技術領域：
本發明屬于微生物發酵應用領域，涉及一種凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌液體、固態發酵豆類食品及其制備方法。
背景技術：
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近幾十年來，我國科學科技發展迅速，社會風貌和人民的生活水平都大幅提高，人們對均衡全面的攝入營養有了越來越清晰的認識，對食物的需求早已遠遠超出滿足生存和味蕾的范疇，保健養生的概念深入人心，且漸漸成為了一種潮流和習慣。豆類制品作為一種歷史悠久的高蛋白食物，其中所含有的植物性蛋白相比于肉類奶類中的動物性蛋白更適合于中國人的腸道，利于吸收，溫和養胃且營養全面。但是國內現有的豆制食品看似種類繁多，其實類型單一，大致可以概括為豆漿制品、各類豆干類制品和油炸制品，加工粗糙、營養利用率低且部分食品還存在安全衛生風險。
益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，將益生菌應用在食品生產中，其在營養價值、口感風味和保健作用等方面的優勢日益顯著。利用益生菌生產的各類功能性產品已成為當今研究的熱點，廣為人民喜愛和接受。
凝結芽孢桿菌是乳酸菌的一種，兼性厭氧。除了具有乳酸菌的所有特點外，還具有抗逆性強、耐高溫、易儲存等生物學特性。凝結芽孢桿菌在食品中的利用其實有著悠久的歷史，早在1972年，日本厚生省(mhlw)就證實b.coagulans可用于處方箋，同時凝結芽孢桿菌也被美國藥品食品管理局(fda)認定為安全有效的可食用益生菌，是目前效果最為確切的一類益生菌。中國國家衛生計生委發布2016年第6號《關于發酵乳桿菌cect5716等3個菌種的公告》中寫明：將凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)列入《可用于食品的菌種名單》。該菌種口服進入消化系統后，會消耗游離氧進行腸道繁殖，從而有利于厭氧微生物乳酸菌和雙歧桿菌的生長，調節腸道內微生物菌群的平衡，提高機體的免疫力和抗病力，減少腸道疾病的發生。同時該菌在腸道繁殖的過程中還會分泌淀粉酶和蛋白酶，促進機體對營養物質的消化和吸收；其產生的b族維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸等物質能增加小腸的蠕動速度，從而改善腸道的消化功能，其大量產生的抑制有害菌的凝固素(coagulin)和l-乳酸等抑菌物質可以有效抑制多種腸道有害菌的繁殖，調節腸道酸堿平衡，對胃腸道炎癥有一定的治療作用。
納豆芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌，適宜在中性或偏酸性環境中生存，其在胃酸下4h存活率為100％，同時具有強力的病原菌抑制能力，是各類益菌中對環境耐受力最好的菌種之一。利用納豆芽孢桿菌制作的食品，可抵抗胃酸等物質的殺滅作用，進入小腸，改變人體腸道菌叢生態，調節腸道菌群，幫助消化道機能正常化，同時增強細胞免疫反應。納豆芽孢桿菌次生代謝產物中含有多種抑菌物質，比如桿菌肽、多粘菌素等，對食品中常見的污染菌和致病菌具有很強的抑菌效果。
利用納豆芽孢桿菌單菌發酵的納豆已經成為現代人成熟的保健食品，但是由于納豆芽孢桿菌發酵期間產生的臭氨味，納豆在中國市場的推廣存在著極大的阻力。而凝結芽孢桿菌在發酵過程中恰好可以利用氨類物質，利用凝結芽孢菌和納豆芽孢桿菌混合發酵工藝一方面保留了原料豆類中的一些活性成分，如多糖、膳食纖維、生物類黃酮等對機體有保健作用的物質，同時產生特色風味物質，很好地祛除了納豆的特殊氨味和豆類食品存在的豆腥味，在保留產品原有營養成分的基礎上改善產品的口味，使其口感更好、更易被人體吸收，促進消化、調理腸道。同時混菌發酵由于兩種菌種的相互促進作用，可以使最終產物獲得更高的益生菌數量與菌體活性，其產生的有益物質也高于單菌發酵的食品，而且混菌發酵具有不易染雜菌、穩定性高的特征，使得發酵生產在工藝控制上更簡便易行。
技術實現要素：
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本發明屬于功能性食品領域，目的在于利用凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌對豆類進行發酵獲得一種益生菌功能性食品。
為了實現上述目的，本發明提供一種凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵豆類液態飲料，是以大豆和黑豆中的至少一種，或大豆和黑豆中的至少一種混合其他豆類作為發酵基質，采用凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌進行液態發酵后獲得活菌型益生菌發酵豆類液體飲料；
進一步地，經加熱滅活處理即得到的芽孢型益生菌發酵豆類液體飲料；
進一步地，所述液態飲料制備方法如下：
