本發明屬醫學生物材料領域，尤其涉及一種基于納米粒子-血紅蛋白的人造血紅細胞的制備方法。

背景技術：

血液是人體的重要組成，可以運輸氧氣、營養物質，排泄二氧化碳和及代謝產物等。血液的缺失會造成人體的重大傷害，甚至死亡。新鮮血液只能保存21到38天，在輸入人體之前，還需要檢驗血液是否含有艾滋、乙肝等病毒，確定血型是否與被輸入者血型相配。因為沒有及時輸血，許多人在戰場上、急救室里、災難中因為失血過多而死。輸血是外科手術和內科治療嚴重貧血等疾病的重要方法，也是戰場救護和自然災害中急救創傷病人的有效措施。

隨著醫學的發展，輸血在臨床上的應用日漸廣泛，但是,常規輸血存在以下常見的缺點：(1)易感染和傳播艾滋病、乙肝、丙肝、西尼羅河病毒等血源性疾病；(2)存在血型不合的風險,使用前需要耗時進行交叉配型；(3)紅細胞儲存期短,容易發生血液理化性質和生物學特性的變化；(4)血源緊張；(5)溶血反應等。目前臨床上使用血漿替代品作為血液代用品，但大部分僅具血液擴容作用，并無攜氧、供氧能力。此外，在一些特殊的地方，比如高原、潛水及外太空等高需氧環境下，對血細胞的儲氧量提出一定的要求。因此開發制備簡易、安全、易用、高效的血液代用品是國際科學界和產業界的研發熱點。

血液是由血漿和懸浮于血漿中的血紅細胞組成，是維持生理活動和抵御外部致病因素的重要組成成分。20世紀60年代開始，各國科學家從高分子化合物和血紅蛋白兩方面研究具有載氧功能的血液代用品(lesleyk,2001,proc(baylunivmedcent),14(2),158-161)。血紅蛋白類氧載體(hemoglobinbasedoxygencarrier,hboc)血代用品具有擴充血容量和類似紅細胞的載氧/釋氧功能，體內代謝較快，可及時從體內排出，使機體盡快恢復正常生理微環境等優點，作為新一代血液代用品備受關注，成為開發的熱點。血紅蛋白類氧載體構思的出發點是模擬生理狀態，將血紅蛋白與血液環境利用微囊隔離開來，實現模擬紅細胞的目的。現有的微囊制備技術具有降解難、生物兼容性差等缺點，其包裹的血紅蛋白本身只能攜帶四當量的氧氣，且大多呈無序組合，極大的限制了其攜氧能力，因此，難以實現在臨床上的應用。

liduan等報道了(acsnano,2012,6897-6904)以納米碳酸鈣為模版，親水聚乙二醇(peg)為外殼包裹血紅蛋白構成人工血紅細胞。此法均一性較好，親水性好。然而，此法反應步驟較繁瑣，載氧量低，使其應用受到限制。

yuxiong等報道了(acsnano,2013,7,7454-7461)以碳酸錳為模版，參雜血紅蛋白和人血清清蛋白形成人工血紅細胞。利用人血清清蛋白能進一步降低免疫原性，使其具備更低的毒性。但是，此法反應步驟較繁瑣，載氧量低等缺點也限制了其應用。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明提供一種基于納米粒子-血紅蛋白的人造血紅細胞的制備方法，用以克服現有技術中的血紅蛋白類氧載體合成步驟繁瑣、儲氧能力不足、生物兼容性差等的缺點。

為實現上述發明目的，本發明提供的技術方案是：

一種基于納米粒子-血紅蛋白的人造血紅細胞的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(s1)將1,3,5-苯三甲酸tma(ii)與銅離子在反應溶劑中回流反應，制備得到粗納米材料(iii)，反應溫度是50-120℃，反應時間為5-24小時；

(s2)粗納米材料經分離和提純后得到納米材料(iii)，納米材料(iii)經干燥后得到納米粒子hkust-1；

(s3)納米粒子hkust-1與血紅蛋白利用縮合劑在ph＝4.0～10.0的緩沖鹽溶液中進行縮合反應，得到粗人造血紅細胞，縮合反應時間為12～48小時，溫度為0～80℃；

(s4)粗人造血紅細胞經分離和提純后得到人造血紅細胞hkust-1-hb(i)。

進一步地，所述步驟(s1)中，所述銅離子為硝酸銅、水合硝酸銅、氯化銅、水合氯化銅、硫酸銅和水合硫酸銅中的任一種或者多種。

進一步地，所述步驟(s1)中，所述反應溶劑為乙醇、水混合溶液；

優選，乙醇：水比例為1～5:1～5。

進一步地，所述步驟(s1)中，所述1,3,5-苯三甲酸與銅離子的物料比是1:1～5(w/v)。

進一步地，在所述步驟(s3)中，所述縮合劑為n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)的混合物；

或者為六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷的混合物(pybop)和1-羥基苯并三氮唑(hobt)的混合物；

或者為4-n,n-二甲基吡啶(dmap)和1-羥基苯并三氮唑(hobt)的混合物；

優選，n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽以摩爾比1:1的混合物。

進一步地，在所述步驟(s3)中，所述緩沖鹽溶液為磷酸緩沖鹽溶液和三羥甲基氨基甲烷緩沖液中任一種或者兩種。

進一步地，在所述步驟(s3)中，所述納米材料iii與血紅蛋白的物料比為1:1～1:50(w/v)。

進一步地，在所述步驟(s3)中，納米材料的提純采用過濾、透析或離心的方法。

進一步地，在所述步驟(s4)中，人造血紅細胞的提純利用過濾、透析或離心的方法。

本發明的另一個目的是保護一種人造血紅細胞i，所述人造血紅細胞i由上述技術方案的任一種方法制備得到。

采用上述技術方案，本發明具有如下有益效果：

本發明反應條件溫和，簡便；產物收率高、成本低；反應所用試劑價格不高且容易獲得；與現有技術相比，本發明能極大地提高人造血紅細胞的儲氧量；本發明方法的上述效果為工業生產提供了良好的前景。

