本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-cabazitaxel)在制備抗腫瘤藥物中的應用。

背景技術：

目前，內分泌治療是前列腺癌的主要方法。對于腫瘤持續發展的患者，標準治療為激素治療，即雄激素阻斷治療，可阻斷參與前列腺癌生長的睪酮的生成。大多數患者起初對去勢或聯合雄激素阻斷治療有效，但經過14-30個月后，幾乎所有患者都逐漸發展激素難治性前列腺癌(hrpc)。塞諾菲公司的細胞毒性藥物多西他塞為hrpc臨床一線藥物。如今，卡巴他塞的推出使得患者在多西他塞治療失敗后多了一種化療選擇。

研究表明，卡巴他塞(cabazitaxel)能夠通過與游離的β-微管蛋白結合，阻礙了gtp及一些輔助蛋白因子與β-微管蛋白的結合為位點。β-微管蛋白在缺少gtp和輔助因子時發生動態聚合，破壞了細胞正常的有絲分裂，使細胞分裂停滯在g2/m期，最終導致細胞的凋亡。此外，卡巴他塞還可以通過抑制雄激素受體來發揮其對前列腺癌的治療作用。

生物素是人和動物新陳代謝中不可或缺的物質，腫瘤細胞需要大量的生物素供給才能滿足其生長需要。而且生物素具有體積小，并且與腫瘤細胞表面過度表達受體的親和力較高的特征，因此可將生物素連載到藥物上實現對腫瘤的靶向診斷和治療。

本發明人發現將卡巴他塞(cabazitaxel)和生物素(biotin)偶聯，形成卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-cabazitaxel)，能夠有效抑制前列腺癌細胞的生長，宜進一步研究開發新藥。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于研究設計卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-cabazitaxel)在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明提供了卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-cabazitaxel)在制備抗腫瘤藥物中的應用。

卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-cabazitaxel)的結構式如下：

本發明所述卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-cabazitaxel)是通過下列方法制備得到的：

將14.5mmol卡巴他塞(cabazitaxel)、44.1mmol氨基聚乙二醇異氰酸酯(nh2-peg-nco),10ml無水二氯甲烷(ch2cl2)加入50ml干燥的三口瓶中，室溫攪拌，并向體系中緩慢滴加2ml無水三乙胺，30min后待體系恢復到室溫后，加熱使體系維持在40-50℃左右，繼續攪拌3h,過濾得固體沉淀，以乙二醇單甲醚重結晶，得到產物卡巴他塞-聚乙二醇復合物(npeg-cabazitaxel)。

將卡巴他塞-聚乙二醇復合物(cabazitaxel-npeg)溶解于二甲亞砜(dmso)中；將生物素(biotin)用(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化，按摩爾比1：30的比例，將活化好的生物素(biotin)和卡巴他塞-聚乙二醇復合物混合，4℃攪拌24小時，取出透析除鹽，過分子篩，收集終產物得到卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-peg-cabazitaxel)。

本發明的另一目的是提供以卡巴他塞-生物素偶聯復合物為活性成分，用于制備抗腫瘤的藥物，尤其用于制備治療轉移性激素難治性前列腺癌的藥物。

本發明將卡巴他塞-生物素偶聯復合物進行動物藥效試驗，結果顯示卡巴他塞-生物素偶聯復合物主要可抑制轉移性激素難治性前列腺癌細胞生長。因此，卡巴他塞-生物素偶聯復合物可用于制備治療轉移性激素難治性前列腺癌的藥物。

本發明所述卡巴他塞-生物素偶聯復合物在制備治療轉移性激素難治性前列腺癌的藥物為由卡巴他塞-生物素偶聯復合物作為活性成分與藥學上可接受的載體制成的藥物組合物，其中藥物組合物的單劑量含活性成分卡巴他塞-生物素偶聯復合物為1mg-5mg，當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是醫師技能范圍之內的。

所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如明膠、聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等、另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發明化合物或藥物組合物的施用方式沒有特殊限制，所述藥物組合物可以是片劑、分散片、含片、口崩片、緩釋片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑等，各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法制備。

附圖說明

圖1不同濃度卡巴他塞和卡巴他塞-生物素偶聯復合物對pc-3細胞的作用；

圖中1：空白對照組、2：卡巴他塞低劑量組、3：卡巴他塞中劑量組、4：卡巴他塞高劑量組、5：卡巴他塞-生物素偶聯復合物低劑量組、6：卡巴他塞-生物素偶聯復合物中劑量組、7：卡巴他塞-生物素偶聯復合物高劑量組

圖2卡巴他塞和卡巴他塞-生物素偶聯復合物的體外抑制腫瘤實驗

圖中1：模型組、2：卡巴他塞-生物素偶聯復合物高劑量組、3：卡巴他塞-生物素偶聯復合物中劑量組、4：卡巴他塞-生物素偶聯復合物低劑量組、5：卡巴他塞高劑量組、6：卡巴他塞中劑量組、7：卡巴他塞低劑量組

具體實施方式

本發明公開了一種卡巴他塞-生物素偶聯復合物在制備抗腫瘤藥物中的應用，下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1卡巴他塞-生物素偶聯復合物的制備

將14.5mmol卡巴他塞(cabazitaxel)、44.1mmol氨基聚乙二醇異氰酸酯(nh2-peg-nco),10ml無水二氯甲烷(ch2cl2)加入50ml干燥的三口瓶中，室溫攪拌，并向體系中緩慢滴加2ml無水三乙胺，30min后待體系恢復到室溫后，加熱使體系維持在40-50℃左右，繼續攪拌3h,過濾得固體沉淀，以乙二醇單甲醚重結晶，得到產物卡巴他塞-聚乙二醇復合物(npeg-cabazitaxel)。