菌種活化：凝結芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基裝液量為20％，ph自然，培養溫度為36-38℃，220r/min，培養19-20h后，按10％的接種量再次轉接入活化培養基進行二次活化，活化時間20-22h后得二級種子液；
液態發酵培養：將納豆芽孢桿菌二級種子液接入液態發酵培養基中進行通氣有氧發酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min))，36-38℃下發酵12-24h后，向發酵罐中接種凝結芽孢桿菌二級種子液，36-38℃下不通氣發酵12-24h；
發酵液處理：發酵結束后即獲得活菌型益生菌混菌發酵豆類液體飲料；增加加熱滅活的過程后，獲得的即為芽孢型益生菌發酵豆類液態飲料；
所述活化培養基為：將黃豆、黑豆單獨或任意比例混合清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次；121℃，20min進行滅菌；
所述液態發酵培養基為：按活化培養基中黃豆與黑豆的比例進行混合，并加入總豆質量0-60％的其他豆類清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次；121℃，20min進行滅菌；
所述液態發酵中，凝結芽孢桿菌的接種量為106-108cfu/ml；
所述液態發酵中，納豆芽孢菌的接種量為106-108cfu/ml；
優選的，所述液態發酵中凝結芽孢桿菌的接種量為1×107cfu/ml；
優選的，所述液態發酵中納豆芽孢桿菌的接種量為1×107cfu/ml；
優選的，所述液態發酵的培養溫度為37℃；
優選的，所述液態混菌發酵時間為納豆芽孢桿菌發酵19h，凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌混合發酵24；
優選的，加熱滅活條件為90℃、10min。
為了實現上述目的，本發明還提供一種凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵豆類固體食品，是以大豆和黑豆中的至少一種，或大豆和黑豆中的至少一種混合其他豆類作為發酵基質，采用凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌進行固態發酵后，干燥處理即得到益生菌發酵豆類固體食品；
制備步驟如下：
菌種活化：凝結芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基裝液量為20％，220r/min，ph自然，培養溫度為36-38℃，培養時間19-20h，作為種子液；
固態發酵培養：將納豆芽孢桿菌種子液接入固態發酵培養基中，用8層紗布封口，培養箱鼓風，風速0.3m/s，進行有氧靜置發酵，36-38℃下固態發酵12-24h后，接種凝結芽孢桿菌種子液，36-38℃下無氧靜置固態發酵12-24h即得益生菌發酵豆類固態食品；
發酵結束后可直接包裝食用，也可真空冷凍干燥，制成口感更佳的保健食品；
所述活化培養基為：將黃豆和黑豆中的至少一種清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌；
所述固態發酵培養基為：按活化培養基中黃豆與黑豆的比例進行混合，并加入總豆質量0-60％的其他豆類清洗后,按料水比1：1-1.5(質量體積比)進行混合，4℃下浸泡8-10h制得，121℃滅菌20min；
所述固態發酵中，凝結芽孢桿菌的接種量為106-108cfu/g；
所述固態發酵中，納豆芽孢桿菌的接種量為106-108cfu/g；
優選的，所述固態發酵中凝結芽孢桿菌的接種量為5×107cfu/g；
優選的，所述固態發酵中納豆芽孢桿菌的接種量為5×107cfu/g；
優選的，所述固態發酵的培養溫度為37℃；
優選的，所述固態混菌發酵時間為納豆芽孢桿菌發酵24h，凝結芽孢桿菌與納豆芽孢桿菌混合發酵24h；
優選的，所述固態發酵真空冷凍干燥條件為-70℃預凍6h后進行真空冷凍干燥24h，至含水量不大于5％。
有益效果：
1、本發明采用豆類作為原料生產凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵的益生菌食品。經過益生菌發酵的豆類產品可以產生多種酸類小分子物質如l-乳酸，同時分解豆類中不易消化的成分，這賦予產品特有的酸香味、色澤和口感，使得食品的感官特征得到改善，凝結芽孢桿菌可以祛除納豆臭氨味和豆腥味。同時，多種酸類小分子物質、呈香呈味物質的存在賦予了發酵食品良好的口感，乳酸等同時也是優質的防腐劑，所以發酵得到的原味型固體食品和液體飲料都無需再添加各類調味劑和防腐劑成分。
