本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于響應(yīng)面分析法對從烏飯樹葉中提取總黃酮的超聲提取工藝參數(shù)的優(yōu)化方法。

背景技術(shù)：

烏飯樹(Vaccinium bracteatum Thunb.)為杜鵑花科越桔屬常綠灌木，古稱南燭、染菽、牛筋草、青精草、草木之王等。作為一種傳統(tǒng)的中藥及保健食品，烏飯樹葉具有益腸胃，養(yǎng)肝腎，治療須發(fā)早白等功效。

類黃酮化合物是烏飯樹葉中的主要藥用成分之一。為此，研究烏飯樹葉中總黃酮的提取方法及提取工藝，對開發(fā)利用烏飯樹這一寶貴資源具有重要意義。

目前，主要采用正交試驗設(shè)計或響應(yīng)面法對植物天然成分進行提取工藝優(yōu)化，但響應(yīng)面法可以實現(xiàn)應(yīng)用較少的試驗數(shù)據(jù)在給定的范圍內(nèi)找到因素與響應(yīng)值之間明確的函數(shù)表達式，從而得出最佳因素組合及最優(yōu)響應(yīng)值，因而更具明顯優(yōu)勢。余清等(2008年)采用響應(yīng)面分析法對顯著影響烏飯樹葉總黃酮提取工藝的2個因素——乙醇濃度和提取溫度進行了試驗設(shè)計，得到烏飯樹葉總黃酮的最佳提取工藝為：提取前浸泡60min，液料比50∶1，乙醇濃度87％，提取溫度61℃，提取時間2h，在此條件下一次提取率可達68.12％，提取量為7.00052mg/g。本發(fā)明在采用超聲提取法的前提下，利用響應(yīng)面分析法對顯著影響烏飯樹葉總黃酮超聲提取工藝的4個因素即乙醇濃度、液料比、超聲時間及超聲溫度進行了組合試驗，從而得出最佳因素組合以及在此因素組合下的最佳黃酮提取量。本發(fā)明與目前響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮提取工藝研究的不同點還在于考慮了實際情況，沒有絕對地將單因素試驗結(jié)果的最高點作為響應(yīng)面法試驗設(shè)計的中心點。比如單因素試驗篩選出的最佳提取溶劑為90％乙醇，但考慮到90％乙醇作為提取溶劑時，葉綠素、脂溶性物質(zhì)、糖類等雜質(zhì)大量析出，提取液呈現(xiàn)綠色(其他均為黃色)且出現(xiàn)明顯的沉淀，增加了對總黃酮進行純化處理的難度和成本。因此從生產(chǎn)效益的角度考慮，選擇中心點提取溶劑為70％乙醇。

因此，本發(fā)明以烏飯樹葉中總黃酮提取量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化烏飯樹葉中總黃酮的超聲提取工藝，為其進一步研究提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種從烏飯樹葉中提取總黃酮的超聲提取方法，以烏飯樹葉為原料，利用超聲波提取，可高效地獲得較高含量的烏飯樹葉黃酮類物質(zhì)。

技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種從烏飯樹葉中提取總黃酮的超聲提取方法，包括以下步驟：

1)稱取烏飯樹葉干燥粉末；

2)加入提取溶劑；

3)超聲提取；

4)抽濾。

具體為；稱取烏飯樹葉干燥粉末，按照設(shè)定的提取溶劑、液料比、超聲時間、超聲溫度等條件分別提取總黃酮，然后抽濾，洗滌濾渣，合并濾液并用50％乙醇定容至50mL，即得。

優(yōu)選地，所述的提取溶劑為體積百分比為30-100％乙醇和純水，優(yōu)選為75％乙醇。

優(yōu)選地，液料比為20∶1mL/g到80∶1mL/g之間，優(yōu)選為65∶1mL/g。“液料比”，指浸提液的體積與固態(tài)材料的質(zhì)量之比，采用單位為mL/g。

