一種可提高基因轉染效率的納米粒子和基于該粒子的基因轉染試劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，通過使用一種通過細胞釋放的納米粒子NONPs來提高基因轉染效率。該種納米粒子廣泛存在于生物體系以及細胞外的循環(huán)系統(tǒng)中，例如支氣管肺泡灌洗液、體液、血液、唾液、牛奶或者尿液中。本發(fā)明將上述納米粒子摻入非病毒基因轉染載體，可以顯著增加基因轉染載體的DNA負載能力，同時又不會增加細胞毒性。經(jīng)實驗結果表明，從牛奶中提取的NONPs，摻入PEI基因轉染載體，可在幾乎不增加細胞毒性的情況下，顯著提高基因轉染效率。本發(fā)明的主要用途為基因轉染試劑，可用于細胞生物學研究、生產(chǎn)基因轉染制劑以及基因療法等。
【專利說明】—種可提高基因轉染效率的納米粒子和基于該粒子的基因轉染試劑的制備
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種生物體自然產(chǎn)生的納米粒子(NONPs)，通過摻雜的方式制備高效率的基因轉染試劑。
【背景技術】:
[0002]基因轉染是真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程，可用于生產(chǎn)基因制品如蛋白質(zhì)，RNA，抗體等；或將控制基因引入細胞用以調(diào)節(jié)內(nèi)在基因/酶的功能用于細胞生物學研究；或修復丟失/損壞的基因用于基因療法。基因轉染技術不僅是研究轉基因和基因表達的重要工具，而且是目前基因治療的關鍵步驟。理想的基因轉染試劑應該具有如下特點:高效轉染；安全；低細胞毒性；方法簡單；省時、經(jīng)濟。
[0003]目前，主要的基因轉染試劑為病毒型轉染試劑與人工合成型轉染試劑。病毒型轉染試劑雖具有整合效率高、可使外源基因在宿主細胞中長期表達等優(yōu)點，但是由于其基因攜帶能力有限，缺乏祀向性，易產(chǎn)生免疫源性，且操作危險(Putnam, D.Nat Mater 5,439-451,2006)，因此人們更傾向于使用人工合成型的基因轉染試劑。目前人工合成型基因轉染試劑主要是陽離子脂質(zhì)體類、陽離子肽類和陽離子聚合物類，或者是上述幾種的復合物。然而，當前的人工合成型基因轉染試劑同病毒型試劑相比，仍然具有較低的轉染效率，并且毒性高。這在很大程度上限制了它的應用(Mastrobattista,E., et.al.Nat Rev DrugDiscov 5，115-121，2006)。但這同時也說明，人工合成轉染制劑在基因轉染表現(xiàn)上還有很大的可提升空間。高效率、低毒性的基因轉染試劑的研發(fā)目前是國際上的熱門課題。
[0004]自然產(chǎn)生的納米粒子(NONPs)在生物體系以及細胞體外循環(huán)系統(tǒng)中廣泛存在。目前已經(jīng)有多種NONPs被發(fā)現(xiàn)并命名，比如外來體(膜性囊泡)、脫落囊泡、宏粒子、多泡體等等。近期，這些納米粒子在藥`物傳遞和基因治療上開始引發(fā)科學家和研究者的濃厚興趣。雖然這些粒子的性質(zhì)和功能還未被研究透徹，但是他們在細胞通訊方面起著重要作用已經(jīng)得到廣泛認同。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有人工合成轉染試劑轉染率低的不足，提供一種可提高基因轉染試劑轉染率的納米粒子(NONPs)，以及使用該粒子制備新型基因轉染試劑的方法。
[0006]可提高轉染效率的納米粒子(NONPs)可以從牛奶但不僅限于從牛奶中純化得到。該NONPs有以下特性:小于200nm的尺寸，如圖1 ;表面帶有負電荷。由于其表面負電荷，因此不會使DNA發(fā)生綁定或者凝結，如圖2。通過添加NONPs得到的基因轉染試劑具有高效率、低毒性的特點。
[0007]根據(jù)文獻，制備NONP溶液的簡化步驟如下:
[0008]1.經(jīng)過篩選之后，采用低速離心過濾發(fā)去除大粒子，如細胞、大的細胞碎片等；
[0009]2.高速離心過濾法去除生物分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸等；同時制成球狀NONPs ；[0010]3.將純化的NONPs溶解水、或鹽水溶液、或細胞培養(yǎng)液、或磷酸鹽緩沖液(PBS)、或二甲基亞砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或甘油，或以上以一種或幾種的混合液中。采用上述方法，Iml的NONP溶液可通過處理250ml牛奶得到。
