本發明涉及醫療器械生物材料領域，具體為一種用于防止創面發生粘連的防粘連材料、制備方法及其應用。

背景技術：

粘連是結締組織纖維帶與相鄰的組織或器官結合在一起而形成的異常結構。術后粘連發生率高達90％以上，胸腔、腹腔和盆腔手術都會導致不同程度的粘連。粘連導致的臨床嚴重并發癥包括腸梗阻、不育癥、慢性盆腔疼痛等，增加二次手術的幾率。而且，即使進行二次手術，仍存在同樣的術后再次粘連和再次出現并發癥的潛在性。目前，國內外有兩種途徑來防止術后組織粘連，一種是依據生理/藥理機制的治療方法，主要是藥物減輕炎性反應和溶解纖維蛋白，另一種是醫療器械類的物理阻隔防粘連膜。防粘連膜在創面與周邊組織之間形成臨時的物理隔離屏障，在組織愈合過程中起到防粘連作用，并且可以在體內自行降解或被吸收。防粘連膜通常采用由透明質酸、纖維素衍生物、殼聚糖、聚乳酸等材質制造等高分子材料制造。然而部分高分子材料存在部分問題，例如聚乳酸的降解產物為酸性，局部蓄積容易產生輕微無菌性炎癥；殼聚糖凝膠或溶液易流動，不易在局部形成較高濃度，而海綿狀或薄膜狀殼聚糖的機械強度以及韌性不夠。

有研究發現經免疫原去除處理的小腸黏膜下層組織(sis)是一種無細胞、無免疫原性、能生物降解且具有纖維彈性良好的材料。發明專利(cn103272278a)曾公開了一種以動物源性免疫原去除小腸黏膜下層組織制備植入性醫用生物材料的方法，介紹了通過動物組織材料的前置處理分離、初洗、病毒滅活、免疫原去除、氯化鈉處理、成型、包裝滅菌獲得具有不同的尺寸、厚度和力學強度的醫用產品。免疫原去除基質植入體內后可誘導患者自身細胞長入，為細胞重建受損組織提供模板同時提供臨時物理隔離屏障，修復為血管化、功能化的組織或器官，并且免疫原去除基質會逐步降解，與重建組織再生過程基本同步，而且不會與其它組織發生粘連。

技術實現要素：

本發明提供一種可用于防止組織創面恢復過程中與其它組織發生粘連的生物防粘連材料。該防粘連材料具有良好的生物相容性、適宜的組織粘附性以及一定的機械強度和柔韌性。此外，該防粘連材料具有合適的體內存留時間，可有效防止粘連形成又不影響傷口正常愈合。

本發明采用的技術方案為：一種生物防粘連材料，其特征在于：該生物防粘連材料以動物的小腸粘膜下層為原料，然后去除免疫原性、并保留完整的細胞外基質成分制成；該生物防粘連材料包括第一表面、第二表面和位于中間的可降解吸收結構，所述第一表面為光滑面，所述第二表面粗糙面，中間為漸變連接的可降解吸收結構。

本發明上述生物防粘連材料，包括多層小腸粘膜下層(sis)組織材料，其中根據烘干和冷凍干燥等處理步驟使得小腸粘膜下層組織材料的外露的第一表面是相對光滑的表面，小腸粘膜下層組織材料的外露的第二表面是相對粗糙的表面；具體地：所述第一表面為經真空干燥組織材料所形成的表面；所述第二表面為經冷凍干燥組織材料所形成的表面。