優(yōu)選地，超聲時間為30-110min，優(yōu)選為80min。

優(yōu)選地，超聲溫度為45-75℃，優(yōu)選為65℃。

本發(fā)明通過對上述步驟最佳工藝參數(shù)提供了一種優(yōu)化方法，具體為：1)供試品和對照品溶液的制備：實驗材料準(zhǔn)備：烏飯樹葉供試品，烘干后粉碎，密封保存；槲皮素對照品；六水合三氯化鋁、醋酸鈉、無水乙醇；超純水；分別制備供試品溶液和對照品溶液；然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2)單因素試驗及結(jié)果分析：選取提取溶劑、液料比、超聲時間、超聲溫度4個因素進行單因素試驗，得到各因素與總黃酮提取量的關(guān)系；

3)響應(yīng)面法分析超聲提取效果的影響因素。

超聲波作為一種物理輔助提取手段對烏飯樹葉進行處理，更有利于烏飯樹葉中總黃酮的提取。一方面，能通過空穴作用產(chǎn)生極大的壓力，造成被破碎物的細胞壁甚至整個生物體破裂而使胞內(nèi)物質(zhì)釋放、溶出；另一方面，適宜強度的超聲波能夠使黃酮分子的構(gòu)象發(fā)生正向轉(zhuǎn)化，從而提高總黃酮的生物活性。

有益效果：本發(fā)明的優(yōu)點在于同時采用了超聲提取與響應(yīng)面分析法，可以應(yīng)用較少的試驗數(shù)據(jù)快速篩選出最優(yōu)提取工藝，且相比于余清等(2008年)優(yōu)化得到的烏飯樹葉總黃酮提取最佳工藝下的提取量——7.00052mg/g，本研究得到的優(yōu)化提取工藝可以有效提高烏飯樹葉中總黃酮的提取量到23.41mg/g。提高的原因有兩點：首先是采用了超聲輔助提取，可以有效提高黃酮的浸出量；其次前者的乙醇體積濃度為87％，遠遠高于本研究最佳工藝中的乙醇濃度75％，本研究過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度接近90％時的提取液為亮綠色，而黃酮提取液一般為淡黃色，過高的乙醇濃度會產(chǎn)生較多的雜質(zhì)從而降低黃酮的提取量。

附圖說明

圖1為槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為提取溶劑對提取量的曲線。

圖3為液料比對提取量的影響曲線。

圖4是超聲時間對提取量的影響曲線。

圖5是超聲溫度對提取量的影響曲線。

圖6是兩因素交互影響總黃酮提取量的響應(yīng)面圖及等高線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。

實施例1.從烏飯樹葉中提取總黃酮的方法

1.1實驗材料準(zhǔn)備

烏飯樹葉，采自江蘇溧陽，烘干后粉碎過60目篩，密封保存；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98％)；六水合三氯化鋁、醋酸鈉、無水乙醇(均為國產(chǎn)分析純)；超純水。

1.2實驗具體方法

1.2.1供試品溶液的制備

稱取烏飯樹葉干燥粉末0.500g，按照設(shè)定的提取溶劑、液料比、超聲時間、超聲溫度等條件分別提取總黃酮，然后抽濾，洗滌濾渣3次，合并濾液并用50％乙醇定容至50mL，即得。

1.2.2對照品溶液的制備

精密稱量槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用50％乙醇溶解，定容到50mL的量瓶中，搖勻即得濃度為0.2mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取0.2mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL分別置于0～7號容量瓶中，加入1％AlCl3溶液5mL以及10％的醋酸鈉溶液1mL，再用50％乙醇定容至25mL，搖勻，以0號試管作空白參比，靜置10min后于390nm處測其吸光度。如圖1所示，以吸光度(Y)對總黃酮含量(X，mg)進行線性回歸，得回歸方程Y＝2.7193X-0.0013，R2＝0.9997。

實施例2.單因素試驗及結(jié)果分析

選取提取溶劑、液料比、超聲時間、超聲溫度4個因素進行單因素試驗，得到各因素與總黃酮提取量的關(guān)系。

2.1提取溶劑對烏飯樹葉中總黃酮提取量的影響

精密稱取烏飯樹葉干燥粉末0.500g，以液料比40∶1mL/g、超聲時間30min、超聲溫度55℃，分別在提取溶劑為水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、100％乙醇的條件下進行超聲提取，然后抽濾，洗滌濾渣3次，合并濾液并用50％乙醇定容至50mL。如圖2所示，按照實施例1下的方法測其吸光度，并計算提取量。