[0011]基于上述NONPs的基因轉染試劑的制備方法，是將該NONPs以及目前常用的基因轉染試劑分散于溶劑中，該溶劑含有水、磷酸鹽、或細胞培養(yǎng)液等。步驟如下:
[0012]pEGFP DNA 質(zhì)粒 0.5 μ g、定量 PEI (0.1%,2μ I)以及 NONPs 4 μ L 混合后溶解入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)制作成100 μ L溶液。室溫下培養(yǎng)30分鐘，即可用于細胞的轉染。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0013]圖1.自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs的原子力分析圖，標尺為500nm。
[0014]圖2.1-4列為PEI/DNA帶移分析圖，5_7列為PEI/N0NP/DNA帶移分析圖。對應列
(I)N/P = O ； (2) N/P = 8 ； (3) N/P = 16 ； (4) N/P = O ； (5) N/P = O ； (6) N/P = 8 ； (7) N/P =16。樣品分別為NONP:4μ L, DNA:100ng，對應實施例1和實施例2。
[0015]圖3.(a)為PE1-DNA復合物原子力顯微鏡結構圖，標尺為500nm ； (b)為ΡΕΙ/Ν0ΝΡ/DNA復合物的原子力顯微鏡結構圖,標尺為500nm。
[0016]圖4.(a)為H293T細胞在PEI/N0NP/DNA體系中轉染48后(N/P = 32)的熒光粉顯微鏡圖；(b)為H293T細胞在PEI/DNA體系中轉染48后(N/P = 32)的熒光粉顯微鏡圖。
[0017]圖5.(a)為H293T細胞在不同N/P值下的轉染效率對比圖；(b)為H293T細胞在不同N/P值下的細胞存活率對比圖。圖中分別給出了相同N/P值下，添加NONPs前后，體系的轉染效率及細胞存活率。(c)為H293T細胞在不同NONPs用量時的轉染效率；(d)為H293T細胞在不同NONPs用量時的細胞存活率。
[0018]圖6.(e)為Hela細胞在不同N/P值下的轉染效率對比圖；(f)為Hela細胞在不同N/P值下的細胞存活率對比圖。圖中分別給出了相同N/P值下，添加NONPs前后，體系的轉染效率及細胞存活率。(g)為Hela細胞在不同NONPs用量時的轉染效率；(h)為Hela細胞在不同NONPs用量時的細胞存活率。
【具體實施方式】:
[0019]可提高轉染效率的納米粒子(NONPs)可以從牛奶但不僅限于從牛奶中純化得到(C.Admyre, S.M.Johansson, K.R.Qazi, J.J.Filen, R.Lahesmaa, M.Norman, E.P.A.Neve,A.Scheynius, S.Gabrielsson, J.Tmmunol.2007,179,1969-1978)。NONPs 尺寸小，不大于200nm，如圖1 ;表面帶有負電荷。由于其表面負電荷，因此不會使DNA發(fā)生綁定或者凝結，如圖2。通過添加NONPs得到的基因轉染試劑在不增加試劑毒性的情況下，具備了更高的轉染效率。
[0020]實施例1.基于聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因轉染試劑對H293T細胞的轉染實驗
[0021](I)制備聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因載體及基因轉染試劑
[0022]選取pEGFP為報告基因(DNA)，聚乙烯亞胺(PEI)為基因轉染載體。原子力結果顯示PE1-DNA復合物的構造非常緊湊，大小為幾十到幾百個納米如圖3 (a);而PEI/N0NP/DNA復合物相對松散，原子力顯微鏡中可以看到獨立的DNA線絮如圖3(b)。圖示表明，NONPs可能會對PE1-DNA的復合產(chǎn)生輕微干擾。
