測量trap活性。將50μl樣品在150μl基質中于37℃、ph5.0的條件下培養40分鐘，該基質是在含500mm酒石酸鈉的100mm乙酸鈉緩沖液中包含8mm4-npp。加入50μl、3m的naoh以終止反應。在微盤分析儀（spectramaxtm340;moleculardevices，paloalto，ca，usa）中測量波長為405nm的吸光度。

免疫印跡分析

根據先前所述的方法溶解細胞并進行免疫印跡分析。在10％十二烷基硫酸鈉—聚丙酰胺凝膠中，分離約50μg的總蛋白質，然而轉移至聚偏二氟乙烯膜上。使用初級和二級抗體探測后，使用增強的化學發光試劑（amershampharmaciabiotech）偵測信號。

骨質再吸收分析

根據廠商的說明書，使用骨質再吸收試驗盒（cosmobio.co。ltd.，tokyo，japan）測量骨質再吸收活性。簡言之，在有或沒有各種濃度的rtmd1的情況下，將raw264.7細胞在具有m-csf（30ng/ml）和rankl（30ng/ml）的熒光磷酸鈣涂覆的細胞培養板上培養7天。通過在激發波長485nm和放射波長535nm時測量條件培養基的熒光強度，評量rankl誘發的骨質再吸收活性。

微計算器斷層掃描（micro-computedtomography，μct）

本發明的所有微計算器斷層掃描分析均符合當前的指導原則。使用skyscan-1076micro-ct系統（skyscan，belgium）將來自各組別的骨質樣本顯像。小梁骨的分析是在45kv、220μa、0.4μ旋轉梯級、0.5mm鋁過濾器以及18μm/像素的掃描分辨率下操作μct掃描儀。測量的參數如下：總骨體積（tv,mm³），小梁骨體積（bv,mm³）以及小梁骨體積分數（bv/tv,%）。

結果

蝕骨細胞生成過程中單核細胞/巨噬細胞中tm蛋白表達下降

使用rankl和m-csf誘發小鼠raw264.7細胞和人類pbmc中的蝕骨細胞生成，以評量tm蛋白在該過程中的表達量。免疫熒光染色顯示，當raw264.7細胞分化成類蝕骨細胞時，tm的表達顯著降低（圖1a）。免疫印跡分析顯示，使用rankl處理raw264.7細胞時，tm和catk（一種蝕骨細胞的生物標記）分別以時間依賴的方式下降和增加（圖1(b)-(c)）。在人類pbmc中觀察到類似的結果（圖2）。總體而言，這些結果顯示，單核細胞/巨噬細胞中的tm表達，可能與蝕骨細胞的生成有反相關的關系。

巨噬細胞中全長tm的缺乏提高rankl誘發的蝕骨細胞生成

為了研究tm是否可能是蝕骨細胞生成中的負調節劑，本發明自骨髓特異性轉基因小鼠分離巨噬細胞。trap染色分析顯示，rankl能以劑量依賴的方式誘發來自lysmcre/tm^flox/flox和tm^flox/flox小鼠的巨噬細胞中的蝕骨細胞生成。然而，lysmcre/tm^flox/flox小鼠中的細胞面積大于來自tm^flox/flox小鼠的細胞面積（圖3，(a)）。實驗結果的定量顯示，lysmcre/tm^flox/flox組中分化的trap陽性多核細胞（trap+mnc）的比例，比tm^flox/flox組至少高3倍（圖3，(b)）。這些結果指出，存在于巨噬細胞中的全長tm可能阻礙rankl誘發的蝕骨細胞生成。

巨噬細胞中的tm類凝集素結構域延緩rankl誘發的蝕骨細胞生成

過去的研究顯示蝕骨細胞衍生的c型凝集素能抑制蝕骨細胞的生成。為了進一步研究tm的類凝集素結構域是否可能有助于抑制rankl誘發的蝕骨細胞生成，本發明檢驗來自tm^wt/led和tm^led/led小鼠的原代巨噬細胞。trap染色分析顯示，rankl可在來自tm^wt/led和tm^led/led小鼠的原代細胞中誘發蝕骨細胞生成。然而，tm^led/led組中的一些oc的細胞面積顯得大于tm^wt/led組中的細胞面積（圖4，(a)）。此外，tm^led/led組中偵測到的trap活性，顯著高于tm^wt/led組（圖4，(b)）。這些結果顯示，tm的類凝集素結構域可能在抑制rankl誘發的蝕骨細胞生成中，具有關鍵作用。

全長tm的缺失或tm類凝集素結構域的缺失，提高巨噬細胞中細胞外hmgb1的產生以及卵巢切除誘發的骨質流失。

由于hmgb1的釋放是rankl誘發的蝕骨細胞生成所必需的，因此本發明進一步評量tm的不足對細胞外hmgb1的產生的影響。如圖5所示，條件培養基中經rankl處理的lysmcre/tm^flox/flox細胞中的hmgb1蛋白質生產量，顯著高于tm^flox/flox細胞中的hmgb1蛋白質生產量（圖5，(a)）。同樣的，由tm^led/led巨噬細胞產生的細胞外hmgb1，也高于tm^wt/led（圖5(b)）。此外，μct掃描顯示，通過卵巢切除術誘發的脛骨骨質流失，tm^led/led小鼠顯著的比tm^wt/led小鼠更嚴重（圖5，(c)-(d)）。這些數據顯示，巨噬細胞內tm的不足，可能與細胞外hmgb1的產生相關聯，提高蝕骨細胞的形成和骨質的流失（圖5，(e)）。

rtmd1治療抑制骨質再吸收和骨質流失

人體rtmd1對于體外骨質再吸收和體內骨質流失的影響，已經研究完成。骨質再吸收的試驗結果顯示，rtmd1治療能夠以劑量依賴的方式抑制rankl誘發的骨質再吸收（圖6(a)），并且降低來自tm^led/led小鼠的bmm中細胞外hmgb1的產生（圖6，(b)）。此外，rtmd1治療以劑量依賴的方式增加卵巢切除的野生型小鼠的骨體積分數（bv/tv）（圖6，(c)）。與這些結果一致的是，rtmd1治療在4周的期間內抑制骨質流失（圖6，(d)-(e)）。這些結果顯示，通過阻斷hmgb1誘發的蝕骨細胞生成，rtmd1至少部分抑制骨質流失（圖6，(f)）。

本領域技術人員能很快體會到本發明可很容易達成目標，并獲得所提到的結果及優點，以及那些存在于其中的事項。本發明中的方法和用途是較佳實施例的代表，其為示范性且不是用來局限本發明的范圍。本領域技術人員將會想到其中可修改之處及其它用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，并在權利要求書中界定。

對于本領域技術人員顯而易見的是，在不悖離本發明的范圍和精神的情況下，可以對本發明所揭露的內文進行各種替代和修改。

本文說明書中提到的所有專利和出版物，都以引用的方式并入本文中，引用的程度就如同將各個別專利和出版物特定且個別地以引用的方式并入本文中一般。

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