2、經益生菌凝結芽孢桿菌發酵后的豆類食品中活性成分含量顯著提高，總黃酮和總酚類物質含量顯著提高，如大豆苷元、染料木素、生育酚、皂甙等，這些物質具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，有抑制不飽和脂肪酸的能力，可以防止異丙基苯過氧化物導致的人體內皮細胞的細胞損傷，可以強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，防止動脈硬化和血栓的形成，預防心血管疾病、改善骨質疏松及預防癌癥；同時對肥胖癥也有相當的有益作用；納豆菌產生的堿性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂酶、彈性蛋白酶、植酸酶等多種酶系、發酵大豆中的低聚糖和纖維素等活性物質和凝結素可以幫助改善腸道微生態環境、促進腸道消化吸收功能，具有調整腸道功能幫助消化的強大功效；納豆芽孢桿菌發酵產生的納豆激酶具有溶栓作用，同時還可以促進維生素k2的吸收，大大提高人體對鈣離子的吸收，維持骨吸收和骨形成的平衡作用，防止骨質疏松，具有多種保健功效，經常食用可以很大程度上改善人體健康，預防疾病。
3、采用混菌發酵的豆類食品不僅口感和營養成分優于單菌發酵，凝結芽孢桿菌在繁殖過程中可以利用氨作為氮源，消耗掉了傳統納豆生產過程中產生的氨氣，使得產品沒有了傳統納豆的臭氨味和豆類食品的豆腥味，氨氣釋放量低于10mg/kg；同時其活菌數也高于單菌發酵的產品。經過納豆芽孢桿菌發酵之后，培養基中氧氣含量降低，極大地提高了凝結芽孢桿菌的芽孢產量，使得活菌型食品擁有了更好的穩定性，更多活的益生菌進入人體腸道。經過加熱滅活處理的發酵食品中，沒有了菌體形態的活菌，使得產品具有更長的保質期限，同時保留的益生菌芽孢在進入人體腸道后會重新萌發為有益健康的腸道益生菌，幫助改善腸道環境，助力機體健康。
具體實施方式：
下面結合具體實施方式對本發明作進一步的描述，但本發明并不限于以下具體實施例子。
實施例1一種凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌液態發酵豆類飲料
(1)最佳接種量的確定
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：
組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；
活化培養基為：按上述各豆類組合中的黃豆、黑豆比例取黃豆和黑豆混合清洗，即組合1為100％黃豆；組合2為100％黑豆；組合3為50％黃豆+50％黑豆；組合4為100％黃豆；組合5為100％黑豆；組合6為50％黃豆+50％黑豆；每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
發酵培養基為：將選中的組合豆類清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h，按10％的接種量再次轉接入活化培養基，同樣條件進行二次活化，活化時間20h后得二級種子液；
將納豆芽孢桿菌二級種子液接入液態發酵培養基中進行通氣有氧發酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min))，37℃下發酵19h后，接入凝結芽孢桿菌二級種子液，37℃下無氧發酵24h。發酵結束后，即獲得活菌型凝結芽孢桿菌發酵豆類液體飲料。
接菌量分別為：
1.凝結芽孢桿菌5×106cfu/ml，納豆芽孢桿菌5×106cfu/ml；
2.凝結芽孢桿菌1×107cfu/ml，納豆芽孢桿菌1×107cfu/ml；
3.凝結芽孢桿菌5×107cfu/ml，納豆芽孢桿菌5×107cfu/ml；
4.凝結芽孢桿菌1×108cfu/ml，納豆芽孢桿菌1×108cfu/ml；
發酵結束后對所得益生菌食品中的益生菌總活菌數進行檢測。
表1豆類發酵飲料中凝結芽孢桿菌活菌及芽孢數
表2豆類發酵飲料中納豆芽孢桿菌活菌數
結果如表1、表2所示，豆類液體發酵飲料中，幾種不同組合進行發酵，菌體接種量為凝結芽孢桿菌1×107cfu/g，納豆芽孢桿菌1×107cfu/g時，兩種益生菌的活菌數達到最高，此時組合2活菌數達到了凝結芽孢桿菌活菌1.43×109cfu/g，芽孢1.24×109cfu/g，納豆芽孢桿菌活菌1.45×109cfu/g，芽孢1.17×109cfu/g。
(2)最佳發酵培養時間
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
活化培養基為：取黃豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
發酵培養基為：將黃豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h，按10％的接種量再次轉接入活化培養基,同等條件進行二次活化，活化時間20h后得二級種子液；
將納豆芽孢桿菌二級種子液接入液態發酵培養基中進行通氣有氧發酵，通氣量1∶0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min))37℃下發酵后,接種凝結芽孢桿菌二級種子液，37℃下無氧發酵。發酵時間為1.納豆芽孢桿菌16h，接入凝結芽孢桿菌后混菌發酵20h；