[0023]將pEGFP DNA質(zhì)粒0.5 μ g、PEI以及NONPs 4 μ L混合后溶解入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)制作成100 μ L溶液。室溫下培養(yǎng)30分鐘。添加I %瓊脂搪膠的TAE緩沖液(包含40ml三羥甲基氨基甲烷，Iml乙二胺四乙酸)。在Sub-Cell實驗條件下(伯樂實驗室、80V)培養(yǎng)60分鐘。在5% C02，濕度95%，溫度37°C的條件下培養(yǎng)H293T細胞，輔以10%牛血清(FCS)，每ml包含5000單元的青霉素、5000 μ g鏈霉素混合物(可使用0.85%生理鹽水溶解青霉素G、鏈霉素硫化鹽的方式獲得)。
[0024](2)基因轉染效率評價
[0025]將培養(yǎng)的H293T細胞在24孔板以I X 105/孔的細胞密度鋪滿；轉染前放置12小時，使其在轉染時細胞約有80%的聚集度。再將步驟I中得到的DNA、PE1、N0NPs復合物溶液輔以細胞培養(yǎng)介質(zhì)(10% FCS，青霉素/鏈霉素混合物)，孵育48小時，孵育條件:5%C02，濕度95%，溫度37°C。孵育48h后，將細胞分離，使用熒光顯微鏡可以看到細胞被轉染，圖
4。使用流式細胞儀進行熒光檢測H293T的轉染效率，在氮磷比(N/P)為32的時候，轉染效率為40%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，轉染效率僅為30%。可以證明，使用NONPs的轉染試劑，使H293T細胞轉染效率有了大約30%的提升。
[0026](3)基因轉染試劑細胞毒性評價
[0027]細胞毒性評價采用臺盼藍染料排斥法。去步驟(2)中分離出的10 I細胞與10 I臺盼藍染料混合，使用細胞計數(shù)器進行計數(shù)，獲得細胞存活率。測得細胞存活率為90%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，細胞存活率同樣約為90%。可以證明，使用NONPs的轉染試劑在氮磷比為32的情況下，并未對細胞活性造成明顯影響。
[0028](4)采用不同的氮`磷比(N/P)進行基因轉染實驗
[0029]在不同的N/P值情況下，對比評價添加定量NONPs (4 μ L)前后的基因轉染效率和細胞毒性，如圖5 (a).可以證明:N/P值低于16時，添加NONPs對轉染效率沒有大的提升，轉染效率都在10%左右；N/P值為32時，添加NONPs的PEI體系轉染效率大幅提升了約33%，由30%提升至約40% ；N/P值為80時，添加NONPs的PEI體系轉染效率提升了約16%，由43%提升至50%;N/P值為160時，添加NONPs的PEI體系轉染效率提升了 34%，由33%提升至50%。
[0030]同時，如圖5(b)在N/P值低于80時，細胞存活率均為90%左右；N/P值達到160時，細胞存活率小幅下降至約80%，顯示NONPs的細胞毒性開始顯現(xiàn)。相對于其對轉染效率的顯著提升，NONPs的細胞毒性已屬非常輕微。
[0031](5)在一定N/P值情況下，采用不同NONPs添加量的基因轉染實驗
[0032]N/P值為32時，逐步增加NONPs用量，對基因轉染效率和細胞毒性進行實驗評價。實驗結果如圖5(c)顯示，通過逐步增加NONPs至50 μ L，轉染效率也有未添加時的30%逐步增長至43% ;與此同時，圖5(d)顯示細胞存活率幾乎沒有下降，顯示了添加NONPs的基因轉染試劑具有高轉染率、低毒性的優(yōu)越性能。
[0033]實施例2.基于聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因轉染試劑對Hela細胞的轉染實驗
[0034](I)制備聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因載體及基因轉染試劑
[0035]除培養(yǎng)的細胞為Hela細胞之外，其他采用原料以及實驗步驟同實施例1。[0036](2)基因轉染效率評價
[0037]實驗步驟同實施例1。孵育48小時后，使用流式細胞儀檢測Hela細胞的轉染效率，在氮磷比(N/P)為32的時候，轉染效率超過50%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，轉染效率僅為40%。可以證明，使用NONPs的轉染試劑，使Hela細胞轉染效率有了大于25%的提升。
[0038](3)基因轉染試劑細胞毒性評價
[0039]采用實施例1的方法，測得Hela細胞存活率為90%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，細胞存活率同樣約為90%。可以證明，使用NONPs的轉染試劑在氮磷比為32的情況下，并未對細胞活性造成明顯影響。