由于甲醇和丙酮等有機溶劑成本較高，且一般具有毒性，因此選擇水及不同濃度(v/v)的乙醇作為提取溶劑。由圖2可知，水作為提取溶劑下的總黃酮提取量最小。在乙醇濃度為30％～90％范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取量也相應(yīng)增加，當(dāng)乙醇濃度為100％時，總黃酮提取量隨之降低。但是在提取過程中發(fā)現(xiàn)，90％、100％乙醇作為提取溶劑時，葉綠素、脂溶性物質(zhì)、糖類等雜質(zhì)大量析出，提取液呈現(xiàn)綠色(其他均為黃色)且出現(xiàn)明顯的沉淀，增加了對總黃酮進行純化處理的難度和成本。因此從生產(chǎn)效益的角度考慮，選擇提取溶劑為70％乙醇。

2.2液料比對烏飯樹葉中總黃酮提取量的影響

精密稱取烏飯樹葉干燥粉末0.500g，以70％乙醇、超聲時間30min、超聲溫度55℃，分別在液料比20∶1mL/g、40∶1mL/g、60∶1mL/g、80∶1mL/g的條件下進行超聲提取，然后抽濾，洗滌濾渣3次，合并濾液并用50％乙醇定容至50mL。按照實施例1下的方法測其吸光度，并計算提取量。結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，當(dāng)液料比在20∶1mL/g～60∶1mL/g之間時，黃酮提取量隨液料比的增加而增加，當(dāng)液料比超過60∶1mL/g時，黃酮提取量有下降趨勢。原因可能是隨著溶劑體積的增加，溶劑與物料可以充分接觸，黃酮提取量增加，但當(dāng)溶劑量超過一定值時，其他物質(zhì)隨之滲出，影響黃酮的提取。因此選擇液料比為60∶1mL/g。

2.3超聲時間對烏飯樹葉中總黃酮提取量的影響

精密稱取烏飯樹葉干燥粉末0.500g，以70％乙醇、液料比60∶1mL/g、超聲溫度55℃，分別在超聲時間30min、50min、70min、90min、110min的條件下進行超聲提取，然后抽濾，洗滌濾渣3次，合并濾液并用50％乙醇定容至50mL。按照實施例1下的方法測其吸光度，并計算提取量。結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著超聲時間的延長，總黃酮提取量呈現(xiàn)出“M”型變化趨勢，即“增長-下降-再增長-再下降”，并在90min時達到最大值。說明超聲90min時，細胞內(nèi)外的類黃酮化合物充分溶出，超聲時間超過90min后，部分類黃酮物質(zhì)被超聲波所分解。因此選擇超聲時間為90min。

2.4超聲溫度對烏飯樹葉中總黃酮提取量的影響

精密稱取烏飯樹葉干燥粉末0.500g，以70％乙醇、液料比60∶1mL/g、超聲時間90min，分別在超聲溫度45℃、55℃、65℃、75℃的條件下進行超聲提取，然后抽濾，洗滌濾渣3次，合并濾液并用50％乙醇定容至50mL。按照實施例1下的方法測其吸光度，并計算提取量。結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著浸提溫度的升高，黃酮提取量先增后降，65℃時達到最大值。當(dāng)浸提溫度在45～65℃之間時，隨著溫度的升高，分子運動速率加快，類黃酮物質(zhì)的滲透和擴散速率加快，黃酮提取量增加。但是當(dāng)溫度超過65℃時，部分類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致總黃酮提取量有所降低。因此選擇超聲溫度為65℃。

實施例3響應(yīng)面法分析超聲提取效果的影響因素

3.1響應(yīng)面優(yōu)化工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.5軟件，根據(jù)Box-behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)置對烏飯樹葉總黃酮超聲提取工藝影響顯著的4個因素即乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)及超聲溫度(D)作為自變量，以總黃酮提取量為響應(yīng)值設(shè)計三水平的響應(yīng)面試驗，見表1。

表1響應(yīng)面分析因素與水平

3.2對烏飯樹葉中總黃酮提取工藝進行響應(yīng)面分析，自變量的試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，共設(shè)計29個試驗點，其中24個為析因點，5個零點用以估計試驗誤差。具體試驗方案及試驗結(jié)果見下表。