2.納豆芽孢桿菌19h，接入凝結芽孢桿菌后混菌發酵20h；
3.納豆芽孢桿菌16h，接入凝結芽孢桿菌后混菌發酵24h；
4.納豆芽孢桿菌19h，接入凝結芽孢桿菌后混菌發酵24h。
發酵結束后，即獲得活菌型凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵豆類液體飲料。
表3液態發酵豆類飲料中凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌的活菌數
結果為：凝結芽孢桿菌發酵豆類食品最佳培養時間為納豆芽孢桿菌19h，接入凝結芽孢桿菌后混菌發酵24h，測得凝結芽孢桿菌總活菌數為1.50×109cfu/g，納豆芽孢桿菌活菌數為7.93×108cfu/g。
(3)液體發酵前后活性成分變化
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養基為：按照上述豆類組合中黃豆和黑豆的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
發酵培養基為：按上述豆類組合選中豆類清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h，按10％的接種量再次轉接入活化培養基進行二次活化，活化時間20h后得二級種子液；
按1×107cfu/ml，將納豆芽孢桿菌二級種子液接入液態發酵培養基中進行通氣有氧發酵，通氣量1∶0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min))37℃下發酵19h后，按1×107cfu/ml接種凝結芽孢桿菌二級種子液，37℃下無氧發酵24h。
發酵結束后，即獲得活菌型凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵豆類液體飲料。
部分產品90℃滅菌10min得滅菌型產品；
利用gb/t23788-2009法測定大豆異黃酮含量；利用gb/t12143.2-89法測定氨基態氮的含量；利用高效氣相法測定乳酸含量；利用福林酚反應測定總酚類含量；利用活氧指數法(orac)測定抗氧化物含量；利用纖維蛋白平板法測定納豆激酶的活性。
表4液態發酵食品中活性物質的測定
從圖表中可以看出，發酵產物中活性物質如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質、總酚類和氨基態氮等物質的含量顯著增加，這些物質具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，并可防止動脈硬化和血栓的形成，極大地有利于機體的健康。
(4)液體混菌發酵飲料氨氣釋放量與傳統發酵納豆氨氣釋放量的對比
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養基為：按照上述豆類組合中的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
發酵培養基為：將選中豆類清洗后，每100ml水中添加5g等量混合后的豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，121℃，20min進行滅菌。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h，按10％的接種量再次轉接入活化培養基進行二次活化，活化時間20h后得二級種子液；
按1×107cfu/ml，將納豆芽孢桿菌二級種子液接入液態發酵培養基中進行通氣有氧發酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min)，37℃下發酵19h后，按1×107cfu/ml接種凝結芽孢桿菌二級種子，37℃下無氧發酵24h。發酵結束后，即獲得活菌型凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵豆類液體飲料。
采用上述相同的發酵方法方法，將納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h，按10％的接種量再次轉接入活化培養基進行二次活化，活化時間20h后得二級種子液；
按1×107cfu/ml，將二級納豆芽孢桿菌種子液接入液態發酵培養基中進行通氣有氧發酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min),37℃下發酵19h后，繼續無氧發酵24h。發酵結束后，即獲得單菌發酵液體狀態納豆飲品，與混菌發酵進行對照。
利用揮發性鹽基氮的方法測定混菌發酵豆類飲料與單菌發酵納豆飲品中的氨，即臭氨味來源，進行對比。
表5液體混菌發酵飲料氨氣釋放量與傳統發酵納豆氨氣釋放量的對比