[0040](4)采用不同的氮磷比(N/P)進行基因轉染實驗
[0041]在不同的N/P值情況下，對比評價添加定量NONPs (4 μ L)前后的基因轉染效率和細胞毒性，如圖6(e) (f)。實驗顯示:N/P值低于16時，添加NONPs對轉染效率沒有大的提升，轉染效率都在10%左右；N/P值為32時，添加NONPs的PEI體系轉染效率大幅提升了約25%，由40%提升至約50% ；N/P值為80時，添加NONPs的PEI體系轉染效率提升了約10%，由55%提升至約60% ；N/P值為160時，添加NONPs的PEI體系轉染效率大幅提升了37%，由40%提升至55%。
[0042]同時，如圖6(f)在N/P值低于80時，Hela細胞存活率均為90%左右；N/P值達到160時，細胞存活率小幅下降至約80%，顯示NONPs的細胞毒性開始顯現(xiàn)。相對于其對轉染效率的顯著提升，NONPs的細胞毒性已屬非常輕微。
[0043](5)在一定N/P值情況下，采用不同NONPs添加量的基因轉染實驗
`[0044]N/P值為32時，逐步增加NONPs用量，對Hela細胞基因轉染效率和細胞毒性進行實驗評價。實驗結果如圖6(g)顯示，通過逐步增加NONPs至50 μ L，轉染效率也有未添加時的15%逐步增長至50% ;與此同時，圖6(h)顯示細胞存活率幾乎沒有下降，顯示了添加NONPs的基因轉染試劑具有高轉染率、低毒性的優(yōu)越性能。
【權利要求】
1.一種摻雜自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs的非病毒性基因轉染載體，它包含自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs和常規(guī)非病毒基因轉染載體，其特點是高轉染效率、低細胞毒性。
2.一種基于權利項I所述的摻雜NONPs的非病毒性基因轉染載體制備的基因轉染試劑，是將基因載體分散于水、或鹽水溶液、或細胞培養(yǎng)液、或磷酸鹽緩沖液(PBS)、或二甲基亞砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或甘油，或以上以一種或幾種的混合液中。
3.根據(jù)權利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，包括但不僅限于外來體、膜性囊泡、脫落囊泡、宏粒子、多泡體。
4.根據(jù)權利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，其特性在于尺寸小，小于200nm。
5.根據(jù)權利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，其特性在于表面攜帶負電荷，不會使DNA發(fā)生帶移或者凝結。
6.根據(jù)權利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，其特性在于在自然界中廣泛存在，可以從支氣管肺泡灌洗液、體液、血液、唾液、牛奶或者尿液中但不僅限于上述物質(zhì)中純化得到。
7.根據(jù)權利要求2所述的基因轉染試劑的制備，其特性包含以下步驟(1)和步驟(2): (1)篩選權利要求6所述物質(zhì)，首先采用低速離心過濾發(fā)去除大粒子，如細胞、大的細胞碎片等；再高速離心過濾法去除生物分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸等，同時將NONPs制作成球狀；將純化的NONPs溶解在權利要求2所述溶劑中。 (2)權利要求1中所述常規(guī)非病毒基因轉染載體以及NONPs混合后溶解入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或權利要求2所述溶劑中，即制成轉染試劑。加入基因質(zhì)粒，室溫下培養(yǎng)30分鐘，即可用于細胞轉染。`
【文檔編號】C12N15/63GK103865942SQ201210571278
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權日:2012年12月18日
【發(fā)明者】劉遵峰, 賈鳳美 申請人:常州碳宇納米科技有限公司