表2Box-Beknhen試驗設(shè)計及結(jié)果

3.3利用Design Expert 8.0.5軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到響應(yīng)回歸方程：

Y＝+22.85+0.88A+0.26B+0.30C+0.35D-0.20AB-0.54AC+0.33AD+4.67BC+0.33BD-0.31CD-0.52A²-0.25B²-0.13C²-1.58D²

式中，Y為烏飯樹葉中總黃酮含量的預(yù)測值，A、B、C、D分別為乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度。

3.4對響應(yīng)面多元回歸模型進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

表3回歸方差分析

注：決定系數(shù)R²＝0.9388；校正系數(shù)R²_Adj＝0.8776；*：p＜0.05，顯著；**：p＜0.01，極顯著。

由方差分析結(jié)果可知，該模型高度顯著(p＜0.0001)，失擬項不顯著(p＝0.3028＞0.05)，決定系數(shù)R²＝0.9388，校正系數(shù)R²_Adj＝0.8776，表明響應(yīng)值的變化有93.88％是由所考察的四個因素引起的，即此模型對于烏飯樹葉中總黃酮提取量實際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，可運用該模型對烏飯樹葉總黃酮提取工藝進行優(yōu)化。由顯著性檢驗結(jié)果可知，一次項A和D，二次項A²和D²均在0.01水平內(nèi)顯著(極顯著)，一次項B和C在0.05水平內(nèi)顯著，表明在烏飯樹葉總黃酮超聲提取工藝過程中，影響總黃酮提取量的因素主次為乙醇濃度(A)＞超聲溫度(D)＞超聲時間(C)＞液料比(B)。交互項AC在0.05水平內(nèi)顯著，表明乙醇濃度和超聲時間的交互作用對總黃酮的提取有顯著影響，其他交互項對總黃酮提取量的影響均不顯著。

3.5響應(yīng)面分析和優(yōu)化結(jié)果

圖6是基于多元回歸模型所繪制的各因素之間兩兩交互作用對烏飯葉總黃酮提取量的影響響應(yīng)面圖。響應(yīng)曲面三維圖和等高線二維圖從一定程度上可以直觀反映兩因素對響應(yīng)值的交互影響強弱。響應(yīng)曲面越陡峭，說明響應(yīng)值受所考察因素的交互影響越大，反之，則影響越小。等高線越趨于橢圓形，說明響應(yīng)值受所考察因素的交互影響越大，越趨于圓形，則影響越小。由圖6可以看出，從a到f，響應(yīng)曲面陡峭程度依次增大，等高線也由圓形向橢圓形逐漸過渡(f除外)，表明所考察因素間的交互影響作用由小到大順序依次為BC＜AB＜CD＜BD＜AD＜AC，與表3中的顯著性檢驗結(jié)果相吻合。

3.6最佳提取工藝的確定及驗證

利用Design Expert 8.0.5軟件的optimization功能，對總黃酮提取量最大值進行工藝預(yù)測，得出最佳提取工藝條件為：乙醇濃度75％，液料比63.47∶1mL/g，超聲時間80min，水浴溫度66.05℃，總黃酮提取量預(yù)測值為23.50mg/g。考慮實際操作過程的方便性，選擇乙醇濃度75％，液料比65∶1mL/g，超聲時間80min，超聲溫度65℃，在該工藝下進行五次平行實驗所得的總黃酮提取量平均值為23.41mg/g，與預(yù)測值僅相差0.09mg/g，表明用響應(yīng)面法對烏飯樹葉中總黃酮超聲提取的各因素進行優(yōu)化研究是合理可行的。

烏飯樹葉含有豐富的類黃酮化合物，在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域均具有廣闊的開發(fā)利用前景。本研究以烏飯樹葉干燥粉末為原料，采用超聲波輔助提取技術(shù)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行了四因素三水平的響應(yīng)面試驗。結(jié)合實際操作得到最優(yōu)工藝條件為：以75％乙醇為提取溶劑，液料比65∶1mL/g，超聲時間80min，超聲溫度65℃。相比于余清等(2008年)優(yōu)化得到的烏飯樹葉總黃酮提取最佳工藝下的提取量—－7.00052mg/g，本研究得到的優(yōu)化提取工藝可以有效提高烏飯樹葉中總黃酮的提取量到23.41mg/g。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。