本發明所述動物為哺乳動物，優選為豬或牛。

本發明所述去除免疫原性是指細胞殘留量小于10個、dna殘留量小于10ng/mg、半乳糖苷酶(α-gal)清除率為99％以上。

本發明所述保留完整的細胞外基質成分是指保留包含膠原纖維、多糖物質、活性因子及生長因子成分。

本發明所述的膠原纖維包括i型膠原蛋白及iii型、iv型和vi型膠原蛋白。

本發明所多糖物質包含硫酸軟骨素和透明質酸。

本發明所述活性因子包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素及其配體。

本發明所述生長因子包括堿性生長因子(bfgf)和血管內皮生長因子(vegf)。

本發明所述補片為片狀結構，包括2-8層免疫原去除基質材料組成，所述片狀結構長1-10cm，寬1-7cm，厚度0.1-1mm。

本發明所述的光滑面為致密少孔、具有光澤，所述的粗糙面為疏松多孔、呈亞光狀。

本發明所述的生物防粘連材料在體內的降解時間1-3個月。

本發明所述的生物防粘連材料的拉伸斷裂強度大于40n/cm，縫合保持力大于8n。

本發明還提供一種生物防粘連材料的制備方法，其特征在于：包括原料的初處理、病毒滅活、免疫原去除、真空干燥和冷凍干燥。

具體的，所述制備方法步驟包括：

(1)組織前置處理：取小腸粘膜下層組織材料(sis)，清洗并將水濾干；

(2)病毒滅活：采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡小腸粘膜下層組織材料進行病毒滅活；

(3)清洗：在超聲環境下，分別用pbs溶液處理和水清洗；

(4)免疫原去除：將步驟(3)清洗后得到的小腸粘膜下層組織材料進行免疫原去除，包括第一步采用naoh溶液，超聲振蕩處理，處理后用鹽酸清洗換液；第二步采用含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，多頻超聲振蕩；第三步采用nacl溶液，超聲振蕩；

(5)清洗：在超聲環境下，分別用pbs溶液和水清洗；

(6)真空干燥：將由步驟(5)清洗的免疫原去除材料固定于模具上并一同干燥；

(7)冷凍干燥：將由步驟(5)經清洗的免疫原去除組織材料覆蓋于經步驟(6)得到的真空干燥后的組織材料上，一同進行冷凍干燥。

發明步驟(2)采用的過氧乙酸-乙醇溶液中過氧乙酸的體積百分比濃度為0.1％-5％、乙醇的體積百分比濃度為5％-40％(用水配置成溶液)，過氧乙酸-乙醇溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為(3-20)︰1，滅活時間2-4小時，溫度范圍為10-40℃。

發明步驟(3)清洗具體為：在超聲波清洗機中用pbs溶液清洗，然后用水清洗至檢測電導率為10μs/cm以下終止，得到小腸粘膜下層基質材料。其中pbs溶液ph值范圍為6-8，所使用的水為經過純化處理的純化水。

本發明所述步驟(4)使用的免疫原去除液與小腸粘膜下層組織材料混合體積比為(20-40)：1。

本發明步驟(4)第一步采用濃度為0.1-0.5mol/l的naoh溶液，超聲振蕩處理1-30min，溫度20-25℃，溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為20-40：1，超聲波功率在3000w以上；處理后用濃度為0.1-0.5mol/l的鹽酸溶液清洗換液，并調整ph至中性；第二步采用含有質量百分比濃度為0.01-0.2％的胰蛋白酶和濃度為0.1-1mmol/l的edta的ph值為7的pbs溶液，多頻超聲振蕩10-80min，多頻超聲至少包括兩個超聲頻率，低頻頻率范圍為20-40khz，高頻頻率為60-90khz，其中低頻處理5-40min，高頻處理5-40min，溫度30℃，溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為(30-40)：1，超聲波功率在5000w以上；第三步采用采用濃度為0.8-1.5mol/l的nacl溶液，超聲振蕩處理10min，溫度20℃，溶液與小腸粘膜下層組織材料的體積比為20-40：1，超聲波功率在3000w以上。

所述步驟(5)中清洗過程為：在超聲波清洗機中用pbs溶液清洗，然后用降溫的注射用水清洗至檢測清洗前后的注射用水電導率差為1μs/cm以下終止，得到小腸粘膜下層基質材料。其中pbs溶液ph值范圍為6-8。注射用水溫度優選10-40℃。