將卡巴他塞-聚乙二醇復合物(cabazitaxel-npeg)溶解于二甲亞砜(dmso)中；將生物素(biotin)用(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化，按摩爾比1：30的比例，將活化好的生物素(biotin)和卡巴他塞-聚乙二醇復合物混合，4℃攪拌24小時，取出透析除鹽，過分子篩，收集終產物得到卡巴他塞-生物素偶聯復合物(biotin-peg-cabazitaxel)。

實施例2卡巴他塞-生物素偶聯復合物對前列腺癌pc-3細胞株的作用

前列腺癌pc-3細胞株(購自上海細胞生物學研究所)種板后，加入不同濃度的卡巴他塞(購自aventis公司)以及對應濃度的卡巴他塞-生物素偶聯復合物，mtt檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡率。

實驗分組和實驗方案：

空白對照組：rpmi1640培養液(含100ml/l的胎牛血清)

卡巴他塞組：卡巴他塞(cabazitaxel)3、10、30nmol/l

偶聯組：卡巴他塞-生物素偶聯復合物3、10、30nmol/l

將前列腺癌pc-3細胞消化收集，按每孔5×10³個細胞接種于96孔培養板(購自美國corning公司)，置于37℃，5％co2培養箱中培養24h。待細胞貼壁后，每孔進行換液。吸除原培養液后，卡巴他塞組分別加入不同濃度的卡巴他塞(cabazitaxel)、偶聯組加入對應不同濃度的卡巴他塞-生物素偶聯復合物，另設空白對照組，每組4個復孔，將96孔板移入co2培養箱靜置培養。24h后加5mg/mlmtt溶液(購自sigma-aldrich)20μl/孔，移入37℃培養箱中繼續培養4h后，吸棄孔內上清液。每孔加150μldmso(購自美國sigma公司)，振蕩10min，酶標儀(購自塞默飛世爾公司)測570nmod值，計算細胞抑制率。

實驗結果：

1)mtt檢測

偶聯組細胞吸光度明顯低于對照組。與卡巴他塞組比較，偶聯細胞od值明顯低于卡巴他塞組，說明偶聯組細胞生長收到抑制。

2)流式檢測

偶聯組細胞凋亡峰明顯升高；偶聯組細胞凋亡率明顯高于對照組。與卡巴他塞組相比，偶聯組細胞s期所占的比例明顯降低，而其他各組的變化不明顯。說明偶聯組生物素抑制細胞生長，并可能發生凋亡。

實施例3：卡巴他塞及卡巴他塞-生物素偶聯復合物的裸鼠體內抑制腫瘤實驗

卡巴他塞是一種較強的抗微管抑制劑，卡巴他塞鏈接上生物素后，抗腫瘤效果得到提高。本實驗通過動物模型來研究卡巴他塞-生物素偶聯復合物對前列腺癌的抑制效果。

實驗分組和實驗方案：

人前列腺癌pc-3細胞株使用含10％胎牛血清的1640培養基，在5％co2、37℃培養箱中培養至對數生長期后，在無菌操作臺上吸去培養基，pbs(購自hyclone，ge)清洗培養瓶兩次，加入0.25％胰蛋白酶1ml，消化2-3min后，用完全培養基(含10％胎牛血清)1ml終止消化2min，用10mlpbs吹打貼壁細胞，充分重懸細胞并收集于15ml離心管中(1500rpm，離心5min)，加入pbs再重懸細胞沉淀，于倒置顯微鏡下計數，并觀察細胞活力大于95％。用pbs調整細胞濃度為1×10⁷個/ml，置于離心管內，送至spf級超凈室內。用75％酒精擦拭裸鼠右前肢腋窩消毒，用1ml注射器于裸鼠右側腋窩皮下接種0.2ml/只(約2×10⁷個細胞)。接種后每天觀察腫瘤生長狀況及裸鼠一般活動狀況及營養狀態。

實驗裸鼠(購于廣東省動物實驗中心)在spf級超凈室內適應環境3天后，皮下移植接種pc-3細胞，待移植瘤大小約3mm³時將裸鼠隨機分成3組(每組6只)，即模型組，卡巴他塞組，偶聯組。

模型組：滅菌生理鹽水0.2ml/次，隔日腹腔注射一次，共15次

卡巴他塞組：卡巴他塞注射液溶劑腹腔注射5、10、20mg/kg，0.2ml/次，3d注射一次，共10次

偶聯組：卡巴他塞-生物素注射液溶劑腹腔注射5、10、20mg/kg，0.2ml/次，3d注射一次，共10次

用藥期間每周測量裸鼠的體重及腫瘤體積大小并記錄。經卡巴他塞處理30d后，處死裸鼠，完整摘除腫瘤組織，用電子天枰稱取瘤重，計算各組的腫瘤生長抑制率。

實驗結果：

裸鼠接種前列腺癌pc-3細胞約8天后，均在皮下接種位置出現呈圓形或橢圓形的小包塊，直徑約為0.15-0.25cm，18只裸鼠均成瘤，成瘤率100％。隨機分組后，卡巴他塞組和偶聯組給藥4周后，裸鼠均無死亡情況。比較兩組裸鼠情況，卡巴他塞組裸鼠略顯消瘦，活動狀況較差。而偶聯組裸鼠腫瘤體積及腫瘤重量均較卡巴他塞組明顯下降。