綜上可以看出，經凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵后的豆類液體飲料，菌體接種量為凝結芽孢桿菌1×107cfu/g，納豆芽孢桿菌1×107cfu/g時，活菌數達到最高，凝結芽孢桿菌活菌1.43×109cfu/g，芽孢1.24×109cfu/g，納豆芽孢桿菌活菌1.45×109cfu/g，芽孢1.17×109cfu/g；且發酵產物中活性物質如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質、總酚類、納豆激酶和氨基態氮等物質的含量顯著增加，這些物質具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，并可防止動脈硬化和血栓的形成。活菌型飲料還具有調節腸道菌群，優化腸道微生態的功效，而滅菌型的飲料具有保質期更長，儲存穩定性更好的特點；同時混菌發酵液態飲料幾乎不含有構成臭氨味的氨氣，口感舒適，利于市場的推廣。
實施例2一種凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌液態發酵豆類食品
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌枯草為枯草芽孢桿菌亞種(bacillussubtilissubsp.subtilis)，cgmcc菌種編號為1.2163。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)，cgmcc菌種編號為1.2407。
活化培養基為：取黃豆和黑豆等質量混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
發酵培養基為：按黃豆30％，黑豆30％，其他豆類40％的比例取豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次；其他豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合，121℃，20min進行滅菌。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為36℃，培養時間20h，按10％的接種量再次轉接入活化培養基同等條件進行二次活化，活化時間22h后得二級種子液；
按照1×107cfu/ml，將二級納豆芽孢桿菌種子液接入液態發酵培養基中通氣有氧發酵12h，38℃，通氣量1：0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min))，之后接種凝結芽孢桿菌二級種子液，接種量1×107cfu/ml，36℃下無氧發酵12h；
發酵結束后，即獲得活菌型凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵豆類液體飲料。
測定所得飲料氨氣釋放量，即臭氨味來源，用同樣方法制備納豆芽孢桿菌單菌發酵液體飲品，并進行對照。
納豆芽孢桿菌單菌發酵液體飲品方法為：納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為36℃，培養時間20h，按10％的接種量再次轉接入活化培養基同等條件進行二次活化，活化時間22h后得二級種子液；
按照1×107cfu/ml，將納豆芽孢桿菌二級種子液接入液態發酵培養基中通氣有氧發酵12h，38℃，通氣量1：0.3(以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(v/v·min))，之后36℃下無氧發酵12h；
利用揮發性鹽基氮的方法測定產品中的氨。
表6混菌發酵豆類飲料氨氣釋放量與傳統發酵單菌發酵氨氣釋放量的對比
實施例3凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌固態發酵豆類食品工藝
(1)最佳接種量
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養基為：按上述豆類組合中的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，20min進行滅菌。
固態發酵培養基為：將選中的豆類組合混合清洗后,按料水比1：1.5(質量體積比)進行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h得種子液；
將納豆芽孢桿菌種子液接入固態發酵培養基中，用8層紗布封口放置在培養箱中，鼓風進行風速：0.3m/s，有氧發酵，37℃下發酵24h后接種凝結芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發酵24h。發酵結束后，即獲得活菌型凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵豆類固態食品。
接菌量分別為：1.凝結芽孢桿菌5×106cfu/g，納豆芽孢桿菌5×106cfu/g；
2.凝結芽孢桿菌1×107cfu/g，納豆芽孢桿菌1×107cfu/g；