本發明步驟(6)所述的干燥是將免疫原去除組織材料置于真空環境，溫度25-40℃后，時間為8-16h，制備光滑面。

本發明步驟(7)所述的冷凍干燥為：預凍至-45℃，保溫1-2小時，然后調節溫度至-15℃，保溫5-7小時，再調節溫度至0℃，保溫2小時，最后調節溫度至25℃，保溫4小時，形成一面光滑一面粗糙中間為漸變連接結構的可降解吸收的防粘連材料。漸變連接結構的形成是由于在凍干過程中，將步驟(5)清洗的、含有水分的免疫原去除的組織材料覆蓋于經步驟(6)得到的干燥后的組織材料時，水分向真空干燥的組織材料有所滲透，形成從未干燥組織材料到已經干燥組織材料的方向的含水量的變化，經凍干后，形成漸變連接結構。

本發明防粘連材料的粗糙面有利于引導創面組織細胞的生長，從而修復創面；而光滑面則有利于阻止這些細胞粘連其它組織，從而有效地防止粘連。

上述的生物防粘連材料的制備方法，還可包括以下步驟：(8)滅菌解析：采用環氧乙烷進行滅菌，滅菌條件為：溫度40℃，保溫時間4小時，濕度60％，環氧乙烷濃度為600mg/l，滅菌時間6小時；解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在20℃之間，時間14天。

與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果：

(1)采用胰蛋白酶和edta，使細胞與細胞外基質之間的連接被破壞；采用低頻超聲對細胞進行破碎，同時使用高頻超聲作用于破碎的細胞及細胞外基質，進一步使細胞脫離細胞外基質，達到脫細胞目的。采用上述方式，對整個細胞脫離基質過程中的各個步驟進行強化，使細胞被從基質上完全脫離。到達最佳的免疫原去除效果；

(2)多程免疫原去除工藝：一程低濃度堿性溶液除脂并破壞細胞膜，二程采用含有edta和酶的pbs溶液經超聲處理進一步洗脫細胞，三程nacl溶液進一步去除殘留dna，同時控制試劑濃度保護細胞外基質結構；

(3)成型工藝技術：通過真空干燥、冷凍干燥兩步工藝實現補片一面光滑、一面粗糙的雙面結構，光滑面有利于引導上皮細胞爬移修復，粗糙面有利于引導平滑肌細胞的組織修復；

(4)力學強化工藝：通過真空干燥成型技術增強防粘連材料的力學強底、力學穩定性，從而提高材料在體內環境中的抗酶解能力。

附圖說明

圖1所示的是本發明生物防粘連材料的結構圖；

圖2所示的是本發明生物防粘連材料的微觀結構sem照片。

圖3所示的是本發明生物防粘連材料的he染色圖

具體實施方式

以下結合實施例對本發明作進一步具體描述，但不局限于此。

所述的豬小腸粘膜下層組織材料(sis)或牛小腸粘膜下層組織材料均適用于本發明下述實施例。

實施例1：

本實施例動物源植入性生物防粘連材料的制備方法，包括以下操作步驟：

(1)組織前置處理：

取小腸粘膜下層組織材料分割成規定尺寸寬10cm，長15cm，剔除淋巴組織，用自來水沖洗3次，再用純化水沖洗至表面無污漬，然后將清洗后的小腸粘膜下層組織材料置于篩網等濾水裝置上，靜置五分鐘以上，將水濾干。

(2)病毒滅活：

采用過氧乙酸-乙醇溶液浸泡小腸粘膜下層組織材料進行病毒滅活，該過程可在不銹鋼桶中進行。過氧乙酸-乙醇溶液中過氧乙酸的濃度(體積百分比)為1％、乙醇的濃度(體積百分比)為24％，過氧乙酸-乙醇溶液與小腸粘膜下層組織材料的比例(體積比)為8：1，滅活時間2h，溫度范圍為20℃。