本發明的人造血紅蛋白采用具備高儲氧能力的hkust-1納米粒子，其儲氧能力在30bar，298k時能吸收6molkg^-1氧氣；該人造血紅蛋白外殼結合了人血紅蛋白，提高了該材料的生物兼容性及氧氣緩釋能力。

附圖說明

圖1為本發明的人造血紅細胞構造示意圖；

圖2為本發明的1,3,5-苯三甲酸ii的結構圖；

圖3為本發明的納米材料iii的晶體結構圖；

圖4為本發明的步驟(s3)中的偶聯反應式。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的結構圖及具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。本發明的保護范圍仍以權利要求為準，包括在此基礎上所作出的顯而易見的變化或變動等。

本發明提出的人造血紅細胞的制備方法過程如下：

將具有如下結構的均苯三酸ii(結構如圖2所示)與銅離子在有機溶劑或無機溶劑條件下回流反應，制備得納米晶體[cu3(tma)2(h2o)3]n(iii)(晶體結構如圖3所示)，其中，tma為1,3,5-苯三甲酸。

上述反應的反應溶劑為乙醇，水，二甲基甲酰胺等；優選，乙醇：水比例為1～5:1～5的混合物，其沸點在70℃以上，此類溶劑具有易得、價格便宜且易回收，反應易控制等優點。反應時間為5-24小時。

本發明化合物iii利用沉淀或離心或過濾的方法分離提純，并用甲醇、乙醇或丙醇沖洗。總收率為50～90％。

本發明化合物iii在干燥后直接與血紅蛋白在緩沖溶液中利用活化劑進行脫水偶聯反應(或稱縮合反應)，再利用離心或過濾或超濾膜分離提純制得i，偶聯反應式如圖4所示。

圖1為本發明的人造血紅細胞構造示意圖。

縮合反應的縮合劑為n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)的混合物；或者為六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷的混合物(pybop)和1-羥基苯并三氮唑(hobt)的混合物；或者為4-n,n-二甲基吡啶(dmap)和1-羥基苯并三氮唑(hobt)的混合物；優選為，n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽以摩爾比1:1的混合物。

復合物人造血紅細胞的提純采用離心或過濾，并利用顯微鏡、掃描電子顯微鏡或透射電子顯微鏡檢測；

本發明利用高壓氧倉測試其儲氧能力，高壓氧倉壓力為1～50大氣壓，儲氧能力為0.1-5.5molkg^-1。

本發明利用電化學測試了其氧氣釋放曲線、釋放時間，該人造血紅蛋白氧氣釋放時間為0-48小時。

本發明的耦合反應(或稱縮合反應)中，下述反應條件可獲得較好的效果：活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽偶聯試劑為n-羥基琥珀酰亞胺。化合物iii與血紅蛋白的物料比為1:1～1:50(w/v)，反應即可取得預期效果。

hkust-1無機納米粒子的制備：

實例1：

將1,3,5-苯三甲酸、三水硝酸銅按照摩爾比1:1(5.45g1,3,5-苯三甲酸，6.24g三水硝酸銅)溶解在乙醇(100ml)，水(150ml)混合溶液中，混合溶液在60攝氏度，回流24小時。納米粒子(iii)利用濾紙過濾并用水、乙醇洗滌。化合物iii于50攝氏度干燥，得到藍色結晶性粉末hkust-1(5.60g,70％,)。

實例2：

將1,3,5-苯三甲酸、三水硝酸銅按照摩爾比1:3.2(5.45g1,3,5-苯三甲酸,19.30g三水硝酸銅)溶解在乙醇(100ml)，水(150ml)混合溶液中，混合溶液在90攝氏度回流12小時。納米粒子(iii)利用濾紙過濾并用水、乙醇洗滌。化合物iii于50攝氏度干燥，得到藍色結晶性粉末hkust-1(5.2g,65％)。

實例3：

將1,3,5-苯三甲酸(5.45g,25.9mmol)、無水硫酸銅(13.28g,83mmol)溶解在乙醇(20ml)，水(100ml)混合溶液中，混合溶液在120攝氏度回流6小時。納米粒子(iii)利用濾紙過濾并用水、乙醇洗滌。化合物iii于50攝氏度干燥，得到藍色結晶性粉末hkust-1(3.20g,40％)。

實例4：

將1,3,5-苯三甲酸(5.45g,25.9mmol)、氯化銅(11.15g,83mmol)溶解在乙醇(100ml)，水(150ml)混合溶液中，混合溶液在90攝氏度回流24小時。納米粒子(iii)利用濾紙過濾并用水、乙醇洗滌。化合物iii于50攝氏度干燥，得到藍色結晶性粉末hkust-1(5.6g,66％)。

hkust-1-hb的合成：

實例5：

hkust-1(1g)，n-羥基琥珀酰亞胺(1.15g,10mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1.9g,10mmol)溶解在pbs(ph＝5)緩沖溶液中，混合溶液在室溫下攪拌3小時，血紅蛋白(1g)加入到溶液中，混合物在室溫下反應。48小時后，混合物置于離心管中在5000rmin^-1離心5分鐘。得到0.8g深棕色人造血紅細胞。