本發(fā)明涉及凝結(jié)芽孢桿菌在制備預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病制劑中的應(yīng)用，具體是用凝結(jié)芽孢桿菌預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病，減少氣流受限、改善肺部功能。
背景技術(shù)：
：慢性阻塞性肺疾病(copd)是一種氣流受限呈不完全可逆和進(jìn)行性發(fā)展?fàn)顟B(tài)的氣道阻塞性肺部疾病。目前，copd是世界上第四位的主要死亡原因，而在我國已居疾病負(fù)擔(dān)序列的第一位。copd病死率及致殘率較高，據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究項目估計，2020年copd將占全球死因的第3位。copd屬嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，目前已經(jīng)被行業(yè)列入重大疾病慢病管理體系內(nèi)。目前臨床常用治療copd的藥物包括糖皮質(zhì)激素、β2-受體激動劑等。β2-受體激動劑可擴(kuò)張支氣管、緩解氣流受限，但不能對氣道病變進(jìn)行有效的遏制。糖皮質(zhì)激素是臨床治療copd的首選藥物，但長期或較高劑量應(yīng)用激素會導(dǎo)致藥效低、副作用大。目前copd緩解期的治療仍缺乏行之有效的策略，肺功能的惡化仍然無法避免。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌能夠有效預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病，安全沒有任何毒副作用，效果優(yōu)于雙歧桿菌，且未見相關(guān)研究報道，特申請此發(fā)明專利。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的制劑，該制劑由凝結(jié)芽孢桿菌制成。本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過下述步驟實施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實現(xiàn)的制備工藝均可以：采取可能含凝結(jié)芽孢桿菌的樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內(nèi)，研究時從中取一定量的樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度，分別涂布于凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱，37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》、相關(guān)細(xì)菌鑒定文獻(xiàn)或16srrna序列對比分析進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌鑒定和毒性試驗，將無毒性的凝結(jié)芽孢桿菌干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協(xié)同作用。凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，酵母粉5g，葡萄糖5g，磷酸二氫鉀2g，吐溫801.0ml，碳酸鈣20g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂15g，調(diào)ph6.2-6.5，115℃高壓滅菌20min。凝結(jié)芽孢桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物3g，氯化鈉5g，葡萄糖5g，調(diào)ph7，115℃高壓滅菌20min。為進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無毒性的凝結(jié)芽孢桿菌，本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌并不局限于為說明本發(fā)明所述的菌，只要無毒性的凝結(jié)芽孢桿菌均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌優(yōu)選但不限于凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmcc1207或凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmcc1.2407。本發(fā)明實施說明中優(yōu)選使用的凝結(jié)芽孢桿菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)：1、為說明本發(fā)明，本發(fā)明利用上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmcc1207。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察：桿狀，革蘭氏染色陽性。平板形態(tài)：菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、大小2-3mm。3、生理生化鑒定明膠液化：－；過氧化氫酶：+；vp試驗：+；苯丙氨酸脫氨酶試驗－。4、糖酵解實驗鑒定葡萄糖：+；麥芽糖：+；蔗糖：+；木糖：－；果糖：+；鼠李糖：－；乳糖：+；菊粉：+；半乳糖：+；糊精：+。5、分離的菌進(jìn)行16srrna基因測序，測得序列用blast與genbank和rdp數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行相似性分析，確定分離的菌為凝結(jié)芽孢桿菌。本發(fā)明所述的凝結(jié)芽孢桿菌指活的生物個體。本發(fā)明是以有效劑量按上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌作為主要活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、粉劑等劑型。本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。本發(fā)明所述制劑包括凝結(jié)芽孢桿菌單獨應(yīng)用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，尤其包括凝結(jié)芽孢桿菌單獨應(yīng)用或與雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明所述雙歧桿菌指活的生物個體。本發(fā)明所述雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用的制劑中，固體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上；或液體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。由于本發(fā)明首次公開了凝結(jié)芽孢桿菌作為主要活性成份制成制劑在預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病中的應(yīng)用，因此含上述凝結(jié)芽孢桿菌的制劑在預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病制劑中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的凝結(jié)芽孢桿菌在制成任何一種劑型時，均具有預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的作用。如果其組份中含有凝結(jié)芽孢桿菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標(biāo)識上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的凝結(jié)芽孢桿菌可以制成藥品、保健食品、食品或飲品等。具體實施方式制備例說明：上述已經(jīng)對凝結(jié)芽孢桿菌制劑的制備進(jìn)行說明，這里通過凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmcc1207或凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmcc1.2407(凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmcc1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)為例進(jìn)行具體說明，其他凝結(jié)芽孢桿菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發(fā)明實施例所述，公知的能夠達(dá)到制備目的的方法均可以，實施例的制備說明只是對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。制備實施例1凝結(jié)芽孢桿菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取人的糞便、土壤、草垛底物等樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內(nèi)，從中取2克樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個稀釋梯度，涂布于凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱，37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落接種到凝結(jié)芽孢桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為1×109cfu/g以上，然后進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)生理生化和16srrna序列對比分析鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌，為凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmcc1207。凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmcc1.2407菌粉制備，將凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmcc1.2407接種到凝結(jié)芽孢桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為1×109cfu/g以上。2毒性試驗2.1動物及分組取30只spf級別小鼠，6-8周齡，體重14-18g，隨機(jī)分凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1207組、凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1.2407組和未給藥組，每組10只。2.2制備菌液將上述不同的凝結(jié)芽孢桿菌菌粉分別用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為1×109cfu/ml的菌液。2.3方法各凝結(jié)芽孢桿菌組和未給藥組均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，各凝結(jié)芽孢桿菌組每天灌服凝結(jié)芽孢桿菌菌液0.5ml，未給藥組每天灌服純化水0.5ml，飼喂14天，觀察體重及毒性反應(yīng)。2.4結(jié)果各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運(yùn)動失調(diào)、姿態(tài)異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，未見中毒反應(yīng)。3制備成粉劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實驗檢驗無毒性，就可將凝結(jié)芽孢桿菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數(shù)不低于1×107cfu/g，然后裝袋。應(yīng)用效果實施例說明：本發(fā)明以凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmcc1207或凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmcc1.2407為代表說明凝結(jié)芽孢桿菌的應(yīng)用效果。本發(fā)明中使用的雙歧桿菌來自于市場銷售產(chǎn)品，公眾能夠購買到的雙歧桿菌活菌均可。應(yīng)用效果實施例1：凝結(jié)芽孢桿菌在治療慢性阻塞性肺疾病中的應(yīng)用1模型組制備：1.1實驗動物10周齡健康雄性wistar大鼠，體重(250±20)g，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司。實驗前適應(yīng)飼養(yǎng)一周：按晝夜節(jié)律采光12h，控制溫度、濕度，自由攝取食物和水，每日定時更換飼料，通風(fēng)良好，排除其它應(yīng)激因素干擾。1.2制備方式采用熏煙加氣管注入脂多糖(lps)的方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型。第1、14天氣管內(nèi)注入脂多糖(lps)0.1ml(200ug)/只，并360°旋轉(zhuǎn)大鼠5次以上，使lps均勻分布于兩肺。第2-13天、15-28天每日上午在72l密閉箱內(nèi)熏5％香煙(注射器反復(fù)注入香煙煙霧)0.5h。1.3模型組制備結(jié)果造模成功。2藥物治療實驗：2.1實驗方法選取10周齡的健康雄性wistar大鼠50只，隨機(jī)分為正常對照組(n＝10)、凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1207組(n＝10)、凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1.2407組(n＝10)、雙歧桿菌組(n＝10)、模型對照組(n＝10)。所有對象均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致。正常對照組不做任何處理，各治療組和模型對照組按1.2所述方式建立大鼠copd模型，并于模型建立的第8天起，凝結(jié)芽孢桿菌(cgmcc1207、cgmcc1.2407)和雙歧桿菌治療組使用含菌數(shù)為1×106cfu/ml(用0.9％生理鹽水調(diào)制菌粉)的菌液灌服0.5ml，模型對照組和正常對照組灌服0.9％生理鹽水0.5ml，直至第28天結(jié)束。2.2檢測所有對象均在第29d行肺功能檢測。數(shù)據(jù)使用spss21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。觀察凝結(jié)芽孢桿菌對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影響，并與雙歧桿菌進(jìn)行比較。3結(jié)果與正常對照組相比較，慢性阻塞性肺疾病模型大鼠0.3秒用力呼氣容積(fev0.3)、0.3秒用力呼氣容積/用力肺活量(fev0.3/fvc)、峰流速(pef)均顯著減少(p＜0.01)，提示大鼠氣道不完全堵塞，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。與慢性阻塞性肺疾病模型大鼠相比，凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1207和cgmcc1.2407治療后，大鼠fev0.3、fev0.3/fvc、pef均增加(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與雙歧桿菌治療組大鼠相比，凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1207和cgmcc1.2407治療組大鼠fev0.3、fev0.3/fvc、pef均增加(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1207和cgmcc1.2407治療組之間，大鼠fev0.3、fev0.3/fvc、pef均無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。凝結(jié)芽孢桿菌對慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺功能有顯著改善作用，能顯著改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的氣流受限癥狀，并顯著高于雙歧桿菌治療組。見表1。表1不同組別大鼠肺功能變化統(tǒng)計分析組別例數(shù)fev0.3(ml)fev0.3/fvc(％)pef(ml/s)正常對照組103.38±0.2288.83±8.1926.30±1.28模型對照組102.04±0.2056.25±7.1720.63±1.32雙歧桿菌治療組102.52±0.2862.63±8.2122.92±1.30凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1207組102.96±0.3172.36±7.8525.08±1.26凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1.2407組102.89±0.2971.59±7.2525.11±1.374討論慢性阻塞性肺疾病模型組和正常對照組相比大鼠的fev0.3、fev0.3/fvc、pef均顯著減小(p＜0.01)，氣道不完全堵塞。而經(jīng)凝結(jié)芽孢桿菌治療后，大鼠的fev0.3、fev0.3/fvc、pef均顯著增加(p＜0.05)，氣流受限顯著改善，且療效顯著好于雙歧桿菌治療組。表明凝結(jié)芽孢桿菌干預(yù)能顯著減少慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的氣流受限癥狀、改善肺部功能。凝結(jié)芽孢桿菌制劑能夠有效預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病，明顯改善慢性阻塞性肺疾病癥狀，抑制慢性阻塞性肺疾病的發(fā)展進(jìn)程，且無任何毒副作用，應(yīng)用依從性好，是預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的新方法、新突破。本發(fā)明在實施過程中所使用的微生物菌種已于2004年8月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所郵編100101)保藏。分類命名：凝結(jié)芽孢桿菌bacilluscoagulans,保藏編號1207。凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmcc1207由本發(fā)明申請單位自行分離獲得，已在商業(yè)渠道銷售，并且已經(jīng)授權(quán)專利保護(hù)(專利號200410098660.4)，按照專利審查指南的規(guī)定，公眾能夠從商業(yè)渠道買到或已經(jīng)授權(quán)，不用保藏，即不用提供保藏證明，因此，本發(fā)明未提供凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmcc1207保藏證明。凝結(jié)芽孢桿菌cgmcc1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。當(dāng)前第1頁12