(3)清洗：

采用清洗液清洗小腸粘膜下層組織材料，清洗液為ph值為7.0的pbs溶液，pbs溶液溫度為20℃，pbs溶液與小腸粘膜下層組織材料的比例(體積比)為30︰1，優選清洗3次，每次20分鐘；然后采用20℃的純化水清洗，純化水與小腸粘膜下層組織材料比例為30︰1，至檢測電導率為10μs/cm以下終止；清洗過程在超聲波清洗機中進行，頻率優選40khz，功率優選3000w以上。

(4)免疫原去除：

免疫原去除步驟包括第一步采用濃度為0.3mol/l的naoh溶液，超聲振蕩處理10min，溫度20℃，溶液與小腸粘膜下層組織材料比例(體積比)為30：1；處理后用濃度為0.3mol/l的鹽酸溶液清洗換液，并調整ph至中性，超聲功率3000w；第二步采用含有質量百分比濃度為0.02％的胰蛋白酶和濃度為0.5mmol/l的edta的ph值為7-8的pbs溶液，多頻超聲振蕩10min，多頻超聲至少包括兩個超聲頻率，低頻頻率范圍為30khz，高頻頻率為80khz，其中低頻處理5min，高頻處理5min，溫度30℃，溶液與小腸粘膜下層組織材料比例(體積比)為(30-40)：1，超聲功率5000w；第三步采用濃度為1mol/l的nacl溶液，超聲振蕩處理10min，溫度20℃，溶液與小腸粘膜下層組織材料比例(體積比)為40：1，超聲功率在3000w。

(5)清洗；

采用清洗液進行清洗，清洗過程在超聲波清洗機中進行，清洗液為ph7的pbs溶液，pbs溶液溫度為20℃，pbs溶液與小腸粘膜下層組織材料的比例(體積比)為30︰1，優選清洗3次，每次20分鐘；然后采用20℃的注射用水清洗，注射用水與小腸粘膜下層組織材料比例(體積比)為30︰1，檢測清洗注射用水與未清洗注射用水電導率之差小于1μs/cm終止，頻率優選40khz，功率優選3000w以上。

(6)真空干燥：

將真空干燥箱預熱至40℃后，將由步驟(5)清洗的一層或多層免疫原去除材料固定于模具上并一同放于真空干燥箱中進行干燥，時間為16小時。經干燥的組織材料具有光滑表面。所述模具包括帶針底板、蓋板與壓塊，其結構可以參考發明專利zl201310203588.6和zl201310203602.2。

(7)冷凍干燥：

將由步驟(5)清洗的一層或多層免疫原去除材料鋪設于由步驟(6)得到的干燥后的組織材料，一同放置于真空冷凍干燥機中，關閉凍干室的門，打開循環泵約1min，開啟壓縮機對凍干箱致冷，將產品預凍至-45℃，保溫2小時，開啟真空泵，調節產品溫度約-15℃升華，6小時后，調節產品溫度0℃，保溫2小時，調節產品溫度25℃，保溫4小時，真空冷凍干燥完成。形成的材料與光滑表面相對的一側具有粗糙表面。

該制備方法還可包括以下步驟：

(8)滅菌解析：

采用環氧乙烷進行滅菌，滅菌條件為：溫度40℃，保溫時間4小時，濕度60％，環氧乙烷濃度為600mg/l，滅菌時間6小時；解析過程在通風的解析室中進行，溫度控制在20℃之間，時間14天。

雖然本發明所制得的生物防粘連材料的真空干燥表面也經歷了凍干處理，但是由于真空干燥表面幾乎沒有水分，因而凍干處理對該表面的形貌的影響可以忽略。真空干燥表面是光滑而有光澤的，即使再經過凍干仍舊是光滑而有光澤的。