3.凝結芽孢桿菌5×107cfu/g，納豆芽孢桿菌5×107cfu/g；
4.凝結芽孢桿菌1×108cfu/g，納豆芽孢桿菌1×108cfu/g；
發酵后，對所得益生菌固態食品中的益生菌菌總活菌數進行檢測。
表7豆類發酵食品中凝結芽孢桿菌總活菌及芽孢數
表8豆類發酵食品中納豆芽孢桿菌總活菌及芽孢數
結果如表7、8所示，豆類固態發酵食品中，幾種不同組合進行發酵，菌體接種量為凝結芽孢桿菌5×107cfu/g，納豆芽孢桿菌5×107cfu/g時，活菌數達到最高，且雖然各組合活菌數有小幅度差異但都達到了較高的9次方，其中組合1活菌數達到了凝結芽孢桿菌4.37×109cfu/g，納豆芽孢桿菌4.23×109cfu/g。
(2)固體發酵最佳培養時間
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
活化培養基為：取黃豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，20min進行滅菌。
固態培養基為：將黃豆按料水比1：1.5(質量體積比)進行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h得種子液；
按5×107cfu/g，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發酵培養基中，用8層紗布封口放置在培養箱中，鼓風風速：0.3m/s，進行有氧發酵，37℃下發酵一段時間后，按5×107cfu/g接種凝結芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發酵。
發酵結束后，即獲得活菌型發酵豆類食品。
發酵時間為1.納豆芽孢桿菌19h，接凝結芽孢桿菌后混菌發酵20h；
2.納豆芽孢桿菌24h，接凝結芽孢桿菌后混菌發酵20h；
3.納豆芽孢桿菌19h，接凝結芽孢桿菌后混菌發酵24h；
4.納豆芽孢桿菌24h，接凝結芽孢桿菌后混菌發酵24h。
發酵結束后，分別對固態發酵后的產物進行活菌計數。
表9固態發酵豆類食品中凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌的活菌數
結果為：混合益生菌發酵豆類食品最佳培養時間為納豆芽孢桿菌24h，凝結芽孢桿菌24h，測得凝結芽孢桿菌總活菌數為1.04×1010cfu/g，納豆芽孢桿菌總活菌數7.98×109cfu/g。
(3)固體發酵前后活性成分變化
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養基為：按上述豆類組合中黃豆和黑豆的比例混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，20min進行滅菌。
固態培養基為：將選中的豆類組合混合清洗后,按料水比1：1.5(質量體積比)進行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h得種子液；
按5×107cfu/g，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發酵培養基中，用8層紗布封口放置在培養箱中，鼓風風速：0.3m/s，進行有氧發酵，37℃下發酵24h后，按5×107cfu/g接種凝結芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發酵24h。
發酵結束后，即獲得活菌型發酵豆類食品。測定固態發酵物中各活性成分含量的變化。
將固態發酵產物-70℃預凍6h后進行真空冷凍干燥24h，至含水量不大于5％得凝結豆類固態發酵食品。
利用gb/t23788-2009法測定大豆異黃酮含量；利用gb/t12143.2-89法測定氨基態氮的含量；利用高效氣相法測定乳酸含量；利用福林酚反應測定總酚類含量；利用活氧指數法(orac)測定抗氧化物含量；利用纖維蛋白平板法測定納豆激酶的活性。
表10固態發酵食品中活性物質的測定
從圖表中可以看出，發酵產物中活性物質如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質、總酚類、納豆激酶和氨基態氮等物質的含量顯著增加，這些物質具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，并可防止動脈硬化和血栓的形成，極大地有利于機體的健康。
(4)固態混菌發酵豆類食品中氨氣釋放量與傳統發酵納豆氨氣釋放量的對比
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號為cgmccno.4731。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養基為：按上述豆類組合中的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，20min進行滅菌。