本發明所得產品結構如圖1-3所示。

實施例2：

對實施例1中樣品進行性能檢測，檢測項目與結果如下：

1)dna殘留：依據生物制劑殘留dna檢測方法《中國藥典》2015年版第四部，采用熒光染色法檢測實施例1所提供的樣品dna殘留量，結果：實施例1所提供的樣品的dna殘留量小于2.89±0.36ng/mg。

2)半乳糖苷酶(α-gal)清除率：取動物源性生物材料gal陽性參考品，gal抗原陰性參考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的gal標準曲線樣品，測試免疫原去除前后的測試品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液與m86抗體反應后的上清液，加入96孔板，加二抗，加顯色劑，采用elisa方法450nm檢測吸光度值，按標準曲線計算出樣品的gal值，免疫原去除處理前材料的gal值為20.89±2.22×10¹⁴/mg，實施例1中樣品的gal值為0.12±0.01×10¹⁴/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.43％以上。

3)病毒檢測：選擇偽狂犬病毒為指示病毒，采用實時定量pcr法檢測病毒的dna拷貝數，檢測3批樣品。結果：病毒dna拷貝數為0。

4)細菌內毒：按照gb/t14233.2-2005《醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法》進行檢測，共3批樣品，結果：細菌內毒小于20eu/包裝。

5)膠原蛋白亞型鑒別：采用免疫組化染色法檢測i、iii、iv型和vi型膠原蛋白，3μm厚連續切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。將切片移入電飯煲水浴中(內含0.01mol/l，ph6.0的枸櫞酸三鈉緩沖液)，溫度保持在95-100℃，煮20min，進行抗原修復，取出后在室溫下自然冷卻。磷酸鹽緩沖液(pbs)洗滌，5min×3次。二步法免疫組化：分別滴加i、iii、iv型和vi型膠原蛋白單克隆抗體一抗，濃度1：100，4℃冰箱過夜室溫下孵育60min，pbs洗滌3次。滴加envision反應液，室溫下孵育30min。pbs洗滌3次。0.05％的3，3一二氨基聯苯胺+0.03％的h2o2顯色5-10min。流水洗，蘇木精襯染。遞增梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規樹脂封固。結果表明，顯微鏡下觀察四種染色標本皆可見棕黃染色，為陽性，表明樣品中可檢測到i、iii、iv型和vi型膠原蛋白。

6)多糖物質含量檢測：取10個樣品，取樣，浸提，用biocolor硫酸軟骨素檢測試劑盒測試硫酸軟骨素含量，樣品中硫酸軟骨素含量平均值為5236±185μg/g；用透明質酸檢測試劑盒測試透明質酸(ha)含量，結果顯示，樣品的透明質酸(ha)保留量平均值為296±23μg/g。

7)活性因子種類鑒別：將樣品浸泡pbs24h后，固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/lpbs洗3次，每次5min，然后用玻璃細管轉至涂有多聚賴氨酸的玻片上,進行免疫組織化學染色。ln抗體、fn抗體和整合素效價均為1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％tritonx100作用10min增加抗體的穿透性。免疫組織化學染色顯陽性，表面樣品中包含纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素及其配體的等物質。

8)生長因子殘留量：對實施例1中樣品采用elisa法檢測樣品中堿性生長因子(bfgf)和血管內皮生長因子(vegf)含量，并對免疫原去除前動物組織作為對照。結果發現堿性生長因子(bfgf)免疫原去除前后含量分別為2137±187ng/l、1055±114ng/l，保留生長因子45％以上；血管內皮生長因子(vegf)含量免疫原去除前后含量分別為748±61ng/l、315±21ng/l，保留生長因子40％以上。

9)縫合抗拉強度：按照實施例1制備樣品，用3-0非吸收縫合線在防粘連材料一端邊緣2mm處，將縫合線與防粘連材料的另一端固定在拉力儀上，以20mm/min的速度進行拉伸，直到縫合點被撕裂，記錄最大力值，結果顯示，最大值可達12n。

10)抗張強度：按照實施例1制備樣品，將樣品裁剪成2×5cm尺寸，在相對濕度為40-60％，溫度為22±2℃的條件下放置2h后立即進行試驗。將試樣兩端固定在拉伸試驗機的夾頭上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到試樣斷裂，縱向試樣和橫向試樣分別進行試驗。最后的測定結果顯示縱向抗張強度可達48n/cm。

11)環氧乙烷殘留量：按gb/t14233.1-2008《醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學分析法》中9的規定的方法試驗，結果：產品環氧乙烷殘留量不超過10μg/包裝。

12)重金屬檢查：鉛、鉻按gb/t14233.1-2008中5.9.1《醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學分析法》規定的方法試驗，汞、砷按gb/t14233.1-2008中5.9.3《醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第1部分：化學分析法》規定的方法試驗，產品檢驗液中鉛、鉻、汞、砷總重金屬含量少于1μg/g。

實施例3：

對實施例1中樣品進行生物相容性實驗，檢測項目包括：熱原、細胞毒性、遲發型超敏反應、皮內反應、急性全身毒性、ames試驗、小鼠淋巴瘤細胞突變試驗、染色體畸變、植入、亞慢性毒性。

1)熱原

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水。按gb/t14233.2-2005規定的方法進行，產品無熱原反應。

2)細胞毒性

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，24±2hr制備試驗液，浸提介質：含血清的mem培養基。取試驗液按照gb/t16886.5-2003中規定的試驗方法進行試驗，結果產品的細胞毒性反應不大于1級。

3)遲發型超敏反應

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激與遲發型超敏反應試驗方法規定進行試驗，結果產品無遲發型超敏反應。

4)皮內反應

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分:刺激與遲發型超敏反應試驗試驗方法規定進行試驗，結果：試驗樣品與溶劑對照平均記分之差小于1.0。

5)急性全身毒性

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和棉籽油。取試驗液按照gb/t16886.11-2011規定的試驗方法進行試驗，結果：產品無急性全身毒性反應。

6)ames試驗

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和dmso。按gb/t16886.3-2008規定的方法進行，結果：產品的ames試驗為陰性。

7)小鼠淋巴瘤細胞突變試驗

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和dmso。按gb/t16886.3-2008規定的方法進行，結果：產品的小鼠淋巴瘤細胞突變試驗為陰性結果。

8)染色體畸變試驗

按質量比1：5浸提介質的比例，37±1℃，72±2hr制備試驗液，浸提介質：生理鹽水和dmso，按gb/t16886.3-2008規定的方法進行，結果：產品的染色體畸變試驗為陰性。

9)亞慢性毒性

按gb/t16886.11規定的方法進行，結果：無亞慢性毒性反應。

綜上，本發明一種生物防粘連材料：

(1)采用多種工藝復合，稀堿、酶、鹽溶液分步進行，高效脫除細胞，高效去除殘留dna與免疫原性，dna殘留能夠達到10ng/mg以下，半乳糖苷酶去除率較高，能夠達到99％以上；

(2)減少對基質結構的破壞，保留基質中的活性生長因子；

(3)通過真空干燥、冷凍干燥兩步工藝實現補片形成一面光滑，一面粗糙的雙面結構，防粘連膜的力學強底、力學穩定性，從而提高材料在體內環境中的抗酶解能力。

(4)滅菌工藝：通過滅菌過程調整產品體內降解過程，使免疫原去除基質補片逐步降解，與重建組織再生過程基本同步，最終免疫原去除基質補片完全被宿主組織代替；

(5)雙面結構一方面有利于組織細胞生長，另一方面防止不同組織發生粘連，提供有效防粘連效果。

本發明的上述實施例是對本發明的說明而不能用于限制本發明，與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。