固態培養基為：將選中的豆類組合混合清洗后,按料水比1：1.5(質量體積比)進行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為37℃，培養時間19h得種子液；
按5×107cfu/g，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發酵培養基中進行，用8層紗布封口放置在培養箱中，鼓風風速：0.3m/s，進行有氧發酵，37℃下發酵24h后，按5×107cfu/g接種凝結芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發酵24h。
發酵結束后，即獲得活菌型發酵豆類食品。將固態發酵產物-70℃預凍6h后進行真空冷凍干燥24h，至含水量不大于5％得凝結豆固態發酵食品。
其他條件均相同，僅將凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌混菌發酵改為納豆芽孢桿菌單菌發酵，發酵階段接菌量為5×107cfu/g，發酵階段總時長相同，即24h+24h＝48h；
發酵結束后，即獲得單菌發酵傳統納豆食品，與混菌發酵產品做對比。
利用揮發性鹽基氮的方法測定混菌發酵豆類食品與單菌發酵納豆中的氨，即臭氨味來源，進行對比。
表11固態發酵豆類食品氨氣釋放量與傳統發酵納豆氨氣釋放量的對比
綜上可以看出，經凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發酵后的豆類固態食品，菌體接種量為凝結芽孢桿菌5×107cfu/g，納豆芽孢桿菌5×107cfu/g時，活菌數達到最高，達到了凝結芽孢桿菌4.37×109cfu/g，納豆芽孢桿菌4.23×109cfu/g；且發酵產物中活性物質如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質、總酚類和氨基態氮等物質的含量都有所增加，對人體有著極大的益處；混菌發酵的豆類食品與傳統納豆相比，沒有了令人不愉快的特殊氨味，使人們更容易接受，利于市場的推廣；同時固態食品，不論是真空包裝的濕豆還是經干燥加工的干豆食品，都具有加工操作簡單、成本低、儲藏和運輸等特點，有利于降低成本。
實施例4一種凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌固態發酵豆類食品
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌枯草為枯草芽孢桿菌亞種(bacillussubtilissubsp.subtilis)，cgmcc菌種編號為1.2163。
所選用凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌(bacilluscoagulans)，cgmcc菌種編號為1.2407。
活化培養基為：取等量黃豆和黑豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質，均質溫度65℃、壓力20.0mpa，均質一次，121℃，20min進行滅菌。
固態培養基為：按黃豆30％，黑豆30％，其他豆類40％的比例取豆清洗后，將豆子按料水比1：1(質量體積比)進行混合，4℃下浸泡10h，121℃滅菌20min；其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；
凝結芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發，按接種量1％分別接入活化培養基進行活化，活化培養基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養溫度為36℃，培養時間20h得種子液；
按5×107cfu/g的接種量，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發酵培養基中用8層紗布封口放置在培養箱中，鼓風風速：0.3m/s，進行有氧發酵，36℃下發酵12h后，按5×107cfu/g接種凝結芽孢桿菌種子液進行混菌發酵，38℃下無氧發酵12h。發酵結束后，即獲得活菌型發酵豆類食品。
其他條件均相同，僅將凝結芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌混菌發酵改為納豆芽孢桿菌單菌發酵，發酵階段接菌量為5×107cfu/g，發酵階段總時長相同，即12h+12h＝24h；
發酵結束后，即獲得單菌發酵傳統納豆食品，測定所得發酵豆類食品氨氣釋放量，即臭氨味來源，與混菌發酵產品做對比。
利用揮發性鹽基氮的方法測定氨。
表13混菌發酵豆類食品氨氣釋放量與傳統單菌發酵納豆氨氣釋放量的對比
上述參照實施例對該益生菌發酵豆類食品及其制備方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。